小鼠肺损伤的诱导,通过博霉素内切注射

摘要

在这里,我们提出了一种有效的方法,以研究静脉注射人类中发性血质细胞的抗纤维化活性,从整个脐带获得后,通过在C57BL的内切治疗注射注射肺损伤/6 小鼠。该协议可以很容易地扩展到其他疗法的临床前测试。

摘要

肺纤维化是几种人类肺病的标志,病因不同。由于目前的疗法相当有限,小鼠模型仍然是开发新的抗纤维化策略的重要工具。在这里,我们提供了一种有效的方法,以研究从全脐带(hUC-MSC)获得的人类中位血质基质细胞在体内抗纤维化活性,以减轻博霉素引起的肺损伤。C57BL/6小鼠接受单次内切注射布洛霉素(1.5 U/kg体重),然后两次向尾静脉注入hUC-MSC(2.5 x 10 5),在布洛霉素给予后24小时和7天。在第8天、第14天或第21天牺牲时,将分析炎症和纤维化变化、胶原蛋白含量和hUC-MSC在外植肺组织中的存在。将小霉素注射到小鼠气管中,可直接瞄准肺部,导致广泛的肺部炎症和纤维化。双剂量hUC-MSC的系统施用导致博霉素引起的肺损伤的早期钝化。静脉注射hUC-MSC被暂时移植到小鼠肺部,在那里他们发挥抗炎和抗纤维化活性。最后,该方案已成功应用于人类肺纤维化实验小鼠模型hUC-MSC的临床前测试。然而,这种技术可以很容易地扩展,既研究不同内切施用的物质对肺部病理生理学的影响,也验证新的抗炎和抗纤维化全身疗法。

引言

肺纤维化是一种渐进的病理过程,其特点是细胞外基质成分(主要是I型胶原蛋白)在肺间质内沉积过多,导致肺功能受损。它是几种具有不同病因的人类肺部疾病的标志,是临床预后不良因素。由于目前的疗法相当有限1,小鼠模型仍然是一个重要工具,以进一步调查影响疾病发病和进展的致病机制,以及开发新的抗纤维化药物策略^2,3.

迄今为止,博洛霉素的施用一直是实验诱发肺纤维化^最常见的应用模型。除了多种分娩方法(包括静脉注射、腹管内、皮下和吸入外,宫内注射的博洛霉素已成为最常用的途径4、5。本文所描述的方法已经开发出来,以避免霉素对气管粘管的烫伤作用。事实上,通过将气管外在并通过操作显微镜进行可视化,可以实现将整个体积的博洛霉素溶液直接注入下气道,而不会在上气道中溢出。当有所需的外科专业知识和仪器可用时,此方法允许安全、可靠和可重复的诱导肺部炎症和纤维化,如下所述。

研究方案

所有动物护理和实验程序均获得意大利卫生部的批准(授权书456/2016-PR),并根据《赫尔辛基公约宣言》执行。

1. 老鼠

1. 购买后,让小鼠在注射前至少7天适应。
   注:小鼠在无病原体条件下被安置在动物设施中,在12小时光/暗循环的恒定温度和湿度下保持,并免费获得水和标准颗粒食物。
2. 使用雌性C57BL/6小鼠,在12至16周大时注射。

2. 内切治疗注射博霉素

1. 博霉素制剂
   注意:根据全球统一的化学品分类和标签制度(GHS),博洛霉素被归类为GHS08健康危害。
   1. 在化学罩下准备博洛霉素。
   2. 要获得所需的工作浓度(0.05 U/100 μL),在30 mL无菌盐水中重新悬浮15 U的冻干霉素硫酸盐。
   3. 通过反转管来小心地混合样品,以避免血栓形成。
   4. 正确标记管与重新悬浮的日期,将其储存在4°C,并在24小时内使用其内容。
   5. 在灌输之前,将博洛霉素溶液与室温平衡。
      注:在本实验中,使用单剂量1.5 U/kg体重的布洛霉素诱导C57BL/6小鼠的肺部损伤。然而,每只小鼠菌株对波洛霉素6,7有不同的敏感性。应对博霉素进行滴定,以确定用于实验的小鼠菌株中的最佳剂量。
2. 麻醉
   1. 在9 mL无菌盐水和1 mL绝对乙醇(工作浓度为20mg/mL)中溶解0.2克2,2,2-三溴二苯乙醇,准备麻醉。
   2. 通过反转管彻底混合,以避免血栓形成。
   3. 正确标记管子的制备日期,将其储存在黑暗中4°C,并在3天内使用。
   4. 每只小鼠使用1mL注射器和26G针头,用250μL的三溴二醇溶液(最终剂量为200mg/kg体重)对小鼠进行麻醉。
      注:使用此剂量,小鼠至少昏迷 20 分钟。必要时,根据小鼠反应调整剂量,与兽医协商。
   5. 监测鼠标呼吸。呼吸速率将稍微减慢。几分钟后,捏一只鼠标脚,检查踏板反射是否缺乏。
3. 内切治疗注射
   1. 在所有过程中保持无菌状态。使用无菌手术器械和材料,戴上无菌手套,避免接触任何非无菌表面。
   2. 将麻醉小鼠放在手术平台上的背上,用手术胶带细腻地固定它的腿,将其固定到位。
      注: 建议轻柔地绑住鼠标腿,以避免鼠标在旋转过程中滑离手术平台(步骤 2.3.10)。
   3. 将鼠标放在加热垫上,在整个干预过程中使直肠温度稳定在37°C。通过直肠探头测量直肠温度。
   4. 轻轻地伸出鼠标颈部,把一个"枕头",例如,牙科棉卷,在其颈椎区域下。
   5. 用剃刀轻轻剃须喉咙。
   6. 用酒精去除手术区的头发,用1%的波维酮碘溶液对小鼠皮肤进行几次消毒。
   7. 用一对解剖钳夹住皮肤,用一把环处理的弯曲钝剪刀,在小鼠肌体肌肉的对应性上做一个短切口。
      注:皮肤切口长约0.5厘米。去除的相应皮肤片非常小,不会造成鼠标颈部的张力。
   8. 用棉布棒止血。
   9. 通过钝解剖将气管外在外,从脂肪和其他组织中轻轻清洁。
   10. 旋转手术平台,将鼠标头朝向操作者定向。
       注:此位置允许操作员在注射过程中将注射器角度,使其沿着气管的自然路径直接连接到肺部。
   11. 将鼠标放在操作显微镜下,以帮助气管的可视化。调整照明并设置放大倍率(介于 1 和 1.2 之间)、对焦和锐度。气管可以很容易地区分为白色半透明管,气管环清晰可见。
   12. 通过轻轻移液将博洛霉素溶液混合,用25G针头将100μL吸进0.5 mL注射器中,避免气泡形成。
   13. 一旦气管在清晰可视化,小心刺穿它与针尖在30°的角度(图1A)。
   14. 缓慢地将100 μL的卵霉素或无菌盐水(车辆控制)直接注入气管的流明中。等待几秒钟,直到整个体积沿着针向下移动,然后从气管中取出。
   15. 观察呼吸暂停几秒钟,当针头正确插入气管时,就会发生呼吸暂停,以便鼠标立即吸入液体的整个体积。
   16. 如果鼠标未吸入液体,请仔细监测其呼吸并调整针头位置。如果鼠标停止呼吸,请立即拔下针头,让小鼠在重新插入之前恢复正常呼吸。
   17. 注射后安全丢弃注射器和针头。
   18. 用5-0可吸收缝合线关闭皮下筋膜和皮肤伤口。
       注:当未完全重新吸收时,手术后7-10天切除缝合线。
4. 动物恢复
   1. 将注入的鼠标侧放在加热垫上以进行恢复。
   2. 监测小鼠呼吸并观察鼠标,直到它开始移动并恢复胸腔回肠和全意识。
   3. 确认鼠标处于良好状态后,将其返回到原始保持架。在完全恢复之前,不要将其归还给其他动物的陪伴。
   4. 为确保长期性失气和避免任何残留的介入后疼痛,每12小时内切痛注射后给小鼠服用皮下丁丙诺啡(最终剂量为0.05mg/kg体重)。
   5. 在注射博洛霉素后,检查小鼠24小时,每天做两次。监测小鼠呼吸窘迫、体重减轻、行为异常以及任何发病迹象。

3. 人类脐带等位质细胞的尾静脉输注

1. 细胞制备
   注:人类脐带中位体细胞的分离、表征和培养,此前曾被描述为8、9、10。hUC-MSC 应无菌操作和注入;因此,在无菌罩下执行所有步骤。
   1. 将 75 cm²培养瓶中的 hUC-MSC 扩展至早期通道(最大 1⁄3)。
      注:hUC-MSC在输入小鼠的当天应为70%的汇合。
   2. 在室温下用10 mL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞。
   3. 加入2 mL的胰蛋白酶,在37°C孵育细胞约1分钟,直到它们开始分离。
   4. 加入含有10%胎儿牛血清(FBS)的8 mL hUC-MSC完整培养基,中和胰蛋白酶。
   5. 以350 x g离心收集细胞10分钟。
   6. 在无菌盐水中重新悬浮颗粒,并使用Bürker腔室计算细胞。将细胞稀释至每只小鼠200 μL无菌盐水的2.5 x 10⁵的最终浓度,为输液准备细胞悬浮液。准备过量的细胞悬浮液,以确保有足够的体积注入所有小鼠。
   7. 输注前,将细胞放在冰上。如第 3.3 节所述,在几个小时内注入。
2. 麻醉
   注:为了将注射期间损坏小鼠尾静脉的风险降至最低,小鼠不得移动。因此麻醉比简单的鼠标抑制更受欢迎。
   1. 在诱导室中用4%的胶质吸入麻醉小鼠。
   2. 监测鼠标呼吸。呼吸速率将稍微减慢。几分钟后,捏住一只老鼠的脚,检查是否进行适当的麻醉。
3. 尾静脉输液
   1. 一旦确认无意识,将小鼠置于无菌hUC-MSC静脉输注无菌罩下。
   2. 在整个实验中,通过连续流动为1.5%的异常人面膜保持全身麻醉。
   3. 为了促进血管扩张,并允许更容易注射,将小鼠尾巴浸泡在温水中2分钟。
   4. 通过轻轻移液混合细胞悬浮液,以确保细胞不会形成团块。用26G针将200μL吸气到1mL注射器中,避免气泡形成。
   5. 握住鼠标尾部的尖端,轻轻拉直鼠标。
   6. 定位鼠标尾部的侧静脉;用手术刀轻轻刮擦,并用70%乙醇擦拭。
      注:轻轻刮擦尾巴以去除毛发,使注射部位更光滑、更清洁。
   7. 从尾部的远端部分开始,以 15° 角将针头插入静脉,然后缓慢地注入 200 μL 的 hUC-MSC 或无菌盐水(车辆控制)(图 1B)。
   8. 监测静脉输液成功,液体进入静脉,没有阻力,没有外溢。等待几秒钟,直到整个体积沿着针向下移动,然后从静脉中取出。
   9. 为防止出血,请用无菌纱布对进入伤口短暂施加压力。
   10. 输液后,安全地丢弃注射器和针头。
4. 动物恢复
   1. 将注入的鼠标侧放在加热垫上以进行恢复。
   2. 监测小鼠呼吸并观察鼠标,直到它开始移动并恢复胸腔回肠和全意识。
   3. 确认鼠标处于良好状态后,将其返回到原始保持架。在完全恢复之前,不要将其归还给其他动物的陪伴。
   4. 在尾静脉输液后,每隔一天检查小鼠24小时,以监测其健康状况,并及早发现任何痛苦或病理迹象。

4. 器官外植和组织处理

1. 在博洛霉素给药(图1C)后,在第8天、第14天或第21天通过过量注射麻醉剂牺牲小鼠。
2. 切除气管和肺部,并立即在冰冷的PBS中清洗。
3. 在液氮中冷冻右肺并将其储存在-80°C,以便进行后续的分子^分析10。
4. 用4%的甲醛充气左肺,并将其固定在10%中性缓冲形式溶液中24小时;然后,在分级酒精系列中脱水,在二甲苯中清除它们,并将其嵌入石^蜡10中。

结果

肺损伤是由在100μL无菌盐水中单次注射1.5 U/kg的硫酸洋霉素体重引起的。对照动物接受相同量盐水的内切注射。两针hUC-MSC(2.5 x 10⁵在200 μL无菌盐水)注入小鼠尾静脉,24小时和7天后,博洛霉素。对照动物接受同等体积的无菌盐水的静脉注射。小鼠在博霉素给给后的第8天、第14天和第21天被牺牲用于肺外植和组织处理(图1)。

讨论

内切管管理是向肺部输送外源性药物的优先途径。几年来,将肌霉素直接注射到气管中已被广泛用于诱发肺纤维化13,最近,已经开发出更先进的非侵入性技术,以实现这14,15 ^,16.

此处描述的方法提供了一些有意义的好处,以超过一些潜在的限制。气管的注射需要手术干预,携带手术本身引起的并?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH