Bleomisin endotrakeal enjeksiyon tarafından fare akciğer hasarı indüksiyon

Özet

Burada, C57BL yılında bleomisin endotrakeal enjeksiyonu ile akciğer yaralanması indüksiyonu sonrasında tüm göbek kordonundan elde edilen intravenöz infeksiyon insan mezenkimal stromal hücrelerin Antifibrotik aktivitesini araştırmak için etkili bir yöntem sunuyoruz. /6 fare. Bu protokol, diğer terapinin preklinik testine kolayca uzatılabilir.

Özet

Pulmoner fibrozis çeşitli insan akciğer hastalıklarının farklı etiyolojisinde bir damgasını taşımaktadır. Mevcut tedaviler oldukça sınırlı olduğundan, fare modelleri yeni Antifibrotik stratejiler geliştirmek için temel bir araç olmaya devam ediyor. Burada, bleomisin kaynaklı akciğer yaralanmasını zayıflatarak, tüm göbek kordonunda (hUC-MSC) elde edilen insan mezenkimal stromal hücrelerin in vivo Antifibrotik aktivitesini araştırmak için etkili bir yöntem sağlıyoruz. C57BL/6 fareler bleomisin tek bir endotrakeal enjeksiyon almak (1,5 U/kg vücut ağırlığı) bir çift infüzyon takip HUC-msc (2,5 x 10⁵) kuyruk ven içine, 24 h ve 7 gün sonra bleomisin yönetim. 8, 14 veya 21 gün içinde kurban edildikten sonra, enflamatuar ve fibrotik değişiklikler, kollajen içeriği ve açıklayıcı akciğer dokusunda hUC-MSC varlığı analiz edilir. Fare trakea içine bleomisin enjeksiyonu akciğerlerin doğrudan hedefleme sağlar, geniş pulmoner inflamasyon ve fibrozis yol. Bir çift doz HUC-msc sistemik yönetimi bleomisin kaynaklı akciğer yaralanması erken köreltme sonuçlanır. İntravenöz olarak kullanılan hUC-MSC, Anti-inflamatuar ve Antifibrotik aktivitesini yapan fare ciğerlerine kesintisiz olarak engrefindir. Sonuç olarak, bu protokol, insan pulmoner fibrozis deneysel bir fare modeli hUC-MSC preklinik test için başarıyla uygulandı. Ancak, bu teknik, akciğerlerin patofizyolojisi üzerinde farklı endotrakheally uygulanan maddelerin etkisini incelemek ve yeni anti-inflamatuar ve Antifibrotik sistemik tedaviler doğrulamak için hem de kolayca uzatılabilir.

Giriş

Pulmoner fibrozis, akciğer interstisyumunda, karaciğer fonksiyonuna yol açan, ağırlıklı olarak tip ı kollajen olan, ekstrellüler matris bileşenlerinin aşırı birikmesiyle karakterize Progressive bir patolojik süreçtir. Farklı etiyolojide çeşitli insan akciğer hastalıklarının damgasını taştı ve kötü bir klinik prognostik faktörü temsil eder. Mevcut tedaviler oldukça sınırlı olduğundan¹, fare modelleri, hastalığın başlangıcını ve ilerlemesini etkileyen ve yeni Antifibrotik gelişimi için patojenik mekanizmaların daha fazla incelenmesi için hem de önemli bir araç olmaya devam ediyor Stratejiler^2,3.

Bugüne kadar, bleomisin yönetimi deneysel olarak indüklenen pulmoner fibrozis en sık uygulanan model olmuştur⁴. Birden fazla teslim yöntemlerinin (intravenöz, intraperitoneal, subkutan ve inhalasyon dahil) yanında, bleomisin intratrakeal veya endotrakeal enjeksiyonları en sık kullanılan rotalar olarak ortaya çıkmıştır^4,5. Burada tarif ettiğimiz Yöntem, bleomisin trakeal mukoza üzerindeki haşlama etkisini önlemek için geliştirilmiştir. Aslında, trakea exteriorizing ve bir işletim mikroskop aracılığıyla görselleştirerek, üst hava yolu herhangi bir dökülme olmadan doğrudan alt havayolu içine bleomisin çözeltisi tüm hacminin instilasyon elde etmek mümkündür. Gerekli cerrahi uzmanlık ve enstrümantasyon mevcut olduğunda, bu yöntem, aşağıda bildirilen gibi, akciğer iltihabı ve fibrozis güvenli, sağlam ve tekrarlanabilir indüksiyon için izin verir.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Italyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (yetkilendirme n. 456/2016-PR) ve Helsinki beyannamesi kurallarına göre gerçekleştirildi.

1. fareler

1. Onları satın aldıktan sonra, fareler en az 7 gün enjeksiyon önce gelmesini izin.
   Not: fareler, patojen içermeyen koşullar altında hayvan tesisinde yer aldı, 12 h ışık/karanlık döngüsünde sabit sıcaklık ve nem altında tutulur ve su ve standart Pelet gıda ücretsiz erişim verildi.
2. Kadın C57BL/6 fareler kullanın ve 12 ila 16 hafta yaş onları enjekte.

2. bleomisin endotrakeal enjeksiyon

1. Bleomisin hazırlanması
   DIKKAT: kimyasalların sınıflandırılması ve etiketlenmesi ile ilgili küresel harmonize sisteme dayanarak (GHS), bleomisin GHS08 sağlık tehlikesi olarak sınıflandırılır.
   1. Bir kimyasal kaput altında bleomisin hazırlayın.
   2. İstenilen çalışma konsantrasyonunu elde etmek için (0,05 u/100 μL), 30 ml steril tuz içinde likofilize bleomisin sülfat 15 u pelletini.
   3. Pıhtısı oluşumunu önlemek için tüpü tersine çevirerek numuneyi dikkatlice karıştırın.
   4. Tüpü Resuspension tarihi ile düzgün bir şekilde etiketleyin, 4 °C ' de saklayın ve içeriği 24 saat içinde kullanın.
   5. İnstilasyon öncesinde, bleomisin solüsyonu oda sıcaklığına dengele.
      Not: Bu denemede, C57BL/6 farelerde akciğer yaralanmasına yol açması için tek doz 1,5 U/kg vücut ağırlığını kullandı. Yine de, her fare gerinim bleomisin için farklı bir duyarlılık vardır^5/6. Deney için kullanılan fare gerinim en uygun doz belirlemek için bleomisin titrasyon yapılmalıdır.
2. Anestezi
   1. 2, 2, 2-tribromoetanol 9 mL steril tuz ve 1 mL mutlak etanol (20 mg/mL çalışma konsantrasyonunda) 0,2 g çözünerek anestezi hazırlayın.
   2. Pıhtı oluşumunu önlemek için tüpün tersine çevirme ile iyice karıştırın.
   3. Tüpü hazırlık tarihi ile düzgün bir şekilde etiketleyin, karanlıkta 4 °C ' de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
   4. Bir intraperitoneal enjeksiyon ile fareler anestezize 250 μL tribromoetanol çözeltisi (son doz 200 mg/kg vücut ağırlığı) fare başına, 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanarak.
      Not: Bu doz Ile, fareler en az 20 dakika bilinçsiz. Gerektiğinde, veteriner ile danışarak, fare yanıtı göre doz ayarlayın.
   5. Fare nefes monitör. Solunum hızı biraz yavaşlatır. Birkaç dakika sonra, pedal refleks eksikliği kontrol etmek için fare ayakları bir çimdik.
3. Endotrakeal enjeksiyon
   1. Tüm prosedür sırasında aseptik koşulları koruyun. Steril Cerrahi aletler ve malzemeler kullanın, steril eldiven giyin ve steril olmayan yüzeylerle temastan kaçının.
   2. Anestezi yapan fareyi bir cerrahi platformda arkasına uzan ve bacaklarını cerrahi bant şeritleri ile incelikle sabitleyerek yerine koyun.
      Not: fare bacaklarının nazik bantlama fare rotasyon sırasında cerrahi platformdan uzağa kayar önlemek için tavsiye edilir (adım 2.3.10).
   3. Rektal sıcaklığını 37 °C ' de kararlı tutmak için fareyi ısıtmalı mat üzerine yerleştirin. Bir rektal prob ile rektal sıcaklığı ölçün.
   4. Yavaşça, örneğin, servikal bölgenin altında bir diş pamuk rulo, bir "yastık" yerleştirerek fare boyun hyperextend.
   5. Yavaşça bir jilet ile boğaz tıraş.
   6. Alkol ile cerrahi alandan saç çıkarın ve 1% povidone-iyot solüsyonu ile birkaç kez fare cildi dezenfekte.
   7. Anatomik forseps bir çift ile cilt çimdik ve fare sternohyoid kas yazışmalarda kısa kesi yapmak, halka işlenmiş bir çift kullanarak, kavisli künt makas.
      Not: cildin kesi yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda. Çıkarılan karşılık gelen cilt parçası o kadar küçük ki fare boynunda hiçbir gerginlik yaratacak.
   8. Pamuk yün çubukları ile kanamayı durdurun.
   9. Hafifçe yağ ve diğer dokulardan Temizleme, künt diseksiyonu ile trakea exteriorize.
   10. Fareyi operatöre doğru yönlendirmek için cerrahi platformu döndürün.
       Not: Bu pozisyon operatör, enjeksiyon sırasında, böylece akciğer düz trakea doğal yolunu takip şırınga açı sağlar.
   11. Trakea görselleştirme ile yardımcı olmak için bir işletim mikroskop altında fareyi yerleştirin. Aydınlatması ayarlayın ve büyütme (1 ile 1,2 arasında), odak ve netlik ayarlayın. Trakea, beyaz bir yarı saydam tüp olarak kolayca ayırt edilebilir ve trakeal halkalar açıkça görülebilir.
   12. Bleomisin çözümünü hafifçe pipetleme ile karıştırın ve 100 μL 'yi 25 G iğne ile 0,5 mL şırıngaya takın ve kabarcık oluşumunu önleme.
   13. Trakea açıkça görüntülendikten sonra, 30 ° ' lik bir açıyla iğne ucu ile dikkatlice delinmesi (Şekil 1a).
   14. Yavaşça 100 μL bleomisin veya steril tuz (araç kontrolü) doğrudan trakea lümen içine aşılamak. Tüm hacim iğne aşağı kadar birkaç saniye bekleyin ve sonra trakea çıkarın.
   15. İğne doğru trakea içine böylece fare hemen sıvı tüm hacminin nefes olacak yerleştirilir oluşur apne, birkaç saniye gözlemlemek.
   16. Fare sıvı teneffüs değilse, dikkatle nefes izlemek ve iğne konumunu ayarlayın. Fare nefes almayı durdurursa, hemen iğneyi çıkarın ve fareyi yeniden takmadan önce normal olarak nefes almaya devam etmesini sağlar.
   17. Enjeksiyonu yaptıktan sonra şırınga ve iğneyi güvenle atın.
   18. 5-0 emilebilen sütür ile subkutan fasya ve deri yara kapatın.
       Not: tamamen reabsorbe değil, dikiş 7-10 gün sonrası cerrahi çıkarın.
4. Hayvan kurtarma
   1. Kurtarma için bir Isıtma pad üzerinde yan üzerine enjekte fare yerleştirin.
   2. Fare nefes monitör ve hareket başlar ve sternal vurgulanmakla ve tam bilinç kavuşur kadar fareyi gözlemlemek.
   3. Bir kez o fare iyi durumda olduğunu teyit edilir, orijinal kafes geri dönün. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete iade etmeyin.
   4. Uzun süreli analjezi sağlamak ve herhangi bir kalıntı sonrası girişimsel ağrıyı önlemek için, subkutan buprenorfik yönetmek (son doz 0,05 mg/kg vücut ağırlığı) her 12 h sonrası endotrakeal enjeksiyon.
   5. Bleomisin endotrakeal enjeksiyon sonra 24 h için fareler inceleyin ve günde iki kez bunu. Solunum sıkıntısı, kilo kaybı, davranış anomalileri ve herhangi bir morbidite belirtisi için fareler izleyin.

3. insan göbek kordon mezenkimal stromal hücrelerin kuyruk ven infüzyon

1. Hücre hazırlığı
   Not: insan göbek kordonunda mezenkimal stromal hücrelerin yalıtım, karakterizasyonu ve ekimi daha önce^8,9,10olarak tanımlanmıştır. HUC-msc aseptik manipüle ve infemeli olmalıdır; Bu nedenle, steril bir başlık altında tüm adımları gerçekleştirin.
   1. 75 cm² kültüründe HUC-msc ' i genişletmek için erken geçişler (1 – 3 maksimum).
      Not: hUC-MSC, farelere infüzyon gününde% 70 konfluent olmalıdır.
   2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 mL steril fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın.
   3. 2 mL tripsin ekleyin ve hücreleri 37 °C ' de yaklaşık 1 dakika boyunca inküyeyin, onlar ayrılmaya başlayana kadar.
   4. % 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 8 mL hUC-MSC komple orta ekleyerek tripsin nötralize.
   5. 350 x g 'de 10 dakika santrifüjleme ile hücreleri toplayın.
   6. Steril tuz içinde Pelet resuspend ve bir BüRkEr odası kullanarak hücreleri saymak. Hücre süspansiyonu, hücreleri seyreltilerek infüzyon için hazırlamak 2,5 x 10⁵ ' te 200 μL 'de fare başına steril tuz ile son konsantrasyona kadar. Tüm farelerin bulaşması için yeterli hacim olduğundan emin olmak için aşırı hücre süspansiyonu hazırlayın.
   7. İnfüzyon öncesi buz üzerinde hücreleri tutun. 3,3 bölümünde açıklandığı gibi birkaç saat içinde infkullanım.
2. Anestezi
   Not: fare kuyruk ven enjeksiyon sırasında zarar riskini en aza indirmek için fare hareket olmamalıdır. Bu nedenle anestezi basit fare kısıtlaması üzerinden tercih edilmiştir.
   1. Bir indüksiyon odasında% 4 isofluran inhalasyonu ile fareler anestezize.
   2. Fare nefes monitör. Solunum hızı biraz yavaşlatır. Birkaç dakika sonra, doğru anestezizasyon kontrol etmek için fare feet bir çimdik.
3. Kuyruk ven infüzyon
   1. Bilinç kaybı doğrulandı sonra, aseptik hUC-MSC intravenöz infüzyon için steril bir kaput altında fareyi yerleştirin.
   2. Sürekli akış% 1,5 Isoflurane ile bir yüz maskesi ile deney boyunca genel anestezi koruyun.
   3. Vazodilatasyon teşvik ve daha kolay bir enjeksiyon için izin, 2 dakika ılık suda fare kuyruğu emmek.
   4. Hücrelerin kümeleri oluşturmayın emin olmak için hafifçe pipetleme tarafından hücre süspansiyon karıştırın. 200 μL 'yi 26 G iğneli 1 mL şırıngaya asarak kabarcık oluşumunu önleme.
   5. Fare kuyruğu ucu ile tutun ve hafifçe düzeltin.
   6. Fare kuyruğu lateral ven bulun; nazikçe bir neşter ile kazımak ve 70% etanol ile silin.
      Not: yavaşça kuyruk kazıma saç kaldırmak için yapılır, enjeksiyon site daha pürüzsüz ve temiz hale.
   7. Kuyruğun distal kısmından başlayarak, iğne 15 ° açıyla ven içine yerleştirin ve yavaşça 200 μL hUC-MSC veya steril tuz (araç kontrolü) (Şekil 1B) infkullanım.
   8. Direnç olmadan ve ekstrasasyon eksikliği ile ven giren sıvı tarafından başarılı intravenöz infüzyon izleyin. Tüm hacim iğne aşağı gider kadar birkaç saniye bekleyin ve sonra damar çıkarın.
   9. Kanama önlemek için, kısaca steril bir gazlı bez ile Giriş yarasına baskı uygulayın.
   10. İnfüzyon sonrası şırınga ve iğneyi güvenle atın.
4. Hayvan kurtarma
   1. Kurtarma için bir Isıtma pad üzerinde yan üzerine infaştı fareyi yerleştirin.
   2. Fare nefes monitör ve hareket başlar ve sternal vurgulanmakla ve tam bilinç kavuşur kadar fareyi gözlemlemek.
   3. Bir kez o fare iyi durumda olduğunu teyit edilir, orijinal kafes geri dönün. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete iade etmeyin.
   4. Kuyruk ven infüzyon ve her gün sonra 24 h için fareler inceleyin, sağlık durumlarını izlemek ve herhangi bir acı veya patolojik işareti erken tespit etmek.

4. organ eksplant ve doku işleme

1. Gün 8, 14 veya 21 bleomisin yönetimi (Şekil 1C) enjekte edilebilir anestezik aşırı doz ile sonra fareler feda.
2. Trakea ve akciğerleri çıkarın ve hemen buz gibi PBS onları yıkayın.
3. Sağ akciğerleri sıvı nitrojenlerde çırpın ve sonraki moleküler analiz için-80 °C ' de saklayın.
4. Sol akciğerleri% 4 paraformaldehit ile şişirin ve 24 h için% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi içinde düzeltin; daha sonra, kademeli alkol serisi onları susuz, ksile onları temizlemek ve parafin¹⁰embed.

Sonuçlar

Akciğer hasarı, 100 μL steril tuz içinde bleomisin sülfat 1,5 U/kg vücut ağırlığı tek bir endotrakeal enjeksiyon ile indüklenmiş. Kontrol hayvanları, eşit hacimli bir serum endotrakeal enjeksiyon aldı. HUC-MSC iki çekim (2,5 x 10⁵ ın 200 μL steril tuz) fare kuyruğu ven içine infemeli, 24 h ve 7 gün bleomisin yönetim sonra. Kontrol hayvanları eşit hacimli steril serum intravenöz infüzyon aldı. Fareler akciğer eksplant ve doku işleme için gün 8, 14...

Tartışmalar

Endotrakeal yönetim, eksojen ajanlar akciğerlere teslim etmek için tercihli bir yol. Birkaç yıl sonra, trakea içine bleomisin doğrudan enjeksiyon yaygın pulmoner fibrozis teşvik etmek için kullanılan olmuştur¹³ ve, son zamanlarda, daha gelişmiş, noninvaziv teknikler bu başarmak için geliştirilen^{14,15 ,16}.

Burada açıklanan yöntem bazı potansiyel sınırlama...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH