荧光肽酶谱法检测蛋白酶活性

摘要

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 修改酶图技术, 其中荧光肽被用作可降解的底物, 而不是原生蛋白质。生物样品在荧光肽酶谱中的电泳使检测到比以前的酶学技术更广泛的蛋白酶。

摘要

该方法的目的是测量复杂生物样品的蛋白溶解活性。通过嵌入可降解底物的解析凝胶, 通过电泳对样品进行分子量分离。这种方法不同于传统的凝胶酶学, 因为淬火的荧光肽是共价地纳入解决凝胶, 而不是全长蛋白质, 如明胶或酪蛋白。使用荧光肽可以直接检测蛋白溶解活性, 而无需额外的染色步骤。生物样品中的酶将淬火的荧光肽裂开, 从而增加荧光。然后用标准的荧光凝胶扫描仪对凝胶中的荧光信号进行成像, 并使用密度测量进行量化。多肽作为可降解底物的使用极大地扩展了利用酶成像技术检测到的可能的蛋白酶。

引言

凝胶酶学是一种生物技术, 用于测量生物样本中的蛋白溶解活性, 如体液或细胞^{培养介质 1,2,3}。样品通过嵌入可降解基板的聚丙烯酰胺凝胶, 通过电泳的分子量分离。常见的可降解底物包括明胶、酪蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白, 这些物质已被用来测量基质金属蛋白酶 (mmp)-1、-2、-3、-7、-8、-9 和-11, 此外还有各种导管 1^, 2^{,4 个,5,6,7.,8}. 电泳后, 酶被重新修饰, 并允许降解凝胶内的蛋白质。在传统的凝胶酶学中, 凝胶被蛋白质染料 (如 Coomassie) 染色, 蛋白酶活性被检测为信号的损失,即深蓝色背景上的白色带 (蛋白质降解)。

在这里, 我们描述了一种替代的凝胶酶学方法的协议, 其中可降解的底物是一个短的, 荧光肽共价地纳入聚丙烯酰胺凝胶 (图 1)。与传统的凝胶酶学相比, 合成肽作为可降解的底物的替代, 可以检测到更广泛的蛋白酶, 而传统的凝胶酶^学方法是与原生蛋白质9相比。荧光肽的共价连接可防止凝胶电泳过程中的肽扩散和迁移, 用以前的方法^9,10观察到。此外, 使用氟基板可以直接检测蛋白酶活性, 而无需额外的染色和去染色步骤。该方法的总体目标是通过在合氧化酶凝胶中共价地加入氟生成肽来检测生物样品中的蛋白酶活性。

研究方案

1. 解决凝胶层的制备

1. 根据表 1准备10% 的聚丙烯酰胺解析凝胶溶液。在浇注凝胶之前立即加入四甲基二胺 (temed) 和过硫酸铵 (aps), 因为它们的添加会引发聚合反应。
2. 用10% 的解析凝胶溶液填充一个空的1.5 毫米小凝胶盒 (5 毫升)。
3. 在聚丙烯酰胺凝胶顶部添加一层薄薄的异丙醇 (~ 500μl), 以产生水平凝胶并防止气泡。使用剩余的聚丙烯酰胺溶液来跟踪聚合反应的进展。当管内的聚丙烯酰胺完全凝固后, 反应完成 (~ 40分钟)。

2. 偶氮磷酰亚胺-马来酰亚胺链接分子的制备

1. 当第一个解析凝胶层是聚合时, 从-20°c 的存储中回收 azidi-pg3-马来酰亚胺试剂盒, 并使组件达到室温。每个套件有两个组件。vial 1 包含一个 maleim待 nhs 酯, 一个白色到灰色的固体。vial 2 含有偶氮-peg3-胺, 一种略带黄色的油。
   注: 作者建议使用25毫克 azidi-pg3-马来酰亚胺试剂盒, 因为它只能在-20°c 下短期 (1-2小时) 储存, 然后才开始降解。25毫克足以产生10肽凝胶。在准备后3周内使用凝胶。
2. 将 vial 2 的组分溶解在制造商推荐的二甲基亚硫酸 (dmso) 和涡流量为 30秒, 以确保液体的混合良好。
3. 将 val 1 的内容物转移到一个干净的, 干燥的100毫升圆底烧瓶, 其中包含搅拌棒。
   注: 用丙酮冲洗烧瓶, 在使用前完全干燥, 以防止水分干扰反应。
4. 立即插入橡胶隔膜塞子与隔膜, 可以用注射器刺穿到烧瓶的嘴。快速工作, 防止水分进入烧瓶。
5. 将两个18个仪表注射器针头插入隔膜, 并将一个针头连接到惰性气体罐 (例如氩气体)。允许惰性气体在烧瓶中灌装 3分钟. 在惰性气体下混合瓶1和2的成分, 以防止不良的反应产物。
   注意: 第二个注射器针是提供一个通风口, 从而允许烧瓶内的大气空气从烧瓶中流出, 因为烧瓶充满了惰性气体。不要忘了包括一个通风孔针!
6. 关闭惰性气体, 将其从针头上拆下来。使用注射器, 将 vial 2 的全部内容注射到烧瓶中。
7. 取下针头和注射器, 使组件在室温下混合 30分钟, 同时搅拌。
8. 取出橡胶隔膜塞子, 将内装物转移到干净的5毫升离心管中。在室温下, 必须在1小时内使用 azid-pg3-马来酰亚胺溶液。

3. 多肽解决凝胶层的制备

1. 一旦第一个溶解凝胶层已经聚合, 倒出异丙醇层。通过在凝胶顶部移液1毫升的去离子水, 冲洗凝胶的顶部, 然后从水中倒出来。
2. 从-80°c 贮存中回收硫醇功能化荧光肽, 使其在室温下解冻。
   注: 硫醇功能化肽可以按前面^的说明^{制备 11,12}。商业上可用的肽也可以使用, 但需要添加一个终端半胱氨酸残留物, 以使马来胺-硫醇点击反应。将肽溶解到 10 mm 的库存浓度中, 并将其储存在-80°c 的小 (30 ul) 等价物中, 以限制重复的冻融循环。
3. 根据表 1, 制备含有 azid-pga-马来酰亚胺链接剂分子和荧光肽的10% 解析凝胶溶液。在浇注凝胶之前立即添加 temed 和 aps, 因为它们的加成启动了聚合反应。
4. 用肽溶解凝胶溶液填充凝胶盒 (3 毫升) 剩余部分的一半。
   注: 多层溶解凝胶方法可减少每个凝胶所需的肽和链接剂的数量。可以根据需要调整肽分辨凝胶层的大小, 以适应更大范围的分子量。
5. 将一层薄薄的异丙醇 (~ 500μl) 输送到聚丙烯酰胺凝胶的顶部, 以产生水平凝胶并防止气泡。使用剩余的聚丙烯酰胺溶液来跟踪聚合反应的进展。当管内的聚丙烯酰胺完全凝固后, 反应完成 (~ 40分钟)。
   注: 荧光肽是光敏的。保持凝胶覆盖铝箔, 以防止光漂白过程中凝胶制备, 电泳, 洗涤和发展。
6. 从异丙醇层中倒出, 用去离子水冲洗肽溶解凝胶的顶部, 如步骤3.1 所示。
7. 如果立即使用凝胶, 请继续执行步骤 4, 否则, 将准备好的凝胶浸泡在塑料盒中, 在4°c 的情况下, 将准备好的凝胶浸入100ml 的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中, 以防止凝胶干燥。用铝箔包裹盒子, 以防止光漂白。凝胶在使用前最多可以在 pbs 中储存3周。

4. 堆叠凝胶的制备

1. 根据表 1准备5% 的堆叠凝胶溶液。在浇注凝胶之前立即添加 temed 和 aps, 因为它们的加成启动了聚合反应。
2. 用堆叠凝胶溶液填充凝胶盒 (~ 2 毫升) 剩余的空白部分。
3. 快速将 1.5 mm 凝胶梳子插入堆叠凝胶层, 确保井下不会残留气泡。使用剩余的聚丙烯酰胺溶液来跟踪聚合反应的进展。当管内的聚丙烯酰胺完全凝固后, 反应就完成了 (~ 10分钟)。
4. 从凝胶盒背面轻轻取下梳子和胶带。

5. 电泳生物样品的制备

1. 在非还原条件下准备有条件的细胞介质、细胞裂解物、组织同质化和 mmp 标准^,如其他地方所述。不要加热样品。
2. 例如, 准备有条件的细胞培养基, 如下所示:
   1. 在10% 的胎牛血清 (fbs) 培养基中, 6 孔板中的 40, 000 细胞/^厘米2 细胞。在加湿室 (37°c 时将 5% co2)中培养细胞 24小时, 使其达到70-80% 的融合。
      注: 如果细胞在24小时后仍未达到所需的融合, 请允许它们在10% 的 fbs 培养基中长出24小时。
   2. 用 pbs 清洗细胞两次, 加入2毫升无血清培养培养基。将细胞在加湿室 (37°c 时为 5% co2 ) 中额外培养24小时。
   3. 使用血清学移液器, 从每口井收集有条件的介质。以1200转每分钟离心介质 3分钟, 以去除任何细胞碎片。采取上清液, 并集中使用15毫升, 10 kda 分子量截止离心过滤装置。在摆动斗式转子中以 4, 000 x 克离心过滤单元 15分钟, 在固定角度转子中离心 5, 000 x 克, 15分钟。
      注: 此步骤是可选的, 但可以提高肽酶谱中的蛋白溶解带的强度。
   4. 将浓缩滤液转移到新鲜的 1.5 ml 离心管中。在-80°c 下倾斜并存储样品, 最多可进行三次冻融循环。
3. 使用标准蛋白质定量检测 (如bca、bradford 检测等) 对蛋白质含量进行定量。

6. 多肽酶谱中生物样品的电泳

1. 在传统的酶学样品缓冲液中溶解样品 (62.5 mm tris-hcl, ph 6.8, 25% 甘油, 4% sds, 0.01% 溴酚蓝)。对于细胞和组织样本, 建议每口总蛋白约30微克, mmp 标准建议为50-100 纳克蛋白质。
2. 在凝胶装置中加入400毫升的1x 特里斯-甘氨酸 sds 运行缓冲器。每口井可装载高达35μl 的样品。在4°c 下以 120 v 的温度运行样品1.5 小时, 或者直到分子量标准表明所关注的蛋白酶在肽分辨凝胶层 (具有可见的橙色) 内。
   注: 大多数 mmp 及其型号都在 35-100 kda 的范围内。当分子量标准表明这些重量是在肽分辨凝胶层内, 电泳可以停止。同样的原理也适用于其他类型的已知分子量的蛋白酶。如果有兴趣检测多个蛋白酶在更大的分子量范围内, 减少分辨凝胶层的大小, 并增加肽分辨凝胶层的大小。
3. 电泳后, 在室温下, 在室温下, 在含有 2.5% triton x-100、1μm zncl₂和 5mm cl 2 的再生缓冲液中, 在室温下取出凝胶三次, 每次 10分钟.Tris-HCl, ph 值7.5。
4. 将凝胶转移到含有 1% triton x-100、1μm zncl₂和 5mm ccl 2 的开发缓冲液中 , 在 50 mm Tris-HCl 中, ph 7.5 为 15分钟, 更换为新鲜的显影性缓冲液, 并在温和搅拌下在37°c 孵育凝胶24小时, 确保凝胶完全浸入溶液中。

7. 多肽酶谱的成像

1. 24小时后, 图像凝胶使用荧光凝胶扫描器使用适当的激发和发射过滤器。例如, 代表性结果中显示的肽凝胶与荧光素结合, 并使用 488 nm 的励磁滤池和521纳米的发射滤光片进行了成像。使用适当的过滤器为您的荧光体将最大限度地检测蛋白溶解活性。
   注: 图像也可以通过配备紫外线透射照明器的凝胶成像仪拍摄, 该成像仪通常用于使用溴化乙酯染色的 dna 凝胶的成像。使用紫外线透射灯 (365 nm) 设置和 590 nm 的发射过滤器对凝胶进行成像。
2. 使用 imagej 对波段强度进行密度分光评估, 如其他地方^所述13。

结果

使用此处描述的方法, 将两种荧光蛋白酶降解肽纳入聚丙烯酰胺凝胶中: ggpqg iwqk (peg) 2c(在整个文本和数字中简称 qgiw) 和 gpla c^{pMeOBzl wark}(peg) 2c (在整个案文和数字中缩写为 lacw)。表示的部位。qgiw 是一个用于检测细胞胶原酶¹⁴的胶原蛋白-i 派生序列。lacw 是一个针对检测 mmp-14 和 mmp-11^{15 进行}优化的序列。这些肽用 n-?...

讨论

目前的酶学技术依赖于将原生底物纳入聚丙烯酰胺凝胶来检测蛋白溶解。虽然这些技术已经得到广泛的使用, 他们仍然是有限的蛋白酶, 他们可以检测到的数量。在这里, 描述了一个协议, 其中荧光, 蛋白酶降解肽被纳入聚丙烯酰胺解析凝胶。使用 azidi-pga-马来酰亚胺链接器分子进行共价偶联, 可分离和检测比目前本地底物更广泛的蛋白酶。荧光肽的高度可调谐特性使研究人员能够设计出能够针对其?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086