Induzione di lesioni polmonari del topo da Iniezione endotracheale di Bleomycin

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo efficace per studiare l'attività antifibrotica delle cellule manomalifonde umane infuso infuso ottenuto da tutto il cordone ombelicale in seguito all'induzione della lesione polmonare da un'iniezione endotracheale di bleomycina nel C57BL /6 topi. Questo protocollo può essere facilmente esteso ai test preclinici di altre terapie.

Abstract

La fibrosi polmonare è un segno distintivo di diverse malattie polmonari umane con un'eziologia diversa. Poiché le terapie attuali sono piuttosto limitate, i modelli murini continuano ad essere uno strumento essenziale per lo sviluppo di nuove strategie antifibrotiche. Qui forniamo un metodo efficace per studiare l'attività antifibrotica in vivo delle cellule stromali mesenchymale umane ottenute da intero cordone ombelicale (hUC-MSC) nell'attenuazione della lesione polmonare indotta dalla bleomicina. I topi C57BL/6 ricevono una singola iniezione endotracheale di bleomycin (1,5 U/kg di peso corporeo) seguita da una doppia infusione di hUC-MSC (2,5 x 10⁵⁾nella vena posteriore, 24 h e 7 giorni dopo la somministrazione della bleomycina. Al sacrificio ai giorni 8, 14, o 21, vengono analizzati i cambiamenti infiammatori e fibrotici, il contenuto di collagene e la presenza di hUC-MSC nel tessuto polmonare espiantato. L'iniezione di bleomycin nella trachea del topo consente il targeting diretto dei polmoni, portando a un'estesa infiammazione polmonare e fibrosi. La somministrazione sistemica di una doppia dose di hUC-MSC provoca la rapida smussatura della lesione polmonare indotta dalla bleomicina. Intravenosamente infuso hUC-MSC sono transitoriamente intrisi nei polmoni di topo, dove esercitano la loro attività antinfiammatoria e antifibrotica. In conclusione, questo protocollo è stato applicato con successo per il test preclinico di hUC-MSC in un modello murino sperimentale di fibrosi polmonare umana. Tuttavia, questa tecnica può essere facilmente estesa sia per studiare l'effetto di diverse sostanze somministrate endotrachealmente sulla patofisiologia dei polmoni sia per convalidare nuove terapie sistemiche antinfiammatorie e antifibrotiche.

Introduzione

La fibrosi polmonare è un processo patologico progressivo caratterizzato dall'eccessiva deposizione di componenti della matrice extracellulare, principalmente collagene di tipo I, nell'interstizio polmonare, che porta a una funzione polmonare compromessa. È il segno distintivo di diverse malattie polmonari umane con un'eziologia diversa e rappresenta un fattore prognostico clinico povero. Poiché le terapie attuali sono piuttosto limitate di¹, i modelli murini continuano ad essere uno strumento essenziale sia per l'ulteriore indagine dei meccanismi patogeni che influenzano l'insorgenza e la progressione della malattia, sia per sviluppare nuovi antifibrotici strategie^2,3.

Ad oggi, la somministrazione di bleomycin è stato il modello più comunemente applicato di fibrosi polmonare indotta sperimentalmente⁴. Accanto a più metodi di fornitura (tra cui per via endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea e inalazionale), le iniezioni intratracheali o endotracheali di bleomycin sono emerse come le rotte più utilizzate^4,5. Il metodo che descriviamo qui è stato sviluppato per evitare l'effetto scottante della bleomycin sulla mucosa tracheale. L'esterno della trachea e la visualizzazione attraverso un microscopio operativo, infatti, è possibile ottenere l'instillazione dell'intero volume della soluzione di bleomycina direttamente nelle vie aeree inferiori senza fuoriuscite nelle vie aeree superiori. Quando sono disponibili le competenze chirurgiche e la strumentazione richieste, questo metodo consente l'induzione sicura, robusta e riproducibile dell'infiammazione polmonare e della fibrosi, come riportato di seguito.

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Protocollo

Tutte le cure e le procedure sperimentali per gli animali sono state approvate dal Ministero della Salute italiano (autorizzazione n. 456/2016-PR) e eseguite secondo le convenzioni della Dichiarazione di Helsinki.

1. Topi

1. Dopo averli acquisti, lasciare che i topi si acclimatino per almeno 7 giorni prima dell'iniezione.
   NOTA: I topi sono stati alloggiati nell'impianto animale in condizioni prive di agenti patogeni, sono stati mantenuti a temperatura e umidità costanti su un ciclo di luce/buio di 12 h e hanno avuto libero accesso all'acqua e al cibo pellet standard.
2. Utilizzare topi c57BL/6 femminili e iniettarli a 12-16 settimane di età.

2. Iniezione endotracheale di bleomycin

1. Preparazione Bleomycin
   AVVISO: Sulla base del sistema di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche (GHS) globalmente armonizzato, la bleomycina è classificata come pericolo per la salute GHS08.
   1. Preparare la bleomycin sotto un cappuccio chimico.
   2. Per ottenere la concentrazione di lavoro desiderata (0,05 U/100 l), risospendere 15 U di solfato di leomilina in 30 mL di salina sterile.
   3. Mescolare con cura il campione invertendo il tubo per evitare la formazione di coaguli.
   4. Etichettare correttamente il tubo con la data di sospensione, conservarlo a 4 gradi centigradi e utilizzare il suo contenuto entro 24 ore.
   5. Prima dell'instillazione, eclicazione della soluzione per la bleomycina alla temperatura ambiente.
      NOTA: In questo esperimento, una singola dose di peso corporeo di 1,5 U/kg di bleomycin è stata utilizzata per indurre lesioni polmonari nei topi C57BL/6. Tuttavia, ogni ceppo del topo ha una sensibilità diversa alla bleomycin^6,7. La titolazione della bleomycina deve essere eseguita per determinare la dose ottimale nel ceppo del topo utilizzato per gli esperimenti.
2. Anestesia
   1. Preparare l'anestesia sciogliendo 0,2 g di 2,2,2 tribromoetanolo in 9 mL di salina sterile e 1 mL di etanolo assoluto (a una concentrazione di lavoro di 20 mg/mL).
   2. Mescolare accuratamente invertendo il tubo per evitare la formazione di coaguli.
   3. Etichettare correttamente il tubo con la data di preparazione, conservarlo a 4 gradi centigradi al buio e utilizzarlo entro 3 giorni.
   4. Anestesizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 250 - L di soluzione tribromoetanolo (a una dose finale di 200 mg/kg di peso corporeo) per topo, utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 26 G.
      NOTA: Con questa dose, i topi sono incoscienti per almeno 20 min. Se necessario, regolare il dosaggio in base alla risposta del topo, in consultazione con il veterinario.
   5. Monitorare la respirazione del mouse. La frequenza respiratoria rallenterà leggermente. Dopo alcuni minuti, pizzica uno dei piedi del mouse per verificare la mancanza di riflesso del pedale.
3. Iniezione endotracheale
   1. Mantenere le condizioni asettiche durante tutta la procedura. Utilizzare strumenti e materiali chirurgici sterili, indossare guanti sterili ed evitare il contatto con qualsiasi superficie non sterile.
   2. Sdraiati sul topo anetizzato sulla schiena su una piattaforma chirurgica e tenerlo in posizione fissando delicatamente le gambe con strisce di nastro chirurgico.
      NOTA: Si consiglia di toccare delicatamente le gambe del mouse per evitare che il mouse scivoli lontano dalla piattaforma chirurgica durante la sua rotazione (passaggio 2.3.10).
   3. Posizionare il mouse su un tappetino riscaldato per mantenere la temperatura rettale stabile a 37 gradi centigradi durante l'intervento. Misurare la temperatura rettale da una sonda rettale.
   4. Iperestendere delicatamente il collo del mouse mettendo un "pillow", ad esempio, un rotolo di cotone dentale, sotto la sua regione cervicale.
   5. Rade delicatamente la gola con una lama da rasoio.
   6. Rimuovere i capelli dall'area chirurgica con alcool e disinfettare la pelle del topo più volte con 1% soluzione povidone-iodio.
   7. Pizzicare la pelle con un paio di pinze anatomiche e fare una breve incisione in corrispondenza del muscolo sternoioide del topo, utilizzando un paio di forbici smussate con manico ad anello.
      NOTA: L'incisione della pelle è di circa 0,5 cm di lunghezza. Il pezzo di pelle corrispondente che viene rimosso è così piccolo che non creerà alcuna tensione nel collo del mouse.
   8. Fermare l'emorragia con bastoncini di cotone.
   9. Esternare la trachea per dissezione smussata, pulendola delicatamente dal grasso e da altri tessuti.
   10. Ruotare la piattaforma chirurgica per orientare il mouse con la testa verso l'operatore.
       NOTA: Questa posizione consente all'operatore, durante l'iniezione, di inclinare la siringa in modo che segua il percorso naturale della trachea direttamente ai polmoni.
   11. Posizionare il mouse al microscopio operativo per facilitare la visualizzazione della trachea. Regolare l'illuminazione e impostare l'ingrandimento (tra 1 e 1,2), messa a fuoco e nitidezza. La trachea può essere facilmente distinta come un tubo bianco traslucido, e gli anelli tracheali sono chiaramente visibili.
   12. Mescolare la soluzione di bleomycin pipettando delicatamente, e aspirare 100 gradi l in una siringa da 0,5 ml con un ago da 25 G, evitando la formazione di bolle.
   13. Una volta che la trachea in chiaramente visualizzato, forarlo con attenzione con la punta dell'ago ad un angolo di 30 gradi (Figura 1A).
   14. Instillare lentamente 100 l di bleomycin o sterile salina (controllo del veicolo) direttamente nel lume della trachea. Attendere alcuni secondi fino a quando l'intero volume viaggia lungo l'ago, e quindi rimuoverlo dalla trachea.
   15. Osservare alcuni secondi di apnea, che si verifica quando l'ago è inserito correttamente nella trachea in modo che il mouse inali immediatamente l'intero volume del liquido.
   16. Se il mouse non inala il liquido, monitorarne attentamente la respirazione e regolare la posizione dell'ago. Se il mouse smette di respirare, rimuovere immediatamente l'ago e consentire al mouse di riprendere la respirazione normalmente prima di reinserirlo.
   17. Scartare in modo sicuro la siringa e l'ago dopo l'iniezione.
   18. Chiudere la fascia sottocutanea e la ferita cutanea con una sutura assorbibile 5-0.
       NOTA: Quando non completamente riassorbito, rimuovere le suture 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
4. Recupero degli animali
   1. Posizionare il mouse iniettato su un lato su una piastra di riscaldamento per il recupero.
   2. Monitorare la respirazione del topo e osservare il topo fino a quando non inizia a muoversi e riacquista recumbency sternale e piena coscienza.
   3. Una volta che è confermato che il mouse è in buone condizioni, riportarlo alla gabbia originale. Non restituirlo alla compagnia di altri animali fino a quando non è completamente recuperato.
   4. Per garantire analgesia prolungata ed evitare qualsiasi dolore post-intervenziale residuo, somministrare sottocutaneamente buprenorphine (a una dose finale di 0,05 mg/kg di peso corporeo) per toottare ogni 12 h dopo l'iniezione endotracheale.
   5. Esaminare i topi per 24 h dopo l'iniezione endotracheale di camicicina e farlo due volte al giorno. Monitorare i topi per difficoltà respiratorie, perdita di peso, anomalie di comportamento, e per qualsiasi segno di morbilità.

3. Coda infusione vena di cellule stromali del cordone ombelicale umano

1. Preparazione cellulare
   NOTA: L'isolamento, la caratterizzazione e la coltivazione di cellule stromali che simeliache dal cordone ombelicale umano è stato precedentemente descritto^8,9,10. l'hUC-MSC deve essere manipolato e infuso ausiliale; pertanto, eseguire tutti i passaggi sotto un cappuccio sterile.
   1. Espandere l'hUC-MSC in 75 cm² flaconi di coltura ai primi passaggi (1-3 massimo).
      NOTA: l'hUC-MSC deve essere confluente del 70% al giorno della loro infusione in topi.
   2. Lavare le cellule con 10 mL di salina sterile (PBS) tampone di fosfato a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere 2 mL di prove e incubare le cellule a 37 gradi centigradi per circa 1 min, fino a quando non iniziano a staccarsi.
   4. Neutralizzare la frupsina aggiungendo 8 mL di hUC-MSC mezzo completo contenente 10% siero bovino fetale (FBS).
   5. Raccogliere le cellule con centrifuga a 350 x g per 10 min.
   6. Risospendere il pellet in salina sterile e contare le cellule utilizzando una camera di Bérker. Preparare la sospensione cellulare per l'infusione diluindo le cellule ad una concentrazione finale di 2,5 x 10⁵ in 200 - L di salina sterile per topo. Preparare una sospensione cellulare in eccesso per garantire che ci sia abbastanza volume per infondere tutti i topi.
   7. Conservare le cellule sul ghiaccio prima dell'infusione. Infusione entro poche ore, come descritto nella sezione 3.3.
2. Anestesia
   NOTA: Al fine di ridurre al minimo il rischio di danneggiare la vena della coda del topo durante l'iniezione, il mouse non deve muoversi. Pertanto l'anestesia è stata preferita rispetto alla semplice contenimento del mouse.
   1. Anestesizzare i topi del 4% di inalazione isoflurane in una camera di induzione.
   2. Monitorare la respirazione del mouse. La frequenza respiratoria rallenterà leggermente. Dopo alcuni minuti, pizzica uno dei piedi del mouse per verificare la corretta anestesizzazione.
3. Infusione della vena della coda
   1. Una volta confermata l'incoscienza, posizionare il topo sotto una cappa sterile per l'infusione endovenosa hUC-MSC asettica.
   2. Mantenere l'anestesia generale durante l'esperimento tramite una maschera facciale con un flusso continuo di 1,5% isoflurane.
   3. Per promuovere la vasodilazione e consentire un'iniezione più facile, immergere la coda del topo in acqua tiepida per 2 min.
   4. Mescolare la sospensione cellulare pipettando delicatamente per assicurarsi che le cellule non formano grumi. Aspirate 200 -L in una siringa da 1 mL con un ago da 26 G, evitando la formazione di bolle.
   5. Tenere la coda del mouse per la punta e raddrizzare delicatamente.
   6. Individuare la vena laterale della coda del topo; grattale delicatamente con un bisturi e pulirlo con il 70% di etanolo.
      NOTA: Viene eseguito delicatamente raschiamento della coda per rimuovere i capelli, rendendo il sito di iniezione più liscio e pulito.
   7. Partendo dalla parte distale della coda, inserire l'ago nella vena ad un angolo di 15 gradi e infondere lentamente 200 l di hUC-MSC o salina sterile (controllo del veicolo) (Figura 1B).
   8. Monitorare l'infusione endovenosa di successo dal liquido che entra nella vena senza resistenza e da una mancanza di stravaganza. Attendere alcuni secondi fino a quando l'intero volume viaggia lungo l'ago, e quindi rimuoverlo dalla vena.
   9. Per prevenire il sanguinamento, applicare brevemente la pressione sulla ferita d'entrata con una garza sterile.
   10. Scartare in modo sicuro la siringa e l'ago dopo l'infusione.
4. Recupero degli animali
   1. Posizionare il mouse infuso su un lato su una piastra di riscaldamento per il recupero.
   2. Monitorare la respirazione del topo e osservare il topo fino a quando non inizia a muoversi e riacquista recumbency sternale e piena coscienza.
   3. Una volta che è confermato che il mouse è in buone condizioni, riportarlo alla gabbia originale. Non restituirlo alla compagnia di altri animali fino a quando non è completamente recuperato.
   4. Esaminare i topi per 24 h dopo l'infusione della vena della coda e ogni altro giorno, per monitorare il loro stato di salute e rilevare tempestivamente eventuali sofferenze o segni patologici.

4. Espianto di organi e lavorazione dei tessuti

1. Sacrificare i topi nei giorni 8, 14 o 21 dopo la somministrazione della bleomycina (Figura 1C) per sovradosaggio di anestetico iniettabile.
2. Accisa la trachea e i polmoni e lavali immediatamente in PBS ghiacciato.
3. Agganciare i polmoni giusti in azoto liquido e conservarli a -80 gradi centigradi per una successiva analisi molecolare¹⁰.
4. Gonfiare i polmoni sinistra con il 4% di paraformaldeide e fissarli in una soluzione di formalina 10% neutra-buffered per 24 h; poi, disidratarli in serie di alcol graduati, eliminarli in xilene, e incorporarli in paraffina¹⁰.

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Risultati

Lesione polmonare sono state indotte da una singola iniezione endotracheale di 1,5 U/kg di peso corporeo di sonfato per la bleomicina in 100 l di salina sterile. Gli animali di controllo hanno ricevuto un'iniezione endotracheale di pari volume di salina. Due scatti di hUC-MSC (2,5 x 10⁵ in 200 gradi l di salina sterile) sono stati infusi nella vena della coda del topo, 24 h e 7 giorni dopo la somministrazione di bleomycin. Gli animali di controllo hanno ricevuto un'infusione en...

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Discussione

La somministrazione endotrale è la via preferenziale per la consegna di agenti esogeni nei polmoni. Da diversi anni, l'iniezione diretta di bleomycin nella trachea è stata ampiamente utilizzata per indurre la fibrosi polmonare¹³ e, recentemente, sono state sviluppate tecniche non invasive più avanzate per realizzare questo^{14,15 ,16}.

Il metodo descritto di seguito offre dive...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH