זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.

Abstract

מטרת שיטה זו היא למדוד את הפעילות הפרוטאוליטי של דגימות ביולוגיות מורכבות. הדגימות מופרדים באמצעות משקל מולקולרי באמצעות אלקטרופורזה באמצעות ג'ל פתרון מוטבע עם מצע מתכלה. שיטה זו שונה zymography ג'ל מסורתיות בכך fluorogenic מתרצה פפטיד הוא שולב covalently הג'ל פתרון במקום חלבונים באורך מלא, כגון ג'לטין או קזאין. השימוש פפטידים fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות הפרוטאוליטי ללא שלבים נוספים מוכתמים. אנזימים בתוך דגימות ביולוגיות קליב פפטיד fluorogenic מתרצה, וכתוצאה מכך עלייה בזריחה. האות פלורסנט, ג'לים ולאחר מכן עם תמונה עם סורק ג'ל פלורסנט רגיל, לכמת באמצעות densitometry. השימוש של פפטידים המצע מתכלה מאוד מרחיבה של פרוטאזות אפשרי לזיהוי בטכניקות zymographic.

Introduction

ג'ל zymography היא טכניקה ביולוגי למדידת פעילות הפרוטאוליטי בתוך דגימות ביולוגיות, כגון נוזלי הגוף או תא תרבות המדיה^1,2,3. הדגימות מופרדים באמצעות משקולות מולקולרית שלהם עם אלקטרופורזה באמצעות ג'ל לזיהוי מוטבע עם מצע מתכלה. מצעים מתכלה נפוצים כוללים ג'לטין, קזאין, קולגן ואלסטין, אשר שימשו כדי למדוד את הפעילות של מטריקס metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7, -8,-9 ו-11, בנוסף למגוון cathepsins^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. לאחר אלקטרופורזה, האנזימים renatured הינם מותרות כדי להשפיל את החלבון בתוך הג'ל. Zymography ג'ל מסורתיים, הג'ל הוא מוכתם צבע חלבון, כגון כחול Coomassie, ולאחר פעילות פרוטאז מתגלה כמו איבוד אות, קרי, לבנים להקות (השפלה של חלבון) על רקע כחול כהה.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שיטה חלופית zymography ג'ל, שבו המצע מתכלה הוא קצר, פפטיד fluorogenic covalently שולבו הג'ל לזיהוי (איור 1). ההחלפה של peptides סינתטי בשם דיאלקטריים מתכלה מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות לעומת zymography ג'ל מסורתי עם חלבונים מקורית⁹. להצמדת קוולנטיות פפטיד fluorogenic מונע פעפוע פפטיד והעברה במהלך בג'ל נצפתה עם שיטות קודמות^9,10. יתר על כן, השימוש של מצע fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות פרוטאז מבלי להכתים נוספים וצעדים מבטל את ההגדלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא הגילוי של פעילות פרוטאז דגימות ביולוגיות באמצעות שיתוף קוולנטיות פפטידים fluorogenic zymogram ג'ל.

Protocol

1. הכנת שכבת ג'ל פתרון

1. להכין לזיהוי של 10% פתרון פתרון ג'ל לפי טבלה 1. הוסף את Tetramethylethylenediamine (TEMED) ואת אמוניום Persulfate (APS) מייד לפני לשפוך את הג'ל כמו תוספת שלהם יוזם התגובה הפילמור.
2. למלא קלטת מיני ג'ל של ריק 1.5 מ מ בחצי הדרך (5 מ"ל) הפתרון ג'ל פתרון 10%.
3. הוסף שכבה דקה של אלכוהול איזופרופיל (~ 500 µL) לחלק העליון של הג'ל לזיהוי לייצר ג'ל ברמה, למנוע בועות. השתמש הפתרון לזיהוי שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה הפילמור. כאשר לזיהוי בצינור לחלוטין התחזק, התגובה היא מלאה (~ 40 דקות).

2. הכנת המולקולה מקשר Azido-PEG3-maleimide

1. ואילו השכבה ג'ל פתרון הראשונה היא polymerizing, לאחזר את ערכת azido-PEG3-maleimide אחסון-20 ° C ולאפשר המרכיבים לטמפרטורת החדר. ישנם שני מרכיבים כל ערכה. מבחנה 1 מכיל של אסתר maleimide-NHS, בצבע אופ-וייט גריי מוצק. בקבוקון 2 מכיל azido-PEG3-אמין, שמן מעט צהבהב.
   שים לב: המחברים מציע באמצעות ערכת azido-PEG3-maleimide 25 מ ג כפי ניתן לאחסן רק לפרקי זמן קצרים של זמן (1-2 שעות) ב-20 ° C אחרי הכנה לפני שזה מתחיל להתפורר. 25 מ ג מספיקה לייצר 10 פפטיד ג'לים. השתמש ג'לים בתוך 3 שבועות של הכנה.
2. להמיס את הרכיבים של מבחנה 2 היצרן מומלצת כמות דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ואת מערבולת ב-30 s כדי להבטיח לו נוזלים יש מספר טוב.
3. העברת תכולת הבקבוקון 1 לתוך בקבוקון סיבוב למטה נקי, יבש 100 מל המכילה בר מערבבים.
   הערה: יש לשטוף את הבקבוק עם אצטון, להתייבש לחלוטין לפני השימוש כדי למנוע לחות מתנגש עם התגובה.
4. מיד להוסיף פקק מחצה גומי עם הדיאפרגמה זה יכול להיות ניקב בעזרת מזרק לתוך הפה של הבקבוק. לעבוד מהר כדי למנוע לחות להזין את הבקבוקון.
5. הוספת שני 18 מד מזרק מחטים לתוך הסרעפת וחבר אחד מיכל גז אינרטי (למשל גז ארגון). לאפשר גז אינרטי כדי למלא את הבקבוק במשך 3 דקות לערבב את הרכיבים של בקבוקונים 1 ו- 2 תחת גז אינרטי כדי למנוע תגובה לא רצויה מוצרים.
   התראה: מחט מזרק השני נועד לספק אוורור, ובכך לאפשר את האוויר האטמוספרי הכלול בתוך הבקבוק לזרום מתוך הבקבוק כפי הוא ממלא גז אינרטי. אל תשכח לכלול מחט פתח!
6. מכבים את הגז אינרטי תוך הפרדתה של המחט. באמצעות מזרק, להזריק את התוכן המלא של מבחנה 2 לתוך הבקבוק.
7. הסר מחטים והן מזרק ולאפשר את הרכיבים לערבב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.
8. הסר את פקק הגומי מחצה ולהעביר את התוכן שפופרת צנטרפוגה נקיים מ. הפתרון azido-PEG3-maleimide יש להשתמש בתוך שעה בטמפרטורת החדר.

3. הכנת פפטיד לפתרון שכבת ג'ל

1. לאחר השכבה הראשונה ג'ל פתרון כולל polymerized, יוצקים את השכבה אלכוהול איזופרופיל. לשטוף את החלק העליון של הג'ל על ידי pipetting 1 מ"ל של מים יונים על גג הג'ל, ואז לשפוך את המים.
2. לאחזר את פפטיד פלורסנט תיול-functionalized-80 ° C אחסון ולאפשר להפשיר בטמפרטורת החדר.
   הערה: פפטיד תיול-functionalized ניתן להכין כפי שתואר לעיל^11,12. פפטידים זמינים מסחרית יכול לשמש גם אבל דורשים התוספת של משקע ציסטאין מסוף כדי לאפשר את maleimide-תיול לחץ על התגובה. להמיס את פפטיד כדי ריכוז מניות של 10 מ מ ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס ב aliquots קטן (30 uL) להגבלת מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
3. הכינו 10% פתרון פתרון ג'ל המכיל את המולקולה azido-PEG3-maleimide מקשר את פפטיד פלורסנט לפי טבלה 1. הוסף את TEMED ואת APS מייד לפני לשפוך את הג'ל כמו תוספת שלהם יוזם התגובה הפילמור.
4. ממלאים חצי החלק הנותר של קלטת ג'ל (3 מ ל) פפטיד פתרון פתרון ג'ל.
   הערה: בגישה ג'ל פתרון רב-שכבתית מפחיתה את כמות פפטיד, מקשר הכרחי עבור כל ג'ל. יכול להיות מותאם לגודל השכבה ג'ל פפטיד פתרון כדי להתאים מגוון גדול יותר של משקולות מולקולרית כנדרש.
5. Pipette שכבה דקה של אלכוהול איזופרופיל (~ 500 µL) לחלק העליון של הג'ל לזיהוי לייצר ג'ל ברמה, למנוע בועות. השתמש הפתרון לזיהוי שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה הפילמור. כאשר לזיהוי בצינור לחלוטין התחזק, התגובה היא מלאה (~ 40 דקות).
   הערה: פפטיד פלורסנט הוא רגיש אור. שמור את ג'לים מכוסה ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching במהלך הכנת ג'ל אלקטרופורזה, כביסה, פיתוח.
6. יוצקים את השכבה אלכוהול איזופרופיל ולשטוף העליון של פפטיד פתרון ג'ל עם מים יונים כמו שלב 3.1.
7. אם משתמש את ג'ל באופן מיידי, להמשיך לשלב 4, אחרת, לטבול את ג'לים מוכן ב- 100 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C בתוך קופסת פלסטיק כדי למנוע את ג'לים ממנו להתייבש. לעטוף את תיבת בנייר אלומיניום כדי למנוע photobleaching. ג'לים ניתן לאחסן PBS עד 3 שבועות לפני השימוש.

4. הכנה של הג'ל הערימה

1. להכין פתרון ג'ל הערימה 5% לפי טבלה 1. הוסף את TEMED ואת APS מייד לפני לשפוך את הג'ל כמו תוספת שלהם יוזם התגובה הפילמור.
2. למלא את החלק הריק הנותר של קלטת ג'ל (~ 2 מ"ל) הפתרון ג'ל הערימה.
3. להוסיף במהירות מסרק ג'ל 1.5 מ מ אל שכבת ג'ל הערמה, מוודא שאין בועות נשארים לכודים תחת הבארות. השתמש הפתרון לזיהוי שאריות כדי לעקוב אחר ההתקדמות של התגובה הפילמור. כאשר לזיהוי בצינור לחלוטין התחזק, התגובה היא מלאה (~ 10 דקות).
4. הסר בעדינות את המסרק, והקלטת מהחלק האחורי של קלטת ג'ל.

5. הכנה של דגימות ביולוגיות אלקטרופורזה

1. להכין מדיה תאים ממוזגים, lysates תא, רקמה homogenates ותקני MMP כמתואר תחת תנאים שאינם בהפחתת². לא לא מחממים את הדגימות.
2. לדוגמה, להכין מדיה תאים ממוזגים כמפורט להלן:
   1. צלחת 40,000 תאים/cm² תאים צלחת 6-ובכן בתקשורת תרבות סרום שור עוברית (FBS) 10%. דגירה תאים בתוך תא humidified (5% CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס) למשך 24 שעות, לאפשר להם להגיע למפגש 70-80%.
      הערה: אם התאים לא הגיעו את confluency הרצוי לאחר 24 שעות, לאפשר להם לגדול ב- 10% FBS תרבות המדיה 24 שעות נוספות.
   2. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל של סרום ללא תרבות המדיה. דגירה התאים בתוך תא humidified (5% CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס) 24 שעות נוספות.
   3. באמצעות פיפטה סרולוגית, לאסוף את המדיה ממוזגים מכל קידוח. Centrifuge התקשורת-1200 סל ד במשך 3 דקות להסיר את כל שאריות תאים. קח את תגובת שיקוע, להתרכז באמצעות a 15 מ"ל, יחידת מסנן צנטריפוגלי סף משקל מולקולרי 10 kDa. Centrifuge היחידות מסנן ב 4000 x g למשך 15 דקות רוטור דלי מתנדנדים או g x 5,000 למשך 15 דקות רוטור זווית קבועה.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אך ניתן לשפר את עוצמת הלהקות הפרוטאוליטי של ג'לים zymography פפטיד.
   4. להעביר את פילטרט מרוכז של שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים. Aliquot מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד שלושה מחזורים ההקפאה-הפשרה.
3. לכמת את תכולת החלבון שימוש assay כימות של חלבון סטנדרטית (למשל BCA, ברדפורד Assay, וכדומה).

6. אלקטרופורזה של הביולוגיה דוגמאות בפפטיד Zymography ג'ל

1. להמיס הדגימות במאגר מדגם zymography קונבנציונלי (62.5 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, bromophenol 0.01% 25% גליצרול, 4% מרחביות, כחול). עבור דגימות תאים ורקמות, מומלץ ~ 30 µg של חלבון סה כ ליום טוב, ו- 50-100 ננוגרם של חלבון עבור MMP סטנדרטים.
2. להוסיף 400 מ של 1 x טריס-גליצין מרחביות הפעלת מאגר למכשירים ג'ל. לטעון µL עד 35 מדגם לכל טוב. הפעל את הדגימות-120 V ב 4 ° C 1.5 שעות או עד המידה משקל מולקולרי מציינים כי פרוטאזות עניין נמצאים במרחק פפטיד לפתרון שכבת ג'ל (בעל צבע כתום גלוי).
   הערה: רוב MMPs ואת גירסאותיהם ליפול בטווח של 35-100 kDa. כאשר הסטנדרטים משקל מולקולרי לציין כי משקולות אלה נמצאים במרחק פפטיד לפתרון שכבת ג'ל, ניתן לעצור אלקטרופורזה. ניתן להחיל את אותו עיקרון מעמדות אחרים של פרוטאזות עם משקולות מולקולרית ידוע. אם יש אינטרס גילוי פרוטאזות מרובים על טווח גדול יותר של משקולות מולקולרית, להקטין את הגודל של שכבת ג'ל פתרון ולהגדיל את הגודל של השכבה ג'ל פפטיד פתרון.
3. בעקבות אלקטרופורזה, להסיר את ג'לים בקלטת פלסטיק ולשטוף ג'לים שלוש פעמים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת עדין עצבנות במאגר renaturing המכילים 2.5% טריטון X-100, 1 מיקרומטר ZnCl₂ו- 5 מ מ CaCl₂ ב- 50 מ מ טריס-HCl, pH 7.5.
4. העברת ג ' לים כדי לפתח פתרון מאגר המכיל 1% טריטון X-100, ZnCl 1 מיקרומטר₂ ו CaCl 5 מ מ₂ ב- 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5 15 דקות להחליף עם פיתוח טריים מאגר פתרון דגירה ג'לים ב 37 ° C תחת עצבנות עדין למשך 24 שעות , מוודא ג'לים הם submersed באופן מלא בפתרון.

7. הדמיה של פפטיד Zymography ג ' לים

1. לאחר 24 שעות, ג'לים התמונה באמצעות פלורסנט ג'ל סורק/imager באמצעות את המסננים המתאימים עירור, פליטה. לדוגמה, ג'לים פפטיד המוצג בתוצאות נציג הם מצומדת עם Fluorescein ' היו עם תמונה באמצעות מסנן עירור של 488 ננומטר, מסנן פליטה של 521 ננומטר. שימוש את המסננים המתאימים עבור fluorophore שלך יהיה למקסם את הגילוי של פעילות הפרוטאוליטי.
   הערה: תמונות יכולות להילקח גם עם imager ג'ל מצוידים transilluminator UV, המשמשת לעתים קרובות ההדמיה של ה-DNA ג'ל מוכתם אתידיום ברומיד. תמונה של ג'לים באמצעות את transilluminator UV (365 ננומטר) הגדרת ואת מסנן פליטה של 590 ננומטר.
2. לבצע הערכה densitometric של הלהקה עוצמות באמצעות ImageJ כמתואר¹³.

תוצאות

באמצעות השיטה המתוארת כאן, שני ניאון פפטידים פרוטאז-מתכלים אוחדו ג'לים לזיהוי: GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (באופן מקוצר כ- QGIW לאורך הטקסט ואת המספרים) ו GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (באופן מקוצר כ- LACW לאורך הטקסט ואת המספרים). ↓ מציין האתר של המחשוף. QGIW הוא קולגן-אני נגזר רצף תוכננה לאתר...

Discussion

טכניקות zymographic הנוכחיים מסתמכים על שילוב של סובסטרטים יליד לתוך לזיהוי ג'לים איתור proteolysis. ואילו טכניקות אלה משכו השימוש הנרחב, הם עדיין מוגבלים במספר של פרוטאזות שהם יכולים לזהות. . הנה, פרוטוקול תוארה בפפטידים פלורסנט, פרוטאז-מתכלים אשר משולבים של לזיהוי פתרון ג'ל. קוולנטיות צימוד באמצעות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086