Induction de blessure pulmonaire de souris par injection endotrachéale de bleomycine

Résumé

Ici nous présentons une méthode efficace pour étudier l'activité antifibrotique des cellules stromal humaines infusées par voie intraveineuse injectées obtenues du cordon ombilical entier suivant l'induction des dommages de poumon par une injection endotracheal de bleomycin dans C57BL /6 souris. Ce protocole peut être facilement étendu aux tests précliniques d'autres traitements.

Résumé

La fibrose pulmonaire est une caractéristique de plusieurs maladies pulmonaires humaines avec une étiologie différente. Étant donné que les thérapies actuelles sont plutôt limitées, les modèles de souris continuent d'être un outil essentiel pour développer de nouvelles stratégies antifibrotiques. Ici nous fournissons une méthode efficace pour étudier l'activité antifibrotique in vivo des cellules stromal mésenchymales humaines obtenues du cordon ombilical entier (hUC-MSC) en atténuant des dommages pulmonaires bleomycin-induits. Les souris C57BL/6 reçoivent une seule injection endotrachéale de bléomycine (1,5 U/kg de poids corporel) suivie d'une double perfusion de hUC-MSC (2,5 x 10⁵) dans la veine de la queue, 24 h et 7 jours après l'administration de la bléomycine. Au sacrifice aux jours 8, 14, ou 21, les changements inflammatoires et fibrotiques, la teneur en collagène, et la présence de hUC-MSC dans le tissu pulmonaire explanté sont analysés. L'injection de bléomycine dans la trachée de la souris permet le ciblage direct des poumons, conduisant à une inflammation pulmonaire étendue et la fibrose. L'administration systémique d'une double dose de hUC-MSC a comme conséquence l'émoussement tôt des dommages de poumon bleomycin-induits. Le hUC-MSC infusé par voie intraveineuse est greffé transitoirement dans les poumons de la souris, où il exerce son activité anti-inflammatoire et antifibrotique. En conclusion, ce protocole a été appliqué avec succès pour l'essai préclinique de hUC-MSC dans un modèle expérimental de souris de la fibrose pulmonaire humaine. Cependant, cette technique peut être facilement étendue à la fois pour étudier l'effet de différentes substances administrées endotracheally sur la pathophysiologie des poumons et pour valider de nouvelles thérapies systémiques anti-inflammatoires et antifibrotiques.

Introduction

La fibrose pulmonaire est un processus pathologique progressif caractérisé par le dépôt excessif de composants de matrice extracellulaire, principalement le collagène de type I, dans l'interstitium pulmonaire, conduisant à une altération de la fonction pulmonaire. Il est la marque de plusieurs maladies pulmonaires humaines avec une étiologie différente et représente un facteur pronostique clinique pauvres. Étant donné que les thérapies actuelles sont plutôt limitées¹, les modèles murins continuent d'être un outil essentiel à la fois pour la poursuite de l'étude des mécanismes pathogènes influençant l'évolution de l'évolution et de la progression de la maladie et pour le développement de nouveaux antifibrotic stratégies^2,3.

Jusqu'ici, l'administration de la bleomycine a été le modèlele plus couramment appliqué de la fibrose pulmonaire expérimentalement induite 4. Outre les multiples méthodes d'accouchement (y compris les injections intraveineuses, intrapéritones, sous-cutanées et inhalantes), les injections intratrachéales ou endotrachéales de bléomycine sont apparues comme les voies les plus fréquemment utilisées^4,5. La méthode que nous décrivons ici a été développée pour éviter l'effet brûlant de la bleomycine sur la muqueuse trachéale. En fait, en extériorisant la trachée et en la visualisant à l'aide d'un microscope opératoire, il est possible d'obtenir l'instillation de tout le volume de la solution de bléomycine directement dans les voies respiratoires inférieures sans aucun déversement dans les voies respiratoires supérieures. Lorsque l'expertise chirurgicale et l'instrumentation requises sont disponibles, cette méthode permet l'induction sûre, robuste et reproductible de l'inflammation pulmonaire et de la fibrose, comme indiqué ci-dessous.

Protocole

Toutes les procédures de soins aux animaux et expérimentales ont été approuvées par le ministère italien de la Santé (autorisation n. 456/2016-PR) et effectuées conformément aux conventions de la Déclaration d'Helsinki.

1. Souris

1. Après les avoir achetés, laisser les souris s'acclimater pendant au moins 7 jours avant l'injection.
   REMARQUE : Les souris ont été logées dans l'établissement animalier dans des conditions exemptes d'agents pathogènes, ont été maintenues sous une température et une humidité constantes sur un cycle de 12 h de lumière/obscurité, et ont eu un accès gratuit à l'eau et à la nourriture standard pour granulés.
2. Utilisez des souris femelles C57BL/6 et injectez-les à l'âge de 12 à 16 semaines.

2. Injection endotrachéale de bléomycine

1. Préparation de la bléomycine
   CAUTION : D'après le Système mondial harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH), la bléomycine est classée comme un danger pour la santé du GHS08.
   1. Préparer la bléomycine sous une hotte chimique.
   2. Pour obtenir la concentration de travail désirée (0,05 U/100 L), resuspendre 15 U de sulfate de bléomycine lyophilisée dans 30 mL de salin stérile.
   3. Mélanger soigneusement l'échantillon en inversant le tube pour éviter la formation de caillots.
   4. Étiquetez correctement le tube avec la date de la suspension, stockez-le à 4 oC et utilisez son contenu dans les 24 h.
   5. Avant l'instillation, équilibrez la solution de bléomycine à la température ambiante.
      REMARQUE : Dans cette expérience, une dose simple de 1.5 U/kg poids corporel de la bleomycine a été employée pour induire des dommages de poumon dans les souris de C57BL/6. Néanmoins, chaque souche de souris a une sensibilité différente à la bléomycine^6,7. La titration de la bléomycine doit être effectuée pour déterminer la dose optimale dans la souche de souris utilisée pour les expériences.
2. Anesthésie
   1. Préparer l'anesthésie en dissolvant 0,2 g de 2,2,2-tribromoéthanol dans 9 ml de salin stérile et 1 ml d'éthanol absolu (à une concentration de travail de 20 mg/mL).
   2. Bien mélanger en inversant le tube pour éviter la formation de caillots.
   3. Étiquetez correctement le tube avec la date de préparation, rangez-le à 4 oC dans l'obscurité et utilisez-le dans les 3 jours.
   4. Anesthésiez les souris à l'aide d'une injection intrapéritonéale de 250 l de solution de tribromoéthanol (à une dose finale de 200 mg/kg de poids corporel) par souris, à l'aide d'une seringue de 1 ml et d'une aiguille de 26 G.
      REMARQUE: Avec cette dose, les souris sont inconscientes pendant au moins 20 min. Si nécessaire, ajuster la dose en fonction de la réponse de la souris, en consultation avec le vétérinaire.
   5. Surveillez la respiration de la souris. Le taux de respiration ralentira légèrement. Après quelques minutes, pincez l'un des pieds de souris pour vérifier l'absence de réflexe de pédale.
3. Injection endotrachéale
   1. Maintenir des conditions aseptiques pendant toute la procédure. Utilisez des instruments et des matériaux chirurgicaux stériles, portez des gants stériles et évitez tout contact avec une surface non stérile.
   2. Allongez la souris anesthésiée sur le dos sur une plate-forme chirurgicale et maintenez-la en place en fixant délicatement ses jambes avec des bandes de ruban adhésif chirurgical.
      REMARQUE : Il est recommandé d'enregistrer doucement les pattes de souris pour éviter que la souris ne glisse loin de la plate-forme chirurgicale pendant sa rotation (étape 2.3.10).
   3. Placer la souris sur le tapis chauffé pour maintenir la température rectale stable à 37 oC tout au long de l'intervention. Mesurer la température rectale à l'une de sessons rectales.
   4. Étendre doucement le cou de la souris en plaçant un "pillow", par exemple, un rouleau de coton dentaire, sous sa région cervicale.
   5. Raser doucement la gorge avec une lame de rasoir.
   6. Retirer les cheveux de la zone chirurgicale avec de l'alcool et désinfecter la peau de la souris à plusieurs reprises avec 1% povidone-iode solution.
   7. Pincer la peau avec une paire de forceps anatomiques et faire une courte incision dans la correspondance du muscle sternohyoid souris, en utilisant une paire de cerclé, ciseaux émoussés courbés.
      REMARQUE : L'incision de la peau est d'environ 0,5 cm de longueur. Le morceau de peau correspondant qui est enlevé est si petit qu'il ne créera aucune tension dans le cou de la souris.
   8. Arrêtez le saignement avec des bâtons de coton.
   9. Extériez la trachée par dissection émoussée, en la nettoyant délicatement à partir de graisse et d'autres tissus.
   10. Faites pivoter la plate-forme chirurgicale pour orienter la souris avec sa tête vers l'opérateur.
       REMARQUE : Cette position permet à l'opérateur, pendant l'injection, d'incliner la seringue de sorte qu'elle suive le chemin naturel de la trachée directement vers les poumons.
   11. Placez la souris sous un microscope d'opération pour aider à la visualisation de la trachée. Ajuster l'éclairage et régler le grossissement (entre 1 et 1,2), la mise au point et la netteté. La trachée peut être facilement distinguée comme un tube translucide blanc, et les anneaux trachéaux sont clairement visibles.
   12. Mélanger la solution de bléomycine en pipetilage doucement, et aspirer 100 L dans une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de 25 G, en évitant la formation de bulles.
   13. Une fois la trachée clairement visualisée, perforez soigneusement avec la pointe de l'aiguille à un angle de 30 degrés (Figure 1A).
   14. Inculquez lentement 100 l de bléomycine ou de salin stérile (contrôle du véhicule) directement dans le lumen de la trachée. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que le volume entier se déplace vers le bas de l'aiguille, puis retirez-la de la trachée.
   15. Observez quelques secondes d'apnée, qui se produit lorsque l'aiguille est correctement insérée dans la trachée de sorte que la souris inhale immédiatement tout le volume du liquide.
   16. Si la souris n'inhale pas le liquide, surveillez soigneusement sa respiration et ajustez la position de l'aiguille. Si la souris cesse de respirer, retirez immédiatement l'aiguille et laissez la souris reprendre sa respiration normalement avant de la réinsérer.
   17. Jetez en toute sécurité la seringue et l'aiguille après l'injection.
   18. Fermer le fascia sous-cutané et la plaie cutanée avec une suture absorbable 5-0.
       REMARQUE : Lorsqu'il n'est pas complètement réabsorbé, enlever les sutures 7-10 jours après la chirurgie.
4. Récupération animale
   1. Placez la souris injectée sur le côté sur un coussin chauffant pour la récupération.
   2. Surveillez la respiration de la souris et observez la souris jusqu'à ce qu'elle commence à bouger et retrouve la charge sternale et la pleine conscience.
   3. Une fois qu'il est confirmé que la souris est en bon état, retournez-la dans la cage d'origine. Ne le retournez pas à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré.
   4. Afin d'assurer une analgésie prolongée et d'éviter toute douleur post-interventionnelle résiduelle, administrez sous-cutanée ment buprénorphine (à une dose finale de 0,05 mg/kg de poids corporel) à la souris tous les 12 h après l'injection endotrachéale.
   5. Examinez les souris pendant 24 h après l'injection endotrachéale de bléomycine et faites-le deux fois par jour. Surveillez les souris pour la détresse respiratoire, la perte de poids, les anomalies de comportement, et pour tout signe de morbidité.

3. Infusion de veine de queue des cellules stromal de moelle ombilical humaines

1. Préparation cellulaire
   REMARQUE : L'isolement, la caractérisation, et la culture des cellules stromal mésenchymales du cordon ombilical humain a été précédemment décrit^8,9,10. hUC-MSC doit être aseptiquement manipulé et infusé; par conséquent, effectuer toutes les étapes sous une hotte stérile.
   1. Étendre le hUC-MSC en flacons de culture de 75 cm² jusqu'aux premiers passages (1 à 3 maximum).
      REMARQUE : Le hUC-MSC devrait être 70% confluent le jour de leur infusion dans les souris.
   2. Laver les cellules avec 10 ml de saline stérile tamponnée par phosphate (PBS) à température ambiante.
   3. Ajouter 2 ml de trypsine et incuber les cellules à 37 oC pendant environ 1 min, jusqu'à ce qu'elles commencent à se détacher.
   4. Neutraliser la trypsine en ajoutant 8 mL de hUC-MSC milieu complet contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
   5. Recueillir les cellules par centrifugation à 350 x g pendant 10 min.
   6. Resuspendre la pastille dans la saline stérile et compter les cellules à l'aide d'une chambre de B.Rker. Préparer la suspension cellulaire pour l'infusion en diluant les cellules à une concentration finale de 2,5 x 10⁵ dans 200 L de salin stérile par souris. Préparer une suspension cellulaire excédentaire pour s'assurer qu'il y a assez de volume pour infuser toutes les souris.
   7. Gardez les cellules sur la glace avant l'infusion. Infuser en quelques heures, tel que décrit à la section 3.3.
2. Anesthésie
   REMARQUE : Afin de minimiser le risque d'endommager la veine de la queue de la souris pendant l'injection, la souris ne doit pas bouger. Par conséquent, l'anesthésie a été préférée à la simple retenue de souris.
   1. Anesthésier les souris par 4% inhalation d'isoflurane dans une chambre d'induction.
   2. Surveillez la respiration de la souris. Le taux de respiration ralentira légèrement. Après quelques minutes, pincez l'un des pieds de souris pour vérifier l'anesthésie appropriée.
3. Infusion de veine de queue
   1. Une fois que l'inconscience a été confirmée, placez la souris sous une hotte stérile pour l'infusion intraveineuse aseptique de hUC-MSC.
   2. Maintenir l'anesthésie générale tout au long de l'expérience via un masque facial avec un flux continu de 1,5% isoflurane.
   3. Pour favoriser la vasodilatation et faciliter l'injection, trempez la queue de la souris dans de l'eau chaude pendant 2 min.
   4. Mélanger la suspension cellulaire en pipetilage doucement pour s'assurer que les cellules ne forment pas des amas. Aspirez 200 l dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de 26 G, évitant ainsi la formation de bulles.
   5. Tenez la queue de la souris près de la pointe et redressez-la doucement.
   6. Localiser la veine latérale de la queue de la souris; gratter délicatement avec un scalpel et l'essuyer avec 70% d'éthanol.
      REMARQUE : Le grattage doux de la queue est effectué pour enlever les cheveux, ce qui rend le site d'injection plus lisse et plus propre.
   7. À partir de la partie distale de la queue, insérez l'aiguille dans la veine à un angle de 15 degrés et infusez lentement 200 L de hUC-MSC ou salin stérile (contrôle du véhicule) (Figure 1B).
   8. Surveillez l'infusion intraveineuse réussie par le liquide entrant dans la veine sans résistance et par un manque d'extravasation. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que le volume entier se déplace vers le bas de l'aiguille, puis retirez-la de la veine.
   9. Pour éviter les saignements, appliquez brièvement une pression sur la plaie d'entrée avec une gaze stérile.
   10. Jetez en toute sécurité la seringue et l'aiguille après l'infusion.
4. Récupération animale
   1. Placez la souris infusée sur le côté sur un coussin chauffant pour la récupération.
   2. Surveillez la respiration de la souris et observez la souris jusqu'à ce qu'elle commence à bouger et retrouve la charge sternale et la pleine conscience.
   3. Une fois qu'il est confirmé que la souris est en bon état, retournez-la dans la cage d'origine. Ne le retournez pas à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré.
   4. Examiner les souris pendant 24 h après l'infusion de veine de queue et tous les deux jours, pour surveiller leur état de santé et détecter n'importe quelle souffrance ou signe pathologique tôt.

4. Explantation d'organes et traitement des tissus

1. Sacrifiez les souris aux jours 8, 14, ou 21 après l'administration de bleomycine (figure 1C) par surdose d'anesthésique injectable.
2. Acciser la trachée et les poumons et les laver immédiatement dans du PBS glacé.
3. Congelez les poumons droits dans de l'azote liquide et entreposez-les à -80 oC pour une analyse moléculaire subséquente¹⁰.
4. Gonflez les poumons gauches avec 4 % de paraformaldéhyde et fixez-les dans une solution formaline à tampon neutre de 10 % pendant 24 h; puis, les déshydrater dans la série d'alcool classé, les effacer en xylène, et les intégrer dans la paraffine¹⁰.

Résultats

Les dommages de poumon ont été induits par une injection endotrachéale simple de 1.5 U/kg poids corporel du sulfate de bleomycin dans 100 l de saline stérile. Les animaux témoins ont reçu une injection endotrachéale d'un volume égal de saline. Deux plans de hUC-MSC (2,5 x 10⁵ sur 200 l de saline stérile) ont été infusés dans la veine de la queue de la souris, 24 h et 7 jours après l'administration de la bléomycine. Les animaux témoins ont reçu une perfusion intr...

Discussion

L'administration endotrachéale est la voie préférentielle pour la livraison d'agents exogènes dans les poumons. Depuis plusieurs années, l'injection directe de bléomycine dans la trachée a été largement utilisée pour induire la fibrose pulmonaire¹³ et, récemment, des techniques plus avancées et non invasives ont été développées pour accomplir ce^{14,15 ,16}.

La m?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH