Indução de lesão de pulmão de camundongo por injeção endotraqueal de bleomicina

Resumo

Aqui nós apresentamos um método eficaz para investigar a atividade antifibróticos de pilhas stromal mesenquimais humanas infundidas intravenosamente obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro que segue a indução de ferimento de pulmão por uma injeção endotraqueal da bleomicina em C57Bl /6 ratos. Este protocolo pode facilmente ser estendido ao teste pré-clínico de outras terapêuticas.

Resumo

A fibrose pulmonar é uma marca registrada de várias doenças pulmonares humanas com uma etiologia diferente. Como as terapias atuais são bastante limitadas, os modelos de mouse continuam a ser uma ferramenta essencial para o desenvolvimento de novas estratégias antifibróticas. Aqui nós fornecemos um método eficaz para investigar in vivo a atividade antifibróticos de pilhas stromal mesenquimais humanas obtidas do cabo de cordão umbilical inteiro (HUC-msc) em atenuar ferimento Bleomycin-induzido do pulmão. C57BL/6 camundongos recebem uma única injeção endotraqueal de bleomicina (1,5 U/kg de peso corporal) seguida por uma dupla infusão de hUC-MSC (2,5 x 10⁵) na veia cauda, 24 h e 7 dias após a administração de bleomicina. Em cima do sacrifício nos dias 8, 14, ou 21, as mudanças inflamatórios e fibrótica, o índice do colagénio, e a presença de HUC-msc no tecido de pulmão explantados são analisadas. A injeção de bleomicina na traqueia do camundongo permite a segmentação direta dos pulmões, levando a uma extensa inflamação pulmonar e fibrose. A administração sistemática de uma dose dobro de HUC-MSC conduz ao embotamento adiantado da lesão de pulmão Bleomycin-induzida. Intravenosamente infundido hUC-MSC são transientemente enenxertados nos pulmões do rato, onde exercem a sua atividade anti-inflamatória e antifibrótica. Em conclusão, este protocolo foi aplicado com sucesso para o teste pré-clínico de hUC-MSC em um modelo experimental do rato da fibrose pulmonaa humana. No entanto, essa técnica pode ser facilmente estendida tanto para estudar o efeito de diferentes substâncias endotraquemalmente administradas na fisiopatologia dos pulmões quanto para validar novas terapias sistêmicas anti-inflamatórias e antifibróticas.

Introdução

A fibrose pulmonar é um processo patológico progressivo caracterizado pela deposição excessiva de componentes da matriz extracelular, principalmente colágeno tipo I, no interstício pulmonar, levando a comprometimento da função pulmonar. É a indicação de diversas doenças de pulmão humanas com uma etiologia diferente e representa um fator prognóstico clínico pobre. Desde que as terapias atuais são rather limitadas¹, os modelos do rato continuam a ser uma ferramenta essencial para a investigação mais adicional dos mecanismos patogénicos que influenciam o início e a progressão da doença e para desenvolver o antifibróticos novo estratégias^2,3.

Até o momento, a administração de bleomicina tem sido o modelo mais comumente aplicado de fibrose pulmonar induzida experimentalmente⁴. Ao lado de múltiplos métodos de entrega (incluindo intravenoso, intraperitoneal, subcutâneo e inalatório), injeções intratraqueal ou endotraqueal de bleomicina emergiram como as rotas mais freqüentemente utilizadas^4,5. O método que descrevemos neste documento foi desenvolvido para evitar o efeito escaldamento da bleomicina na mucosa traqueal. De fato, exteriorizando a traquéia e visualizando-o através de um microscópio de operação, é possível alcançar a instilação de todo o volume de solução de bleomicina diretamente na via aérea inferior, sem derrames nas vias aéreas superiores. Quando a perícia cirúrgica exigida e a instrumentação estão disponíveis, este método permite a indução segura, robusta, e reprodutível da inflamação e da fibrose do pulmão, como relatado abaixo.

Protocolo

Todos os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Ministério da saúde italiano (autorização n. 456/2016-PR) e realizados de acordo com as convenções da declaração de Helsínquia.

1. os ratos

1. Depois de comprá-los, permitir que os camundongos para aclimatar por pelo menos 7 dias antes da injeção.
   Nota: camundongos foram alojados na instalação animal condições livres de patógenos, foram mantidos temperatura constante e umidade em um ciclo de luz/escuro de 12 h, e receberam acesso livre à água e alimentos padrão da pelota.
2. Use camundongos C57BL/6 fêmeas e injete-os em 12 a 16 semanas de idade.

2. injeção endotraqueal de bleomicina

1. Preparação da bleomicina
   Atenção: com base no sistema globalmente harmonizado de classificação e rotulagem de produtos químicos (GHS), a bleomicina é classificada como um risco para a saúde GHS08.
   1. Prepare a bleomicina um capuz químico.
   2. Para obter a concentração de trabalho desejada (0, 5 U/100 μL), Ressuspender 15 U de sulfato de bleomicina liofilizado em 30 mL de soro fisiológico estéril.
   3. Misture cuidadosamente a amostra invertendo o tubo para evitar a formação de coágulos.
   4. Rotule corretamente o tubo com a data do Resuspension, armazene-o em 4 ° c, e use seu índice dentro de 24 h.
   5. Antes da instilação, equilibram a solução de bleomicina para a temperatura ambiente.
      Nota: neste experimento, foi utilizada uma dose única de 1,5 U/kg de peso corporal de bleomicina para induzir lesão pulmonar em camundongos C57BL/6. No entanto, cada cepa do rato tem uma sensibilidade diferente à bleomicina^6,7. A titulação da bleomicina deve ser realizada para determinar a dose ideal na cepa do mouse usada para os experimentos.
2. Anestesia
   1. Prepare a anestesia dissolvendo 0,2 g de 2, 2, 2-tribromoetanol em 9 mL de soro fisiológico estéril e 1 mL de etanol absoluto (a uma concentração de trabalho de 20 mg/mL).
   2. Misture completamente invertendo o tubo para evitar a formação de coágulos.
   3. Rotule corretamente o tubo com a data da preparação, armazene-o em 4 ° c na escuridão, e use-o dentro de 3 dias.
   4. Anestesie os camundongos com uma injeção intraperitoneal de 250 μL de solução de tribromoetanol (com uma dose final de 200 mg/kg de peso corporal) por rato, utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G.
      Nota: com esta dose, os ratinhos estão inconscientes durante pelo menos 20 min. Quando necessário, ajuste a dosagem de acordo com a resposta do mouse, em consulta com o veterinário.
   5. Monitore a respiração do mouse. A taxa de respiração vai abrandar ligeiramente. Depois de alguns minutos, aperte um dos pés do mouse para verificar a falta de reflexo do pedal.
3. Injeção endotraqueal
   1. Manter condições assépticas durante todo o procedimento. Use instrumentos cirúrgicos estéreis e materiais, usar luvas estéreis e evitar o contato com qualquer superfície não-estéril.
   2. Deite-se o mouse anestesiado em suas costas em uma plataforma cirúrgica e segurá-lo no lugar delicadamente fixando suas pernas com tiras de fita cirúrgica.
      Nota: a gravação suave das pernas do rato é recomendada para evitar que o rato deslize para fora da plataforma cirúrgica durante a sua rotação (passo 2.3.10).
   3. Coloque o mouse sobre esteira aquecida para manter a temperatura retal estável a 37 ° c durante toda a intervenção. Medir a temperatura retal por uma sonda retal.
   4. Gentilmente hyperextend o pescoço do mouse, colocando um travesseiro, por exemplo, um rolo de algodão dental, sua região cervical.
   5. Raspar suavemente a garganta com uma lâmina de barbear.
   6. Remova o cabelo da área cirúrgica com álcool e desinfete a pele do rato diversas vezes com solução do Povidone-Iodo de 1%.
   7. Belisque a pele com um par de fórceps anatômicos e faça uma incisão curta na correspondência do músculo esterno do rato, usando um par de tesouras Blunt anel-tratadas, curvadas.
      Nota: a incisão da pele é de cerca de 0,5 cm de comprimento. A parte correspondente da pele que é removida é tão pequena que não criará nenhuma tensão no pescoço do rato.
   8. Pare o sangramento com varas de lã de algodão.
   9. Exteriorize a traquéia por dissecção sem corte, gentilmente limpá-lo de gordura e outros tecidos.
   10. Gire a plataforma cirúrgica para orientar o mouse com a cabeça em direção ao operador.
       Nota: esta posição permite que o operador, durante a injecção, para o ângulo da seringa de modo que segue o caminho natural da traquéia em linha reta para os pulmões.
   11. Coloque o mouse um microscópio de operação para ajudar com a visualização da traquéia. Ajuste a iluminação e defina a ampliação (entre 1 e 1,2), foco e nitidez. A traquéia pode ser facilmente distinguida como um tubo translúcido branco, e os anéis traqueais são claramente visíveis.
   12. Misture a solução de bleomicina introduzindo suavemente a pipetagem e Aspire 100 μL para uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 25 G, evitando a formação de bolhas.
   13. Uma vez que a traquéia em visualizado claramente, perfurá-lo com cuidado com a ponta da agulha em um ângulo de 30 ° (Figura 1a).
   14. Lentamente incutir 100 μl de bleomicina ou soro fisiológico estéril (controle do veículo) diretamente no lúmen da traquéia. Aguarde alguns segundos até que todo o volume viaja para baixo da agulha e, em seguida, removê-lo da traquéia.
   15. Observe alguns segundos de apneia, que ocorre quando a agulha é inserida corretamente na traquéia para que o mouse inspire imediatamente todo o volume do líquido.
   16. Se o rato não inalar o líquido, monitorize cuidadosamente a sua respiração e ajuste a posição da agulha. Se o mouse parar de respirar, remova imediatamente a agulha e deixe o mouse retomar a respiração normalmente antes de reinseri-lo.
   17. Elimine com segurança a seringa e a agulha após a injecção.
   18. Feche a fáscia subcutânea e a ferida cutânea com uma sutura 5-0 absorvível.
       Nota: quando não completamente reabsorvido, retire as suturas 7-10 dias após a cirurgia.
4. Recuperação de animais
   1. Coloc o rato injetado em seu lado em uma almofada de aquecimento para a recuperação.
   2. Monitore o rato respirando e observe o rato até que comece mover-se e recupere o decúbito esternal e a consciência cheia.
   3. Uma vez que é confirmado que o mouse está em boas condições, devolvê-lo para a gaiola original. Não devolvê-lo à empresa de outros animais até que tenha recuperado totalmente.
   4. Para garantir a analgesia prolongada e evitar qualquer dor pós-intervencionista residual, administrar por via subcutânea buprenorfina (em uma dose final de 0, 5 mg/kg de peso corporal) para o mouse a cada 12 h post injeção endotraqueal.
   5. Examine os camundongos por 24 h após a injeção endotraqueal de bleomicina e fazê-lo duas vezes por dia. Monitore os camundongos para desconforto respiratório, perda de peso, anormalidades do comportamento e para qualquer sinal de morbidade.

3. infusão da veia de cauda de pilhas stromal mesenquimais do cabo de cordão umbilical humano

1. Preparação de células
   Nota: a isolação, a caracterização, e o cultivo de pilhas stromal mesenquimais do cordão umbilical humano foram descritos previamente^8,9,10. hUC-MSC deve ser manipulado e infundido assepticamente; Portanto, executar todas as etapas um capuz estéril.
   1. Expandir o hUC-MSC em 75 cm² frascos de cultura para passagens iniciais (1 – 3 máximo).
      Nota: o hUC-MSC deve ser 70% confluente no dia da sua infusão em camundongos.
   2. Lave as células com 10 mL de soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) à temperatura ambiente.
   3. Adicionar 2 mL de tripsina e incubar as células a 37 ° c durante cerca de 1 min, até que comecem a desanexação.
   4. Neutralize a tripsina adicionando 8 mL de meio completo de hUC-MSC contendo 10% de soro bovino fetal (FBS).
   5. Coletar as células por centrifugação em 350 x g por 10 min.
   6. Suspender a pelota em soro fisiológico estéril e contar as células usando uma câmara de Bürker. Prepare a suspensão da célula para perfusão diluindo as células para uma concentração final de 2,5 x 10⁵ em 200 μL de soro fisiológico estéril por rato. Prepare uma suspensão de excesso de células para garantir que haja volume suficiente para a infusão de todos os camundongos.
   7. Mantenha as células no gelo antes da infusão. Inutilização dentro de algumas horas, conforme descrito na seção 3,3.
2. Anestesia
   Nota: a fim de minimizar o risco de danificar a veia da cauda do rato durante a injecção, o rato não deve mover-se. Conseqüentemente a anestesia foi preferida sobre a contenção simples do rato.
   1. Anestesie os camundongos por inalação de isoflurano a 4% em uma câmara de indução.
   2. Monitore a respiração do mouse. A taxa de respiração vai abrandar ligeiramente. Depois de alguns minutos, aperte um dos pés do mouse para verificar a anestesia adequada.
3. Infusão da veia de cauda
   1. Uma vez que a inconsciência foi confirmada, coloc o rato uma capa estéril para a infusão intravenosa asséptica de hUC-MSC.
   2. Manter a anestesia geral durante todo o experimento através de uma máscara facial com um fluxo contínuo de 1,5% isoflurano.
   3. Para promover a vasodilatação e permitir uma injeção mais fácil, mergulhe a cauda do mouse em água morna por 2 min.
   4. Misture a suspensão da célula introduzindo suavemente a pipetagem para se certificar de que as células não formam aglomeração. Aspirar 200 μL para uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G, evitando a formação de bolhas.
   5. Segure a cauda do mouse pela ponta e endireite-a suavemente.
   6. Localize a veia lateral da cauda do mouse; delicadamente raspe-o com um bisturi e limpe-o com 70% de etanol.
      Nota: delicadamente raspagem da cauda é realizada para remover o cabelo, tornando o local de injeção mais suave e mais limpo.
   7. A partir da porção distal da cauda, inserir a agulha na veia em um ângulo de 15 ° e inutilizar lentamente 200 μL de hUC-MSC ou soro fisiológico estéril (controle do veículo) (Figura 1b).
   8. Monitore a infusão intravenosa bem sucedida pelo líquido que entra na veia sem resistência e por uma falta do extravasação. Aguarde alguns segundos até que todo o volume Viaje pela agulha e, em seguida, retire-o da veia.
   9. Para evitar hemorragias, aplique brevemente pressão na ferida de entrada com uma gaze estéril.
   10. Elimine com segurança a seringa e a agulha após a perfusão.
4. Recuperação de animais
   1. Coloc o rato infundido em seu lado em uma almofada de aquecimento para a recuperação.
   2. Monitore o rato respirando e observe o rato até que comece mover-se e recupere o decúbito esternal e a consciência cheia.
   3. Uma vez que é confirmado que o mouse está em boas condições, devolvê-lo para a gaiola original. Não devolvê-lo à empresa de outros animais até que tenha recuperado totalmente.
   4. Examine os camundongos para 24 h após a infusão da veia cauda e todos os dias, para monitorar o seu estado de saúde e detectar qualquer sofrimento ou sinal patológico precoce.

4. processo do explante e do tecido do órgão

1. Sacrifique os camundongos nos dias 8, 14 ou 21 após a administração de bleomicina (Figura 1C) por overdose de anestésico injetável.
2. Extirpar a traquéia e os pulmões e lave-os imediatamente na PBS gelada.
3. Encaixe-congele os pulmões direito no nitrogênio líquido e armazene-os em-80 ° c para uma análise molecular subseqüente¹⁰.
4. Inflar os pulmões esquerdos com paraformaldeído a 4% e corrigi-los em solução de formalina com tampão neutro a 10% por 24 h; em seguida, desidratá-los em séries de álcool classificados, limpe-os em xileno, e inseri-los em parafina¹⁰.

Resultados

A lesão pulmonar foi induzida por uma única injeção endotraqueal de 1,5 U/kg de peso corporal de sulfato de bleomicina em 100 μL de soro fisiológico estéril. Os animais de controle receberam uma injeção endotraqueal de um volume igual de soro fisiológico. Dois tiros de hUC-MSC (2,5 x 10⁵ em 200 μL de soro fisiológico estéril) foram infundidos na veia da cauda do camundongo, 24 h e 7 dias após a administração da bleomicina. Os animais de controlo receberam uma pe...

Discussão

A administração endotraqueal é a via preferencial para a entrega de agentes exógenos nos pulmões. Desde há vários anos, a injeção direta de bleomicina na traquéia tem sido amplamente utilizada para induzir a fibrose pulmonar¹³ e, recentemente, técnicas mais avançadas e não invasivas têm sido desenvolvidas para realizar esta^{14,15 ,16}.

O método descrito aqui forne...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH