Induktion der Maus Lungenverletzung durch Endotracheal Injektion von Bleomycin

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine wirksame Methode zur Untersuchung der antifibrotischen Aktivität intravenös infundierter menschlicher mesenchymaler Stromalzellen vor, die nach der Induktion einer Lungenverletzung durch eine endotracheale Injektion von Bleomycin in C57BL aus der gesamten Nabelschnur gewonnen wurden. /6 Mäuse. Dieses Protokoll kann leicht auf die präklinische Prüfung anderer Therapeutika ausgedehnt werden.

Zusammenfassung

Lungenfibrose ist ein Kennzeichen mehrerer menschlicher Lungenerkrankungen mit einer anderen Ätiologie. Da die derzeitigen Therapien eher begrenzt sind, sind Mausmodelle nach wie vor ein wesentliches Werkzeug für die Entwicklung neuer antifibrotischer Strategien. Hier bieten wir eine effektive Methode zur Untersuchung der antifibrotischen In-vivo-Aktivität menschlicher mesenchymaler Stromalzellen, die aus der ganzen Nabelschnur (hUC-MSC) bei mildernden Bleomycin-induzierten Lungenverletzungen gewonnen werden. C57BL/6-Mäuse erhalten eine einmalige endotracheale Injektion von Bleomycin (1,5 U/kg Körpergewicht), gefolgt von einer doppelten Infusion von hUC-MSC (2,5 x 10⁵) in die Schwanzvene, 24 h und 7 Tage nach der Bleomycin-Verabreichung. Nach Opfern an den Tagen 8, 14 oder 21 werden entzündliche und fibrotische Veränderungen, Kollagengehalt und hUC-MSC-Präsenz im explantierten Lungengewebe analysiert. Die Injektion von Bleomycin in die Mausluftröhre ermöglicht die direkte Ausrichtung der Lunge, was zu umfangreichen Lungenentzündungen und Fibrose führt. Die systemische Verabreichung einer doppelten Dosis von hUC-MSC führt zur frühen Abstumpfung der bleomycin-induzierten Lungenverletzung. Intravenös infundierte hUC-MSC werden vorübergehend in die Mauslunge eingraviert, wo sie ihre entzündungshemmende und antifibrotische Aktivität ausüben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll erfolgreich für die präklinische Prüfung von hUC-MSC in einem experimentellen Mausmodell der menschlichen Lungenfibrose angewendet wurde. Diese Technik kann jedoch leicht erweitert werden, um sowohl die Wirkung verschiedener endotracheal verabreichter Substanzen auf die Pathophysiologie der Lunge zu untersuchen als auch neue entzündungshemmende und antifibrotische systemische Therapien zu validieren.

Einleitung

Lungenfibrose ist ein progressiver pathologischer Prozess, der sich durch die übermäßige Ablagerung von extrazellulären Matrixkomponenten, hauptsächlich Kollagen Typ I, im Lungeninterstitium auszeichnet, was zu einer eingeschränkten Lungenfunktion führt. Es ist das Kennzeichen mehrerer menschlicher Lungenerkrankungen mit einer anderen Ätiologie und stellt einen schlechten klinischen Prognosefaktor dar. Da die derzeitigen Therapien eher begrenzt sind¹, sind Mausmodelle weiterhin ein wesentliches Werkzeug sowohl für die weitere Untersuchung der pathogenen Mechanismen, die den Beginn und das Fortschreiten der Krankheit beeinflussen, als auch für die Entwicklung neuer Antifibrotikums. Strategien^2,3.

Bis heute war die Verabreichung von Bleomycin das am häufigsten angewandte Modell der experimentell induzierten Lungenfibrose⁴. Neben mehreren Liefermethoden (einschließlich intravenöser, intraperitonealer, subkutaner und inhalationsaler), intratrachealen oder endotrachealen Injektionen von Bleomycin haben sich als die am häufigsten verwendeten Routen^4,5herauskristallisiert. Die Methode, die wir hier beschreiben, wurde entwickelt, um die Verbrühungswirkung von Bleomycin auf die Trachealschleimhaut zu vermeiden. Durch die Ausgliederung der Luftröhre und ihre Visualisierung durch ein Operationsmikroskop ist es möglich, das gesamte Volumen der Bleomycinlösung direkt in die untere Atemwege zu übertragen, ohne dass die obere Atemwege verschüttet wird. Wenn das erforderliche chirurgische Know-how und die erforderliche Instrumentierung zur Verfügung stehen, ermöglicht diese Methode eine sichere, robuste und reproduzierbare Induktion von Lungenentzündungen und Fibrose, wie unten berichtet.

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Protokoll

Alle Tierpflege- und Versuchsverfahren wurden vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Genehmigung N. 456/2016-PR) und gemäß der Erklärung der Helsinki-Konventionen durchgeführt.

1. Mäuse

1. Nach dem Kauf lassen Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor der Injektion akklimatisieren.
   HINWEIS: Mäuse wurden in der Tieranlage unter pathogenfreien Bedingungen untergebracht, wurden bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit in einem 12-h-Licht-/Dunkelzyklus gehalten und erhielten freien Zugang zu Wasser und Standard-Pelletfutter.
2. Verwenden Sie weibliche C57BL/6-Mäuse und injizieren Sie sie im Alter von 12 bis 16 Wochen.

2. Endotracheale Injektion von Bleomycin

1. Bleomycin-Präparation
   VORSICHT: Basierend auf dem global harmonisierten System der Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) wird Bleomycin als GESUNDHEITSrisiko von GHS08 eingestuft.
   1. Bereiten Sie Bleomycin unter einer chemischen Haube vor.
   2. Um die gewünschte Arbeitskonzentration (0,05 U/100 l) zu erhalten, setzen Sie 15 U lyophilisiertes Bleomycinsulfat in 30 ml steriler Saline wieder auf.
   3. Mischen Sie die Probe vorsichtig, indem Sie das Rohr invertieren, um die Gerinnselbildung zu vermeiden.
   4. Beschriften Sie das Rohr ordnungsgemäß mit dem Datum der Resuspension, lagern Sie es bei 4 °C und verwenden Sie seinen Inhalt innerhalb von 24 h.
   5. Vor der Instillation die Bleomycin-Lösung auf Raumtemperatur ausdemieren.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurde eine Einzeldosis von 1,5 U/kg Körpergewicht Bleomycin verwendet, um Lungenverletzungen bei C57BL/6-Mäusen zu induzieren. Dennoch hat jede Maus-Sorte eine andere Empfindlichkeit gegenüber Bleomycin^6,7. Die Titration von Bleomycin sollte durchgeführt werden, um die optimale Dosis in der für die Experimente verwendeten Mausdehnung zu bestimmen.
2. Anästhesie
   1. Vorbereitung der Anästhesie durch Auflösung von 0,2 g 2,2,2-Tribromethanol in 9 ml steriler Salin und 1 ml absolutem Ethanol (bei einer Arbeitskonzentration von 20 mg/ml).
   2. Mischen Sie gründlich, indem Sie das Rohr invertieren, um die Gerinnselbildung zu vermeiden.
   3. Das Rohr mit dem Herstellungsdatum richtig beschriften, bei Dunkelheit bei 4 °C aufbewahren und innerhalb von 3 Tagen verwenden.
   4. Anästhetisieren Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 250 l Tribromethanollösung (in einer Enddosis von 200 mg/kg Körpergewicht) pro Maus mit einer 1 ml Spritze und einer 26 G Nadel.
      HINWEIS: Mit dieser Dosis sind die Mäuse mindestens 20 min bewusstlos. Bei Bedarf stellen Sie die Dosierung entsprechend der Mausantwort in Absprache mit dem Tierarzt ein.
   5. Überwachen Sie die Mausatmung. Die Atmungsrate wird sich leicht verlangsamen. Nach ein paar Minuten, kneifen Sie einen der Mausfüße, um den Mangel an Pedalreflex zu überprüfen.
3. Endotracheale Injektion
   1. Aseptische Bedingungen während des gesamten Verfahrens beibehalten. Verwenden Sie sterile chirurgische Instrumente und Materialien, tragen Sie sterile Handschuhe und vermeiden Sie den Kontakt mit einer nicht-sterilen Oberfläche.
   2. Legen Sie die anästhesierte Maus auf dem Rücken auf eine chirurgische Plattform und halten Sie sie an Ort und Stelle, indem Sie ihre Beine mit chirurgischen Bandstreifen fein fixieren.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, Maus während der Drehung nicht von der chirurgischen Plattform wegzurutschen (Schritt 2.3.10).
   3. Legen Sie die Maus auf die beheizte Matte, um die Rektaltemperatur während des Eingriffs stabil bei 37 °C zu halten. Messen Sie die Rektaltemperatur mit einer rektalen Sonde.
   4. Überdehnen Sie den Maushals sanft, indem Sie einen "Pillow", z. B. eine Zahnbaumwollrolle, unter den Halsbereich legen.
   5. Rasieren Sie die Kehle vorsichtig mit einer Rasierklinge.
   6. Entfernen Sie Das Haar mit Alkohol aus dem operationsischen Bereich und desinfizieren Sie die Maushaut mehrmals mit 1% Povidon-Jod-Lösung.
   7. Kneifen Sie die Haut mit einem Paar anatomischer Zange und machen Sie einen kurzen Schnitt in Korrespondenz der Maus sternohyoid Muskel, mit einem Paar Ring-griff, gekrümmte stumpfe Schere.
      HINWEIS: Der Schnitt der Haut ist etwa 0,5 cm lang. Das entsprechende Hautstück, das entfernt wird, ist so klein, dass es keine Spannung im Maushals erzeugt.
   8. Stoppen Sie die Blutung mit Wattenstielen.
   9. Äußere die Luftröhre durch stumpfe Sezieren, sanft reinigen sie von Fett und anderen Geweben.
   10. Drehen Sie die chirurgische Plattform, um die Maus mit dem Kopf in Richtung des Bedieners zu orientieren.
       HINWEIS: Diese Position ermöglicht es dem Bediener, während der Injektion die Spritze so zu winkeln, dass sie dem natürlichen Pfad der Luftröhre direkt in die Lunge folgt.
   11. Stellen Sie die Maus unter ein Operationsmikroskop, um bei der Visualisierung der Luftröhre zu helfen. Passen Sie die Beleuchtung und stellen Sie die Vergrößerung (zwischen 1 und 1,2), Fokus und Schärfe. Die Luftröhre kann leicht als weißes transluzentes Rohr unterschieden werden, und die Trachealringe sind deutlich sichtbar.
   12. Mischen Sie die Bleomycin-Lösung durch sanftepipettierende, und aspirieren Sie 100 l in eine 0,5 ml Spritze mit einer 25 G Nadel, um Blasenbildung zu vermeiden.
   13. Sobald die Luftröhre in klar visualisiert, sorgfältig punktieren Sie es mit der Nadelspitze in einem Winkel von 30° (Abbildung 1A).
   14. 100 L Bleomycin oder sterile Salin (Fahrzeugkontrolle) direkt in das Lumen der Luftröhre einfließen lassen. Warten Sie einige Sekunden, bis das gesamte Volume die Nadel hinunterfährt, und entfernen Sie sie dann aus der Luftröhre.
   15. Beobachten Sie ein paar Sekunden Apnoe, die auftritt, wenn die Nadel richtig in die Luftröhre eingeführt wird, so dass die Maus sofort das gesamte Volumen der Flüssigkeit einatmet.
   16. Wenn die Maus die Flüssigkeit nicht einatmet, überwachen Sie sorgfältig ihre Atmung und passen Sie die Nadelposition an. Wenn die Maus aufhört zu atmen, entfernen Sie sofort die Nadel und lassen Sie die Maus normal wieder atmen, bevor Sie sie wieder einsetzen.
   17. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel nach der Injektion sicher.
   18. Schließen Sie die subkutane Faszie und die Hautwunde mit einer 5-0 resorbierbaren Naht.
       HINWEIS: Wenn nicht vollständig resorbiert, entfernen Nähte 7-10 Tage nach der Operation.
4. Tiererholung
   1. Legen Sie die injizierte Maus auf ihre Seite auf ein Heizkissen für die Wiederherstellung.
   2. Überwachen Sie die Maus atmen und beobachten Sie die Maus, bis sie beginnt sich zu bewegen und wieder Sternbrust und volles Bewusstsein.
   3. Sobald bestätigt ist, dass die Maus in gutem Zustand ist, kehren Sie sie in den ursprünglichen Käfig zurück. Geben Sie es nicht an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig erholt ist.
   4. Um eine längere Analgesie zu gewährleisten und restliche postinterventionelle Schmerzen zu vermeiden, subkutan Buprenorphin (bei einer Enddosis von 0,05 mg/kg Körpergewicht) zu verabreichen, um alle 12 h postendoracheale Injektion zu mausern.
   5. Untersuchen Sie die Mäuse 24 h nach der endotrachealen Injektion von Bleomycin und tun Sie dies zweimal täglich. Überwachen Sie die Mäuse auf Atemnot, Gewichtsverlust, Verhaltensauffälligkeiten und auf Anzeichen von Morbidität.

3. Schwanzveneninfusion der menschlichen Nabelschnur mesenchymale stromale Zellen

1. Zellvorbereitung
   HINWEIS: Die Isolierung, Charakterisierung und Kultivierung von mesenchymalen Stromalzellen aus menschlicher Nabelschnur wurde zuvor beschrieben^8,9,10. hUC-MSC sollte aseptisch manipuliert und infundiert werden; führen Sie daher alle Schritte unter einer sterilen Haube aus.
   1. Erweitern Sie den hUC-MSC in 75 cm2 Kulturkolben bis zu frühen Passagen (1–3 Maximum).
      HINWEIS: Die hUC-MSC sollte am Tag ihrer Infusion in Mäuse zu 70 % konfluent sein.
   2. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) bei Raumtemperatur.
   3. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für ca. 1 min, bis sie beginnen zu lösen.
   4. Neutralisieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 8 ml hUC-MSC-Gesamtmedium, das 10% fetales Rinderserum (FBS) enthält.
   5. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 350 x g für 10 min.
   6. Das Pellet in steriler Saline aussetzen und die Zellen mit einer Bürkerkammer zählen. Bereiten Sie die Zellsuspension für die Infusion vor, indem Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von 2,5 x 10⁵ in 200 l steriler Saline pro Maus verdünnen. Bereiten Sie eine überschüssige Zellsuspension vor, um sicherzustellen, dass genügend Volumen für die Infusing aller Mäuse vorhanden ist.
   7. Halten Sie die Zellen vor der Infusion auf Eis. Infuse innerhalb weniger Stunden, wie in Abschnitt 3.3 beschrieben.
2. Anästhesie
   HINWEIS: Um das Risiko einer Beschädigung der Mausschwanzvene während der Injektion zu minimieren, darf sich die Maus nicht bewegen. Daher wurde anästhesie gegenüber einfacher Mauszurückhaltung bevorzugt.
   1. Anästhetisieren Sie die Mäuse um 4% Isofluran-Inhalation in einer Induktionskammer.
   2. Überwachen Sie die Mausatmung. Die Atmungsrate wird sich leicht verlangsamen. Nach ein paar Minuten, kneifen Sie einen der Mausfüße, um die richtige Anästhesisierung zu überprüfen.
3. Tail-Venen-Infusion
   1. Sobald die Bewusstlosigkeit bestätigt ist, legen Sie die Maus unter eine sterile Haube für die aseptische hUC-MSC intravenöse Infusion.
   2. Halten Sie die Vollnarkose während des gesamten Experiments über eine Gesichtsmaske mit einem kontinuierlichen Fluss von 1,5% Isofluran aufrecht.
   3. Um die Vasodilatation zu fördern und eine einfachere Injektion zu ermöglichen, tränken Sie den Mausschwanz in warmem Wasser für 2 min.
   4. Mischen Sie die Zellsuspension durch sanftepipettieren, um sicherzustellen, dass die Zellen keine Klumpen bilden. Aspirieren Sie 200 l in eine 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel, wodurch Blasenbildung vermieden wird.
   5. Halten Sie den Mausschwanz an der Spitze und richten Sie ihn sanft.
   6. Suchen Sie die seitliche Vene des Mausschwanzes; mit einem Skalpell vorsichtig kratzen und mit 70% Ethanol abwischen.
      HINWEIS: Sanft es wird geschabt, um das Haar zu entfernen, wodurch die Injektionsstelle glatter und sauberer wird.
   7. Ausgehend vom distalen Teil des Schwanzes, legen Sie die Nadel in die Vene in einem 15°-Winkel und langsam infundieren 200 l hUC-MSC oder sterile Kochchen (Fahrzeugsteuerung) (Abbildung 1B).
   8. Überwachen Sie die erfolgreiche intravenöse Infusion durch die Flüssigkeit, die ohne Widerstand und durch einen Mangel an Extravasation in die Vene gelangt. Warten Sie einige Sekunden, bis das gesamte Volume die Nadel hinunterfährt, und entfernen Sie sie dann aus der Vene.
   9. Um Blutungen zu verhindern, drücken Sie kurz mit einer sterilen Gaze auf die Eingangswunde.
   10. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel nach der Infusion sicher.
4. Tiererholung
   1. Legen Sie die infundierte Maus auf ihre Seite auf ein Heizkissen für die Wiederherstellung.
   2. Überwachen Sie die Maus atmen und beobachten Sie die Maus, bis sie beginnt sich zu bewegen und wieder Sternbrust und volles Bewusstsein.
   3. Sobald bestätigt ist, dass die Maus in gutem Zustand ist, kehren Sie sie in den ursprünglichen Käfig zurück. Geben Sie es nicht an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig erholt ist.
   4. Untersuchen Sie die Mäuse 24 h nach der Infusion der Schwanzvene und jeden zweiten Tag, um ihren Gesundheitszustand zu überwachen und Leiden oder pathologische Anzeichen frühzeitig zu erkennen.

4. Organexplantation und Gewebeverarbeitung

1. Opfern Sie die Mäuse an den Tagen 8, 14 oder 21 nach der Bleomycin-Verabreichung (Abbildung 1C) durch Überdosierung von injizierbarem Anästhetikum.
2. Die Luftröhre und die Lunge auswischen und sofort in eiskaltem PBS waschen.
3. Die rechte Lunge in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C für eine nachfolgende molekulare Analyse lagern¹⁰.
4. Die linke Lunge mit 4% Paraformaldehyd aufblasen und in 10% neutral gepufferter Formalinlösung für 24 h fixieren; dann dehydrieren Sie sie in abgestuften Alkoholserien, löschen Sie sie in Xylol und betten Sie sie in Paraffin¹⁰ein.

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Ergebnisse

Lungenverletzungen wurden durch eine einmalige endotracheale Injektion von 1,5 U/kg Körpergewicht von Bleomycinsulfat in 100 l steriler Salinin induziert. Kontrolltiere erhielten eine endotracheale Injektion von gleichem Volumen von Saline. Zwei Aufnahmen von hUC-MSC (2,5 x 10⁵ in 200 l steriler Salin) wurden in die Schwanzvene der Maus infundiert, 24 h und 7 Tage nach der Bleomycin-Verabreichung. Kontrolltiere erhielten eine intravenöse Infusion mit einem gleichen Volumen st...

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Diskussion

Die endotracheale Verabreichung ist der bevorzugte Weg für die Abgabe exogener Wirkstoffe in die Lunge. Seit einigen Jahren ist die direkte Injektion von Bleomycin in die Luftröhre weit verbreitet, um Lungenfibrose¹³ zu induzieren, und in jüngster Zeit wurden fortgeschrittenere, nichtinvasive Techniken entwickelt, um diese^{14,15 zu erreichen. ,16}.

Die hier beschriebene Metho...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH