Inducción de lesión pulmonar de ratón por inyección endotraqueal de bleomicina

Resumen

Aquí presentamos un método eficaz para investigar la actividad antifibrotica de las células mesenquimales humanas infundidas por vía intravenosa obtenidas de todo el cordón umbilical tras la inducción de la lesión pulmonar mediante una inyección endotraqueal de bleomicina en C57BL /6 ratones. Este protocolo se puede extender fácilmente a las pruebas preclínicas de otras terapias.

Resumen

La fibrosis pulmonar es un sello distintivo de varias enfermedades pulmonares humanas con una etiología diferente. Dado que las terapias actuales son bastante limitadas, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta esencial para desarrollar nuevas estrategias antifibroticas. Aquí proporcionamos un método eficaz para investigar la actividad antifibromática in vivo de las células estromales mesenquimales humanas obtenidas del cordón umbilical entero (hUC-MSC) en la atenuación de la lesión pulmonar inducida por bleomicina. Los ratones C57BL/6 reciben una única inyección endotraqueal de bleomicina (1,5 U/kg de peso corporal) seguida de una doble perfusión de hUC-MSC (2,5 x 10⁵) en la vena de la cola, 24 h y 7 días después de la administración de bleomicina. Tras el sacrificio en los días 8, 14 o 21, se analizan los cambios inflamatorios y fibrosos, el contenido de colágeno y la presencia de hUC-MSC en el tejido pulmonar explantado. La inyección de bleomicina en la tráquea del ratón permite la orientación directa de los pulmones, lo que conduce a una inflamación pulmonar extensa y fibrosis. La administración sistémica de una dosis doble de hUC-MSC da como resultado la contundencia temprana de la lesión pulmonar inducida por bleomicina. Los hUC-MSC infundidos por vía intravenosa se injertan transitoriamente en los pulmones del ratón, donde ejercen su actividad antiinflamatoria y antifibrotica. En conclusión, este protocolo se ha aplicado con éxito para las pruebas preclínicas de hUC-MSC en un modelo experimental de ratón de fibrosis pulmonar humana. Sin embargo, esta técnica se puede extender fácilmente tanto para estudiar el efecto de diferentes sustancias administradas endotraquealmente en la fisiopatología de los pulmones como para validar nuevas terapias sistémicas antiinflamatorias y antifibromáticas.

Introducción

La fibrosis pulmonar es un proceso patológico progresivo caracterizado por la deposición excesiva de componentes de la matriz extracelular, principalmente colágeno de tipo I, en el intersticio pulmonar, lo que conduce a una función pulmonar deteriorada. Es el sello distintivo de varias enfermedades pulmonares humanas con una etiología diferente y representa un mal factor de pronóstico clínico. Dado que las terapias actuales son bastante limitadas¹, los modelos de ratón siguen siendo una herramienta esencial tanto para la investigación ulterior de los mecanismos patógenos que influyen en la aparición y la progresión de la enfermedad como para el desarrollo de nuevos antifibrosticos estrategias^2,3.

Hasta la fecha, la administración de bleomicina ha sido el modelo más comúnmente aplicado de fibrosis pulmonar inducida experimentalmente⁴. Además de múltiples métodos de administración (incluidos los métodos de administración intravenosos, intraperitoneales, subcutáneos e inhalatológicos), las inyecciones intratraales o endotraqueales de bleomicina han surgido como las rutas más utilizadas^4,5. El método que describimos aquí se ha desarrollado para evitar el efecto escaldándose de la bleomicina en la mucosa traqueal. De hecho, al exteriorizar la tráquea y visualizarla a través de un microscopio operativo, es posible lograr la instilación de todo el volumen de solución de bleomicina directamente en las vías respiratorias inferiores sin derrames en las vías respiratorias superiores. Cuando se dispone de la experiencia quirúrgica y la instrumentación requeridas, este método permite la inducción segura, robusta y reproducible de la inflamación pulmonar y la fibrosis, como se indica a continuación.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Ministerio de Salud de Italia (autorización n. 456/2016-PR) y realizados de acuerdo con la Declaración de los convenios de Helsinki.

1. Ratones

1. Después de comprarlos, deje que los ratones se aclimaten durante al menos 7 días antes de la inyección.
   NOTA: Los ratones fueron alojados en las instalaciones animales en condiciones libres de patógenos, se mantuvieron bajo temperatura y humedad constantes en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, y se les dio acceso gratuito al agua y a los alimentos estándar de pellets.
2. Use ratones hembra C57BL/6 e inyéctelos a las 12 a 16 semanas de edad.

2. Inyección endotraqueal de bleomicina

1. Preparación de la bleomicina
   ADVERTENCIA: Sobre la base del Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (GHS), la bleomicina se clasifica como un riesgo para la salud GHS08.
   1. Prepare la bleomicina bajo una capucha química.
   2. Para obtener la concentración de trabajo deseada (0,05 U/100 l), resuspenda 15 U de sulfato de bleomicina liofilizada en 30 ml de solución salina estéril.
   3. Mezcle cuidadosamente la muestra invirtiendo el tubo para evitar la formación de coágulos.
   4. Etiquetar correctamente el tubo con la fecha de resuspensión, almacenarlo a 4 oC y utilizar su contenido en un plazo de 24 h.
   5. Antes de la insinscripción, equilibre la solución de bleomicina a temperatura ambiente.
      NOTA: En este experimento, se utilizó una dosis única de 1,5 U/kg de peso corporal de bleomicina para inducir lesiones pulmonares en ratones C57BL/6. Sin embargo, cada cepa de ratón tiene unasensibilidad diferente a la bleomicina 6,⁷. Se debe realizar la valoración de la bleomicina para determinar la dosis óptima en la cepa del ratón utilizada para los experimentos.
2. Anestesia
   1. Preparar la anestesia disolviendo 0,2 g de 2,2,2-tribromoetanol en 9 ml de solución salina estéril y 1 ml de etanol absoluto (a una concentración de trabajo de 20 mg/ml).
   2. Mezcle bien invirtiendo el tubo para evitar la formación de coágulos.
   3. Etiquetar correctamente el tubo con la fecha de preparación, almacenarlo a 4 oC en la oscuridad y utilizarlo en un plazo de 3 días.
   4. Anestetizar a los ratones con una inyección intraperitoneal de 250 ml de solución de tribromoetanol (a una dosis final de 200 mg/kg de peso corporal) por ratón, utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G.
      NOTA: Con esta dosis, los ratones están inconscientes durante al menos 20 minutos. Cuando sea necesario, ajustar la dosis de acuerdo con la respuesta del ratón, en consulta con el veterinario.
   5. Supervise la respiración del ratón. La velocidad de respiración se ralentizará ligeramente. Después de unos minutos, pellizca uno de los pies del ratón para comprobar la falta de reflejo del pedal.
3. Inyección endotraqueal
   1. Mantener condiciones asépticas durante todo el procedimiento. Utilice instrumentos y materiales quirúrgicos estériles, use guantes estériles y evite el contacto con cualquier superficie no estéril.
   2. Acuéstese el ratón anestesiado sobre su espalda sobre una plataforma quirúrgica y sosténgaslo en su lugar fijando delicadamente sus piernas con tiras quirúrgicas de cinta.
      NOTA: Se recomienda encintar suavemente las patas del ratón para evitar que el ratón se deslice lejos de la plataforma quirúrgica durante su rotación (paso 2.3.10).
   3. Coloque el ratón sobre la alfombra calentada para mantener la temperatura rectal estable a 37 oC durante toda la intervención. Mida la temperatura rectal mediante una sonda rectal.
   4. Hiperextender suavemente el cuello del ratón mediante la colocación de una "almohada", por ejemplo, un rollo de algodón dental, debajo de su región cervical.
   5. Afeitar suavemente la garganta con una cuchilla de afeitar.
   6. Retire el cabello del área quirúrgica con alcohol y desinfecte la piel del ratón varias veces con una solución de povidona-yodo al 1%.
   7. Pincha la piel con un par de fórceps anatómicos y haz una incisión corta en correspondencia del músculo esternoioides del ratón, usando un par de tijeras contundentes curvas y manejadas por anillos.
      NOTA: La incisión de la piel mide aproximadamente 0,5 cm de longitud. La pieza de piel correspondiente que se retira es tan pequeña que no creará tensión en el cuello del ratón.
   8. Detenga el sangrado con palos de lana de algodón.
   9. Exteriorizar la tráquea por disección contundente, limpiándola suavemente de la grasa y otros tejidos.
   10. Gire la plataforma quirúrgica para orientar el ratón con la cabeza hacia el operador.
       NOTA: Esta posición permite al operador, durante la inyección, inclinar la jeringa de modo que siga el camino natural de la tráquea directamente hasta los pulmones.
   11. Coloque el ratón bajo un microscopio operativo para ayudar con la visualización de la tráquea. Ajuste la iluminación y ajuste el aumento (entre 1 y 1.2), enfoque y nitidez. La tráquea se puede distinguir fácilmente como un tubo translúcido blanco, y los anillos traqueales son claramente visibles.
   12. Mezcle la solución de bleomicina pipeteando suavemente y aspire 100 l en una jeringa de 0,5 ml con una aguja de 25 G, evitando la formación de burbujas.
   13. Una vez que la tráquea se visualice claramente, perfore cuidadosamente con la punta de la aguja en un ángulo de 30o (Figura1A).
   14. Inculcar lentamente 100 s de bleomicina o solución salina estéril (control del vehículo) directamente en el lumen de la tráquea. Espere unos segundos hasta que todo el volumen se desplace por la aguja y luego retírela de la tráquea.
   15. Observe unos segundos de apnea, que ocurre cuando la aguja se inserta correctamente en la tráquea para que el ratón inhale inmediatamente todo el volumen del líquido.
   16. Si el ratón no está inhalando el líquido, controle cuidadosamente su respiración y ajuste la posición de la aguja. Si el ratón deja de respirar, retire inmediatamente la aguja y permita que el ratón vuelva a respirar normalmente antes de reinsertarla.
   17. Deseche de forma segura la jeringa y la aguja después de la inyección.
   18. Cierre la fascia subcutánea y la herida de la piel con una sutura absorbible 5-0.
       NOTA: Cuando no se reabsorba por completo, retire las suturas 7-10 días después de la cirugía.
4. Recuperación animal
   1. Coloque el ratón inyectado en su lado en una almohadilla de calentamiento para su recuperación.
   2. Monitoree la respiración del ratón y observe el ratón hasta que comience a moverse y recupere la recumbencia esternal y la plena conciencia.
   3. Una vez que se confirme que el ratón está en buenas condiciones, devuélvalo a la jaula original. No lo devuelva según la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
   4. Para garantizar una analgesia prolongada y evitar cualquier dolor postintervencional residual, administre por vía subcutánea buprenorfina (a una dosis final de 0,05 mg/kg de peso corporal) para empapelar cada 12 h después de la inyección endotraqueal.
   5. Examine los ratones durante 24 horas después de la inyección endotraqueal de bleomicina y hágalo dos veces al día. Supervise a los ratones para detectar problemas respiratorios, pérdida de peso, anomalías en el comportamiento y cualquier signo de morbilidad.

3. Infusión de vena de cola de células estromales de cordón umbilical humano

1. Preparación celular
   NOTA: El aislamiento, caracterización y cultivo de células estromales mesenquimales a partir del cordón umbilical humano se ha descrito previamente^8,9,10. hUC-MSC debe manipularse e infundirse asépticamente; por lo tanto, realizar todos los pasos bajo una campana estéril.
   1. Expanda el hUC-MSC en frascos de cultivo de 75 cm² hasta los primeros pasajes (1-3 máximo).
      NOTA: El hUC-MSC debe ser un 70% de confluente el día de su perfusión en ratones.
   2. Lave las células con 10 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
   3. Añadir 2 ml de trippsina e incubar las células a 37 oC durante aproximadamente 1 min, hasta que comiencen a separarse.
   4. Neutralizar la trippsina añadiendo 8 ml de medio completo hUC-MSC que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS).
   5. Recoger las células por centrifugación a 350 x g durante 10 min.
   6. Resuspenda el pellet en solución salina estéril y cuente las células usando una cámara de B-rker. Preparar la suspensión celular para perfusión diluyendo las células a una concentración final de 2,5 x 10⁵ en 200 ml de solución salina estéril por ratón. Prepare una suspensión de exceso de células para asegurarse de que hay suficiente volumen para infundir todos los ratones.
   7. Mantenga las células en hielo antes de la perfusión. Infundir dentro de unas horas, como se describe en la sección 3.3.
2. Anestesia
   NOTA: Para minimizar el riesgo de dañar la vena de la cola del ratón durante la inyección, el ratón no debe moverse. Por lo tanto, la anestesia se ha preferido sobre el simple reesfuerzo del ratón.
   1. Anestetizar a los ratones en un 4% de inhalación de isoflurano en una cámara de inducción.
   2. Supervise la respiración del ratón. La velocidad de respiración se ralentizará ligeramente. Después de unos minutos, pellizca uno de los pies del ratón para comprobar si hay anestesia adecuada.
3. Infusión de vena de cola
   1. Una vez confirmada la inconsciencia, coloque el ratón debajo de una capucha estéril para la perfusión intravenosa aséptica hUC-MSC.
   2. Mantener la anestesia general durante todo el experimento a través de una máscara facial con un flujo continuo de 1,5% de isoflurano.
   3. Para promover la vasodilatación y permitir una inyección más fácil, remoje la cola del ratón en agua tibia durante 2 minutos.
   4. Mezcle la suspensión celular pipeteando suavemente para asegurarse de que las células no formen grumos. Aspirar 200 l en una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G, evitando la formación de burbujas.
   5. Sostenga la cola del ratón por la punta y enderece suavemente.
   6. Localizar la vena lateral de la cola del ratón; raspar suavemente con un bisturí y limpiarlo con 70% de etanol.
      NOTA: Se realiza un raspado suave de la cola para eliminar el cabello, haciendo que el lugar de la inyección sea más suave y limpio.
   7. A partir de la parte distal de la cola, inserte la aguja en la vena en un ángulo de 15o e infunda lentamente 200 s de hUC-MSC o solución salina estéril (control del vehículo) (Figura1B).
   8. Controlar la perfusión intravenosa exitosa por el líquido que entra en la vena sin resistencia y por la falta de extravasación. Espere unos segundos hasta que todo el volumen viaje por la aguja y luego retírela de la vena.
   9. Para prevenir el sangrado, aplique brevemente presión sobre la herida de entrada con una gasa estéril.
   10. Deseche la jeringa y la aguja de forma segura después de la perfusión.
4. Recuperación animal
   1. Coloque el ratón infundido en su lado en una almohadilla de calentamiento para su recuperación.
   2. Monitoree la respiración del ratón y observe el ratón hasta que comience a moverse y recupere la recumbencia esternal y la plena conciencia.
   3. Una vez que se confirme que el ratón está en buenas condiciones, devuélvalo a la jaula original. No lo devuelva según la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
   4. Examinar los ratones durante 24 horas después de la perfusión de la vena de cola y cada dos días, para controlar su estado de salud y detectar cualquier sufrimiento o signo patológico a tiempo.

4. Explantar órganos y procesar tejidos

1. Sacrificar a los ratones en los días 8, 14 o 21 después de la administración de bleomicina (Figura1C)por sobredosis de anestésico inyectable.
2. Retusie la tráquea y los pulmones e inmediatamente lávelos en PBS helado.
3. Enganche los pulmones correctos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 oC para un análisis molecular posterior¹⁰.
4. Inflar los pulmones izquierdos con un 4% de paraformaldehído y fijarlos en una solución de formalina 10% neutra durante 24 h; luego, deshidratarlos en series de alcohol graduadas, limpiarlos en xileno e incrustarlos en parafina¹⁰.

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Resultados

La lesión pulmonar fue inducida por una única inyección endotraqueal de 1,5 U/kg de peso corporal de sulfato de bleomicina en 100 ml de solución salina estéril. Los animales de control recibieron una inyección endotraqueal de un volumen igual de salina. Se infundieron dos inyecciones de hUC-MSC (2,5 x 10⁵ en 200 ml de solución salina estéril) en la vena de la cola del ratón, 24 h y 7 días después de la administración de bleomicina. Los animales de control recibieron...

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Discusión

La administración endotraqueal es la vía preferencial para la entrega de agentes exógenos en los pulmones. Desde hace varios años, la inyección directa de bleomicina en la tráquea se ha utilizado ampliamente para inducir la fibrosis pulmonar¹³ y, recientemente, se han desarrollado técnicas no invasivas más avanzadas para lograr este^{14,15 ,16}.

El método descrito aquí ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH