Индукция мышь травмы легких эндотрахеальной инъекции Bleomycin

Резюме

Здесь мы представляем эффективный метод для исследования антифибротической активности внутривенно вливания человека мезенхимальных стромальных клеток, полученных из всего пуповины после индукции травмы легких эндотрахеальной инъекции блеомицина в C57BL /6 мышей. Этот протокол можно легко распространить на доклинические испытания других терапевтических препаратов.

Аннотация

Легочный фиброз является отличительной чертой нескольких заболеваний легких человека с другой этиологией. Поскольку нынешняя терапия довольно ограничена, мышиные модели по-прежнему являются важным инструментом для разработки новых антифиброзных стратегий. Здесь мы предоставляем эффективный метод для исследования in vivo антифиброзной активности человека мезенхимальных стромальных клеток, полученных из всего пуповины (hUC-MSC) в ослаблении bleomycin-индуцированной травмы легких. C57BL/6 мышей получают одну эндотрахеульную инъекцию блеомицина (1,5 U/kg массы тела), а затем двойной вливание hUC-MSC (2,5 х 10⁵) в хвостовой вены, 24 ч и 7 дней после введения блеомицина. При жертвоприношении в дни 8, 14 или 21, воспалительные и фиброзные изменения, содержание коллагена, и присутствие hUC-MSC в эксположив легочной ткани анализируются. Инъекции блеомицина в трахею мыши позволяет прямого ориентации легких, что приводит к обширному воспалению легких и фиброза. Системное введение двойной дозы hUC-MSC приводит к раннему притупию травмы легких, вызванной блеомицином. Внутривенно вливания hUC-MSC временно привиты в легкие мыши, где они оказывают свою противовоспалительные и противофиброзные активности. В заключение, этот протокол был успешно применен для доклинических испытаний HUC-MSC в экспериментальной мышиной модели фиброза легких человека. Тем не менее, этот метод может быть легко расширен как для изучения влияния различных эндотрачелогически вводимых веществ на патофизиологию легких и для проверки новых противовоспалительных и противофиброзных системных методов лечения.

Введение

Легочный фиброз является прогрессивным патологическим процессом, характеризующимся чрезмерным осаждением внеклеточных матричных компонентов, в основном коллагена I типа, в интерститии легких, что приводит к нарушению функции легких. Это отличительная черта нескольких заболеваний легких человека с другой этиологией и представляет собой плохой клинический прогностик фактор. Поскольку текущие методы лечения довольно ограничены¹, мыши модели продолжают быть важным инструментом как для дальнейшего исследования патогенных механизмов, влияющих на начало и прогрессирование болезни и для разработки новых антифибротических стратегии^2,3.

На сегодняшний день, введение блеомицина была наиболее часто применяемой моделью экспериментально индуцированного фиброза легких⁴. Помимо нескольких методов доставки (в том числе внутривенных, внутриперитоненных, подкожных и ингаляционных), внутричехальные или эндотрахеальные инъекции блеомицина стали наиболее часто используемыми маршрутами^4,5. Метод, который мы описываем в данном ниле был разработан, чтобы избежать обжигающий эффект блеомицина на слизистую оболочку трахеи. В самом деле, путем экстерьеризации трахеи и визуализации его через операционный микроскоп, можно достичь закапывания всего объема раствора блеомицина непосредственно в нижние дыхательные пути без каких-либо разливов в верхней дыхательной части. При наличии необходимых хирургических знаний и приборов, этот метод позволяет обеспечить безопасную, надежную и воспроизводимую индукцию воспаления легких и фиброза, как сообщалось ниже.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были одобрены Министерством здравоохранения Италии (разрешение No 456/2016-PR) и выполнены в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Мыши

1. После покупки их, позволяют мышам акклиматизироваться, по крайней мере за 7 дней до инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были размещены на животном объекте в условиях, свободных от патогенов, поддерживались при постоянной температуре и влажности на 12 ч свет / темный цикл, и получили свободный доступ к воде и стандартные продукты питания гранул.
2. Используйте самок C57BL/6 мышей и вводить их в возрасте от 12 до 16 недель.

2. Эндотрахеульная инъекция блеомицина

1. Препарат Блеомицин
   ВНИМАНИЕ: На основе глобально согласованной системы классификации и маркировки химических веществ (GHS), блеомицин классифицируется как ОПАСНОСТЬ для здоровья GHS08.
   1. Подготовка блеомицина под химическим капотом.
   2. Для получения желаемой рабочей концентрации (0,05 U/100 Л) повторно приостановите 15 U лиофилизированного блеомицина сульфата в 30 мл стерильного солья.
   3. Тщательно смешайте образец, инвертируя трубку, чтобы избежать образования тромба.
   4. Правильно пометьте трубку датой повторного подвески, храните ее при 4 градусах Цельсия и используйте ее содержимое в пределах 24 ч.
   5. Перед закапыванием уравновешивать раствор блеомицина до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, одна доза 1,5 U/kg вес тела блеомицина был использован для индуцирования травмы легких у c57BL/6 мышей. Тем не менее, каждый штамм мыши имеетразличную чувствительность к блеомицин 6,⁷. Титрация блеомицина должна быть выполнена для определения оптимальной дозы в штамме мыши, используемом для экспериментов.
2. Анестезии
   1. Подготовка анестезии путем растворения 0,2 г 2,2,2-трибромоэтанола в 9 мл стерильного солья и 1 мл абсолютного этанола (при рабочей концентрации 20 мг/мл).
   2. Тщательно перемешайте, инвертируя трубку, чтобы избежать образования тромба.
   3. Правильно пометьте трубку датой приготовления, храните ее при 4 градусах по Цельсию в темноте и используйте в течение 3 дней.
   4. Анестезия мышей с интраперитонеальной инъекции 250 л раствора трибромоэтанола (при окончательной дозе 200 мг/кг массы тела) на мышь, используя 1 мл шприца и 26 G иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этой дозой, мыши находятся в бессознательном состоянии, по крайней мере 20 мин. При необходимости отрегулируйте дозировку в соответствии с ответом мыши, в консультации с ветеринаром.
   5. Следите за дыханием мыши. Скорость дыхания немного замедлится. Через несколько минут, щепотку одной из ковриков мыши, чтобы проверить отсутствие педали рефлекс.
3. Эндотрахеял инъекция
   1. Поддержание асептических состояний во время всей процедуры. Используйте стерильные хирургические инструменты и материалы, носите стерильные перчатки и избегайте контакта с любой нестерильной поверхностью.
   2. Лягте на анестезирующую мышь на спину на хирургической платформе и удерживайте ее на месте, деликатно фиксируя ноги хирургическими полосками ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нежное лента ножки мыши рекомендуется, чтобы избежать мыши скольжения от хирургической платформы во время ее вращения (шаг 2.3.10).
   3. Поместите мышь на нагретый коврик, чтобы сохранить температуру прямой кишки стабильной на уровне 37 градусов по Цельсию на протяжении всего вмешательства. Измерьте температуру прямой кишки ректальным зондом.
   4. Аккуратно hyperextend мыши шеи, поместив "подушка", например, зубной хлопок рулон, под его шейной области.
   5. Аккуратно побрить горло лезвием бритвы.
   6. Удалить волосы из хирургической области с алкоголем и дезинфицировать кожу мыши несколько раз с 1% повид-йодраствор.
   7. Ущипните кожу парой анатомических щипцов и сделайте короткий разрез в соответствии стерногидной мышцы мыши, используя пару кольцевых, изогнутых тупых ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез кожи составляет около 0,5 см в длину. Соответствующий кусок кожи, который удаляется настолько мала, что она не создаст никакого напряжения в шее мыши.
   8. Остановите кровотечение ватными палочками.
   9. Изгоняйте трахею тупым вскрытием, аккуратно очищая ее от жира и других тканей.
   10. Поверните хирургическую платформу, чтобы сориентировать мышь головой к оператору.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это положение позволяет оператору, во время инъекции, угол шприц так, что он следует естественный путь трахеи прямо в легкие.
   11. Поместите мышь под операционный микроскоп, чтобы помочь с визуализацией трахеи. Отрегулируйте освещение и установите увеличение (между 1 и 1,2), фокус и резкость. Трахею можно легко отличить как белую полупрозрачую трубку, и кольца трахеи хорошо видны.
   12. Смешайте раствор блеомицина, аккуратно пипетка, и аспирировать 100 л в шприц 0,5 мл с иглой 25 G, избегая образования пузырьков.
   13. После того, как трахея в четко визуализированы, тщательно прокол его иглой наконечник омрачает под углом 30 "(Рисунок1A).
   14. Медленно прививайте 100 л плеомицина или стерильного солика (управление транспортным средством) непосредственно в просвет трахеи. Подождите несколько секунд, пока весь объем путешествует вниз по игле, а затем удалить его из трахеи.
   15. Обратите внимание на несколько секунд апноэ, которое возникает, когда игла правильно вставляется в трахею так, что мышь сразу же вдыхает весь объем жидкости.
   16. Если мышь не вдыхает жидкость, внимательно следите за ее дыханием и регулируйте положение иглы. Если мышь перестает дышать, немедленно удалите иглу и позвольте мыши возобновить нормальное дыхание перед ее повторной вставкой.
   17. Безопасно отбросьте шприц и иглу после инъекции.
   18. Закройте подкожную фасцию и рану кожи с 5-0 поглощаемым швом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Когда не полностью абсорбции, удалить швы 7-10 дней после операции.
4. Восстановление животных
   1. Поместите вводимые мыши на бок на грелку для восстановления.
   2. Монитор мыши дыхание и наблюдать за мышью, пока он не начинает двигаться и восстанавливает суровый recumbency и полное сознание.
   3. Как только подтвердится, что мышь находится в хорошем состоянии, верните ее в исходную клетку. Не возвращайте его в компанию других животных, пока он полностью не выздоровеет.
   4. Для обеспечения длительной обезболивающей и избежания остаточной послеинтервенционной боли, вводят подкожно бупренорфин (при окончательной дозе 0,05 мг/кг массы тела) к мышам каждые 12 ч после эндотрахеальной инъекции.
   5. Изучите мышей в течение 24 ч после эндотрахеяловой инъекции блеомицина и делать это два раза в день. Мониторинг мышей для дыхательных дистресс, потеря веса, поведение аномалии, и для любых признаков заболеваемости.

3. Вливание хвостовой вены из мезенхимальных стромальных клеток пуповины человека

1. Подготовка клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция, характеристика и культивирование мезенхимальных стромальных клеток из пуповины человека ранее были описаны^8,9,10. hUC-MSC следует асептически манипулировать и настоять; поэтому выполните все ступени под стерильным капюшоном.
   1. Расширьте hUC-MSC в 75 см² культурных колб до ранних проходов (максимум 1-3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: HUC-MSC должен быть 70% слияние в день их вливания в мышей.
   2. Вымойте клетки 10 мл стерильного фосфатно-буферного солей (PBS) при комнатной температуре.
   3. Добавьте 2 мл трипсина и инкубировать клетки при 37 градусах По Цельсию в течение примерно 1 мин, пока они не начнут отделяться.
   4. Нейтрализовать трипсин, добавив 8 мл hUC-MSC полной среды, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
   5. Соберите клетки центрифугированием при 350 х г в течение 10 мин.
   6. Отрепричить гранулы в стерильном сольном и посчитать клетки с помощью камеры Бюркера. Подготовьте суспензию клетки для инфузии, разбавляя клетки до конечной концентрации 2,5 х 10⁵ в 200 л стерильного солей на мышь. Подготовьте избыточную суспензию клетки, чтобы обеспечить достаточный объем для вливание всех мышей.
   7. Держите клетки на льду до настоя. Настоять в течение нескольких часов, как описано в разделе 3.3.
2. Анестезии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы свести к минимуму риск повреждения вены хвостмыши мыши во время инъекции мышь не должна двигаться. Поэтому анестезия была предпочтительнее, чем простой мышь сдерживания.
   1. Анестезия мышей на 4% изолюранинга в индукционной камере.
   2. Следите за дыханием мыши. Скорость дыхания немного замедлится. Через несколько минут, щепотку одной из ковриков мыши, чтобы проверить на надлежащее обезвращество.
3. Настой хвостовой вены
   1. После того, как бессознательное было подтверждено, поместите мышь под стерильный капюшон для асептического hUC-MSC внутривенного вливания.
   2. Поддержание общей анестезии на протяжении всего эксперимента с помощью маски для лица с непрерывным потоком 1,5% изофларан.
   3. Для содействия вазодилатации и обеспечить более легкий инъекции, замочите хвост мыши в теплой воде в течение 2 мин.
   4. Смешайте клеточной подвески, аккуратно pipetting, чтобы убедиться, что клетки не образуют сгустки. Аспир 200 л в шприц 1 мл с иглой 26 G, избегая образования пузырьков.
   5. Держите хвост мыши за кончик и аккуратно выпрямите его.
   6. Найдите боковую вену хвоста мыши; аккуратно соскребите его скальпелем и протрите 70% этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно соскоб хвоста выполняется для удаления волос, что делает место инъекции более гладкой и чистой.
   7. Начиная с дистальной части хвоста, вставьте иглу в вену под углом 15 "и медленно влить 200 л hUC-MSC или стерильный солен (управление транспортным средством) (Рисунок 1B).
   8. Мониторинг успешного внутривенного вливания жидкостью, попадающей в вену без сопротивления и отсутствием экстравазации. Подождите несколько секунд, пока весь объем путешествует вниз по игле, а затем удалить его из вены.
   9. Чтобы предотвратить кровотечение, кратко надавите на входную рану стерильной марлей.
   10. Безопасно отбросить шприц и иглу после настоя.
4. Восстановление животных
   1. Поместите настоятельную мышь на бок на грелку для восстановления.
   2. Монитор мыши дыхание и наблюдать за мышью, пока он не начинает двигаться и восстанавливает суровый recumbency и полное сознание.
   3. Как только подтвердится, что мышь находится в хорошем состоянии, верните ее в исходную клетку. Не возвращайте его в компанию других животных, пока он полностью не выздоровеет.
   4. Изучить мышей в течение 24 ч после вливания хвостовой вена и через день, чтобы контролировать их состояние здоровья и обнаружить любые страдания или патологические знаки рано.

4. Эксплантирование органов и обработка тканей

1. Пожертвуйте мышами в дни 8, 14 или 21 после введения блеомицина(Рисунок 1С) передозировкой инъекционных анестезии.
2. Акциз трахеи и легких и сразу же мыть их в ледяной PBS.
3. Прикрепите-заморозить правые легкие в жидком азоте и хранить их при -80 градусов по Цельсию для последующего молекулярного анализа¹⁰.
4. Надуть левые легкие с 4% параформальдегида и исправить их в 10% нейтрально-буферизированных формалина раствор для 24 ч; Затем, обезвоживать их в градуированных серии алкоголя, очистить их в ксилен, и вставлять их в парафин¹⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Травма легких была вызвана одной эндотрахельной инъекцией 1,5 U/kg массы тела bleomycin сульфата в 100 Л стерильного соления. Контрольные животные получили эндотрахеюлку инъекций равного объема соления. Два выстрела hUC-MSC (2,5 х 10⁵ в 200 л стерильного солей) были влиты в вену х...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эндотрахельное управление является преференциальным маршрутом для доставки экзогенных агентов в легкие. С нескольких лет, прямое введение bleomycin в трахею широко используется для индуцирования легочного фиброза¹³ и, в последнее время, более продвинутые, неинвазивные методы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH