Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para una técnica de zymographic modificada en la que se utilizan péptidos fluorescentes como el substrato degradable en lugar de proteínas nativas. Electroforesis de muestras biológicas en isoenzimáticos péptido fluorescente permite la detección de una gama más amplia de las proteasas que las anteriores técnicas de zymographic.

Resumen

El propósito de este método es medir la actividad proteolítica de muestras biológicas complejas. Las muestras están separadas por peso molecular mediante electroforesis a través de un gel de resolución con un sustrato degradable. Este método difiere zymography gel tradicional un péptido fluorógenos apagado se incorpora covalentemente en el gel de resolución en lugar de proteínas completas, como gelatina o caseína. Uso de los péptidos fluorógenos permite la detección directa de actividad proteolítica sin pasos adicionales de tinción. Las enzimas dentro de las muestras biológicas hienden el péptido fluorógenos apagado, dando por resultado un aumento en fluorescencia. La señal fluorescente en los geles es entonces reflejada con un escáner estándar gel fluorescente y cuantifica mediante densitometría. El uso de péptidos como el substrato degradable expande considerablemente las proteasas posible detectables con técnicas de zymographic.

Introducción

Zymography gel es una técnica biológica utilizada para medir la actividad proteolítica en las muestras biológicas, tales como fluidos corporales o células medios de cultivo^1,2,3. Las muestras son separadas por sus pesos moleculares con electroforesis a través de un gel de poliacrilamida con un sustrato degradable. Los sustratos degradables comunes incluyen gelatina, caseína, colágeno y elastina, que se han utilizado para medir la actividad de metaloproteinasas de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 y -11, además de una variedad de catepsinas^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. después de la electroforesis, las enzimas son renatured y permitido degradar la proteína en el gel. En zymography tradicional gel, el gel se tiñe con un tinte de proteína, como el azul de Coomassie, y actividad de la proteasa se detecta como una pérdida de señal, bandas (degradación de la proteína) es decir, blanco sobre un fondo azul oscuro.

Aquí, describimos un protocolo para un método alternativo de zymography gel, en el que el sustrato degradable es un cortocircuito, péptido fluorógenos incorporada covalentemente en el gel de poliacrilamida (figura 1). La sustitución de péptidos sintéticos como el sustrato degradable permite la detección de una gama más amplia de las proteasas en comparación con el gel tradicional zymography con proteínas nativas⁹. Enlace covalente del péptido fluorógenos previene péptido difusión y migración durante la electroforesis en gel con anteriores métodos^9,10. Además, el uso de un sustrato fluorógenos permite la detección directa de la actividad de las proteasas sin coloración adicional y pasos de tinción. El objetivo general de este método es la detección de actividad de la proteasa en muestras biológicas mediante la incorporación covalente de péptidos fluorógenos en geles de zymogram.

Protocolo

1. preparación de la capa de Gel de resolución

1. Preparar una 10% de poliacrilamida resolver solución gel según la tabla 1. Añadir el Tetramethylethylenediamine (TEMED) y persulfato de amonio (APS) inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.
2. Llene un casete de gel mini vacío 1,5 mm a mitad de camino (5 mL) con la solución 10% de gel de resolución.
3. Añadir una capa delgada de isopropanol (~ 500 μl) a la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel nivel y evitar burbujas. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (40 min).

2. preparación de la molécula de vinculador de Azido-PEG3-maleimida

1. Mientras que la primera capa de gel de resolución es polimerización, recuperar el azido-PEG3-maleimida kit de almacenamiento-20 ° C y deje que los componentes alcancen la temperatura ambiente. Hay dos componentes en cada kit. Frasco 1 contiene un éster de maleimida-NHS, un grisáceo a gris sólido. Frasco 2 contiene azido-PEG3-amina, un aceite ligeramente amarillo.
   Nota: Los autores sugieren con el kit de azido-PEG3-maleimida 25 mg como sólo puede ser almacenado por periodos cortos de tiempo (1-2 horas) a-20 ° C después de ser preparado antes de que empiece a degradarse. 25 mg es suficiente para producir 10 geles de péptido. Usar geles dentro de 3 semanas de preparación.
2. Disolver los componentes de la ampolla 2 el fabricante recomendada volumen de dimetilsulfóxido (DMSO) y vortex por 30 s para los líquidos se han mezclado bien.
3. Transferir el contenido de 1 frasco en un matraz de fondo redondo de 100 mL limpio y seco que contiene una barra de agitación.
   Nota: Enjuague el frasco con acetona y secar completamente antes de usarlos para evitar que la humedad interfiere con la reacción.
4. Inmediatamente Inserte un tapón de septum de goma con un diafragma que se puede pinchar con una jeringa en la boca del matraz. Trabajar rápidamente para evitar que la humedad penetre en el matraz.
5. Insertar dos 18 agujas de jeringa en el diafragma y conectar uno a un tanque de gas inerte (e.g. gas de argón). Que el gas inerte para llenar el matraz por 3 minutos mezcla los componentes de los frascos 1 y 2 bajo gas inerte para evitar que los productos de reacción indeseable.
   PRECAUCIÓN: La segunda aguja de la jeringa es proporcionar una ventilación, lo que permite que el aire atmosférico contenido en el matraz a salir del frasco como llena con gas inerte. ¡No se olvide de incluir una aguja de ventilación!
6. Apague el gas inerte y separar de la aguja. Utilizando una jeringa, inyectar el contenido completo del Vial 2 al matraz.
7. Saque las agujas y jeringas y los componentes de la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente mientras que revuelve.
8. Quite el tapón de septum goma y transferir el contenido a un tubo de centrífuga limpio 5 mL. La solución de azido-PEG3-maleimida debe utilizarse dentro de 1 hora a temperatura ambiente.

3. preparación del péptido capa del Gel de resolución

1. Una vez que la primera capa de gel de resolución ha polimerizado, retirar la capa de isopropanol. Enjuague la parte superior del gel por Pipetear 1 mL de agua desionizada en la parte superior del gel y luego Vierta el agua.
2. Recuperar el péptido fluorescente funcionalizados tiol de almacenamiento de-80 ° C y deje que se descongele a temperatura ambiente.
   Nota: El péptido funcionalizados tiol puede ser preparado como se describió anteriormente^11,12. Péptidos disponibles en el mercado también se pueden utilizar pero requieren la adición de un residuo de cisteína terminales para permitir la maleimida-tiol, haga clic en la reacción. Disolver el péptido a una concentración stock de 10 mM y almacenar a-80 ° C en pequeñas alícuotas (30 uL) para limitar los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
3. Preparar un 10% solución solución gel que contiene la molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador y el péptido fluorescente según tabla 1. Agregar el TEMED y el APS inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.
4. Llene la mitad de la porción restante del cartucho (3 mL) de gel con el péptido resolver la solución en gel.
   Nota: Un enfoque multi-capa de gel resolución reduce la cantidad de péptido y enlazador necesario para cada gel. El tamaño de la capa de gel de resolución péptido puede ajustarse para acomodar una gama más amplia de pesos moleculares según sea necesario.
5. Pipetear una fina capa de isopropanol (~ 500 μl) en la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel nivel y evitar burbujas. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (40 min).
   Nota: El péptido fluorescente es sensible a la luz. Mantenga el gel cubierto con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo durante el desarrollo, electroforesis, lavado y preparación del gel.
6. Retirar la capa de isopropanol y enjuague la parte superior del péptido solución de gel con agua desionizada como en el paso 3.1.
7. Si utilizar los geles inmediatamente, vaya al paso 4, de lo contrario, sumergir los geles preparados en 100 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C en una caja de plástico para evitar que el gel se seque. Envuelva la caja en papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo. Los geles pueden almacenarse en PBS durante 3 semanas antes de uso.

4. preparación del Gel de apilamiento

1. Preparar una solución de gel de apilamiento 5% según la tabla 1. Agregar el TEMED y el APS inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.
2. Llene la porción restante del vacíela de la cassette de gel (2 mL) con la solución de gel de apilamiento.
3. Insertar rápidamente un peine del gel de 1,5 mm en la capa de gel de apilamiento, asegurándose de que no hay burbujas permanecen atrapadas debajo de los pozos. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (~ 10 min).
4. Suavemente Retire el peine y la cinta de la parte posterior de los cassettes de gel.

5. preparación de muestras biológicas para electroforesis

1. Preparar los medios condicionados de la célula, lysates de la célula, homogenados de tejido y estándares MMP como se describe en otros lugares bajo condiciones no reductoras². No calentar las muestras.
2. Por ejemplo, preparar los medios condicionados de la célula como sigue:
   1. Células en una placa de 6 pozos en 10% suero bovino fetal (FBS) medios de cultivo en placa 40.000 células/cm² . Incubar las células en una cámara humidificada (5% CO₂ a 37 ° C) durante 24 horas y que puedan llegar a 70-80% de confluencia.
      Nota: Si las células han alcanzado la confluencia deseada después de 24 horas, permite que crezcan en medios de cultivo 10% FBS por 24 horas.
   2. Lavan las células dos veces con PBS y añadir 2 mL de medio de cultivo libre de suero. Incubar las células en una cámara humidificada (5% CO₂ a 37 ° C) por 24 horas.
   3. Con una pipeta serológica, recoger los medios condicionados de cada pozo. Los medios de comunicación a 1200 rpm durante 3 minutos eliminar cualquier residuo de células de la centrífuga. Tomar el sobrenadante y se concentran con un 15 mL, unidad de corte de filtro centrífugo de peso molecular de 10 kDa. Centrifugue las unidades de filtro a 4.000 x g durante 15 min en un rotor que hace pivotar del cubo o 5.000 x g durante 15 min en un rotor de ángulo fijo.
      Nota: Este paso es opcional pero puede mejorar la intensidad de las bandas proteolíticas en los geles de zymography péptido.
   4. Transfiera el concentrado filtrado a un tubo de centrífuga 1.5ml fresco. Alícuota y almacenar las muestras a-80 ° C durante un máximo de tres ciclos de congelación y descongelación.
3. Cuantificar el contenido de la proteína usando un análisis de cuantificación de proteína estándar (por ejemplo, BCA, ensayo de Bradford, etc.).

6. electroforesis de biológico muestras en péptido Zymography geles

1. Disolver las muestras en solución tampón de muestras convencionales zymography (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, glicerol al 25%, 4% SDS, 0.01% azul de bromofenol). Para las muestras de células y tejidos, se recomienda 30 μg de proteínas totales por pozo y 50-100 ng de proteína para los estándares MMP.
2. Añadir 400 mL de 1 x Tris glicina SDS ejecuta Buffer en el aparato del gel. Carga hasta 35 μl de muestra por pozo. Ejecutar las muestras de 120 V a 4 ° C por 1.5 horas o hasta que los estándares de peso molecular indican que las proteasas de interés disponibles dentro el péptido resolver capa de gel (que tiene un color naranja visible).
   Nota: La mayoría de MMPs y sus variantes caen dentro del rango de 35-100 kDa. Cuando los estándares de peso molecular indican que los pesos son en el péptido resolver capa del gel, se puede detener la electroforesis. El mismo principio puede aplicarse a otras clases de proteasas con pesos moleculares conocidos. Si hay un interés en la detección de varias proteasas sobre una gama más amplia de pesos moleculares, reducir el tamaño de la capa de gel de resolución y aumentar el tamaño de la capa de gel de resolución de péptido.
3. Tras la electroforesis, los geles Retire el cartucho de plástico y lavar geles tres veces por 10 min a temperatura ambiente en agitación suave en renaturing buffer que contiene 2,5% Tritón X-100, 1 μm vivencias₂y 5 mM CaCl₂ en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
4. Transferencia de geles para desarrollar solución amortiguadora que contiene 1% Tritón X-100, 1 μm vivencias₂ y 5 mM CaCl₂ en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, para reemplazar a 15 minutos con el desarrollo de la nueva solución tampón e incubar geles a 37 ° C en agitación suave durante 24 horas , asegurándose de que los geles son completamente sumergidos en la solución.

7. proyección de imagen del péptido Zymography geles

1. Después de 24 horas, geles de imagen usando un fluorescente gel escáner/imager usando los filtros de excitación y de emisión adecuados. Por ejemplo, los geles de péptido se muestra en los resultados representativos son conjugados con fluoresceína y se reflejada utilizando un filtro de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 521 nm. Usar los filtros adecuados para el fluoróforo maximiza la detección de actividad proteolítica.
   Nota: Imágenes también pueden ser tomadas con un formador de gel equipado con un transiluminador UV, a menudo utilizado para la proyección de imagen de geles de ADN teñidas con bromuro de etidio. Imagen de los geles con el transiluminador UV (365 nm) ajuste y un filtro de emisión de 590 nm.
2. Realizar evaluación densitométrica de las intensidades de la banda con ImageJ como se describe en otra parte¹³.

Resultados

Empleando el método descrito aquí, se incorporaron dos péptidos proteasa degradable fluorescentes en geles de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (abreviado como QGIW en todo el texto y figuras) y GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (abreviado como LACW en todo el texto y figuras). ↓ indica el sitio de la hendidura. QGIW es un colágeno-derivé secuencia diseñada para detectar colagenasas celular¹⁴. LACW es una secuencia que se ha op...

Discusión

Zymographic las técnicas actuales se basan en la incorporación de sustratos nativos en geles de poliacrilamida para la detección de la proteólisis. Mientras que estas técnicas han ganado uso extenso, todavía están limitados en el número de proteasas que pueden detectar. Aquí, un protocolo fue descrito en que péptidos fluorescentes, proteasa degradable se incorporan a la solución de gel de poliacrilamida. Covalente acoplamiento usando una molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador permite la separación y la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086