Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma técnica modificada de zymographic na qual fluorescentes peptídeos são usados como substrato degradável no lugar de proteínas nativas. Eletroforese de amostras biológicas em Zimogramas peptídeo fluorescente permite a detecção de uma gama maior de proteases que as técnicas de zymographic anterior.

Resumo

A finalidade desse método é medir a atividade proteolítica de amostras biológicas complexas. As amostras são separadas por peso molecular usando electroforese através de um gel de resolução incorporado com um substrato degradável. Esse método difere zimografia tradicional gel, em que um peptídeo extinto fluorogenic covalentemente é incorporado o gel de resolução em vez de proteínas de comprimento total, tais como gelatina ou de caseína. Uso dos peptides fluorogenic permite a detecção direta de atividade proteolítica sem etapas adicionais de coloração. As enzimas dentro as amostras biológicas cleave o peptídeo fluorogenic temperada, resultando em um aumento na fluorescência. O sinal fluorescente no gel é então fotografada com um scanner padrão gel fluorescente e quantificados utilizando densitometria. O uso de peptídeos como substrato degradável grandemente expande as proteases possíveis detectáveis com técnicas de zymographic.

Introdução

Zimografia gel é uma técnica biológica usada para medir a atividade proteolítica dentro de amostras biológicas, tais como fluidos corporais ou meios de cultura de células a^1,2,3. As amostras são separadas por seus pesos moleculares com a eletroforese através de um gel de polyacrylamide incorporado com um substrato degradável. Substratos degradáveis comuns incluem gelatina, caseína, colágeno e elastina, que foram utilizados para medir a atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, além de uma variedade de cathepsins^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. após eletroforese, as enzimas são renatured e permitido para degradar a proteína dentro do gel. Em zimografia tradicional gel, o gel está manchado com uma tintura de proteína, tais como o azul de Coomassie, e atividade de protease é detectada como uma perda de sinal, ou seja, branco de bandas (degradação da proteína) em um fundo azul escuro.

Aqui, descrevemos um protocolo para um método alternativo de zimografia de gel, em que o substrato degradável é um curto-circuito, fluorogenic peptídeo covalentemente incorporado o gel de poliacrilamida (Figura 1). A substituição de peptídeos sintéticos como os substratos degradáveis permite a detecção de uma gama maior de proteases em comparação com o tradicional gel zimografia com proteínas nativas⁹. Ligação covalente do peptide fluorogenic impede a difusão do peptide e migração durante a electroforese do gel observado com anteriores métodos^9,10. Além disso, o uso de um substrato fluorogenic permite detecção direta de atividade de protease sem coloração adicionais e passos de coloração. O objectivo geral deste método é a detecção de atividade de protease em amostras biológicas através a incorporação covalente de peptídeos fluorogenic em géis de zymogram.

Protocolo

1. preparação da camada de Gel de resolução

1. Prepare uma poliacrilamida 10% resolução solução de gel, conforme tabela 1. Adicione o tempted (TEMED) e persulfato de amónio (APS) imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.
2. Encha uma gaveta de mini gel vazio 1,5 mm (5 mL) a meio caminho com a solução 10% de gel de resolução.
3. Adicione uma camada fina de isopropanol (~ 500 µ l) na parte superior do gel de polyacrylamide para produzir um gel de nível e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 40 min).

2. preparação da molécula de vinculador Azido-PEG3-maleimide

1. Enquanto a primeira camada de gel de resolução é a polimerização, recuperar o azido-PEG3-maleimide kit de armazenamento-20 ° C e permitir que os componentes atingir a temperatura. Existem dois componentes em cada kit. Frasco 1 contém um éster maleimide-NHS, um off-White para cinza sólida. Frasco 2 contém azido-PEG3-amina, um óleo ligeiramente amarelo.
   Nota: Os autores sugerem usando o kit de azido-PEG3-maleimide de 25 mg, como só pode ser armazenado por curtos períodos de tempo (1-2 horas) a-20 ° C após estar preparado antes de começar a degradar. 25 mg é suficiente para produzir 10 géis de peptídeo. Use o gel dentro de 3 semanas de preparação.
2. Dissolver os componentes do frasco 2 no fabricante recomendado volume de Dimetilsulfóxido (DMSO) e vórtice por 30 s para garantir os líquidos foram bem misturados.
3. Transferi o conteúdo do frasco 1 para um balão de fundo redondo de 100ml limpo e seco, contendo uma barra de agitação.
   Nota: Lavar o balão com acetona e secar completamente antes do uso para evitar a umidade de interferir com a reação.
4. Imediatamente coloque uma rolha de septo de borracha com um diafragma que pode ser perfurado com uma seringa na boca do balão. Trabalhe rapidamente para impedir a entrada no balão de umidade.
5. Inserir dois 18 calibre seringa de agulhas para o diafragma e se conectar a um tanque de gás inerte (por exemplo, gás argônio). Permitir que o gás inerte para encher o balão de 3 min. Misture os componentes de frascos 1 e 2 sob gás inerte para evitar que os produtos de reação indesejável.
   Atenção: A segunda agulha da seringa é fornecer um respirador, permitindo assim que o ar atmosférico contido no balão para fluir para fora do balão como enche de gás inerte. Não se esqueça de incluir uma agulha de ventilação!
6. Desligar o gás inerte e desconectá-lo da agulha. Usando uma seringa, injete o conteúdo total do frasco 2 para o balão.
7. Retire as agulhas e seringa e permitir que os componentes misturar durante 30 min à temperatura ambiente, agitando.
8. Remova o bujão de septo de borracha e transferir o conteúdo para um tubo de centrifugação de limpeza 5 mL. A solução de azido-PEG3-maleimide deve ser usada dentro de 1 hora em temperatura ambiente.

3. preparação do Peptide resolver a camada de Gel

1. Uma vez que a primeira camada de gel de resolução tem polimerizado, despeje a camada de isopropanol. Lave a parte superior do gel por pipetagem 1 mL de água desionizada na parte superior do gel e em seguida, despeje a água.
2. Recuperar o peptídeo fluorescente thiol-acrescida de armazenamento-80 ° C e deixe-a descongelar à temperatura ambiente.
   Nota: O peptídeo thiol-acrescida pode ser preparado como descrito anteriormente,^11,12. Peptídeos disponíveis comercialmente também podem ser usados, mas exigem a adição de um resíduo de cisteína terminal para permitir que o maleimide-tiol clique reação. Dissolver o peptídeo a uma concentração das ações de 10 mM e armazená-lo a-80 ° C em pequenas alíquotas (30 uL) para limitar a ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
3. Prepare um 10% de solução de solução de gel que contém a molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide e o peptídeo fluorescente conforme tabela 1. Adicione o TEMED e APS imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.
4. Encha metade da parte restante da fita gel (3 mL) com o peptídeo resolver a solução de gel.
   Nota: Uma abordagem multi-camada de gel de resolução reduz a quantidade de peptídeos e vinculador necessária para cada gel. O tamanho da camada de gel de resolução de peptídeo pode ser ajustado para acomodar uma maior gama de pesos moleculares, conforme necessário.
5. Pipete uma camada fina de isopropanol (~ 500 µ l) para o topo do gel de poliacrilamida para produzir um gel de nível e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 40 min).
   Nota: O peptídeo fluorescente é sensível à luz. Manter os géis cobertos com papel alumínio para evitar fotobranqueamento durante o desenvolvimento, a electroforese, a lavagem e a preparação do gel.
6. Despeje a camada de isopropanol e enxaguar o topo do peptide resolvendo gel com água desionizada, como no passo 3.1.
7. Se usar o gel imediatamente, avance para o passo 4, caso contrário, mergulhe os géis preparados em 100 mL de 1x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C em uma caixa de plástico para evitar que os géis de secar. Embrulhe a caixa em papel de alumínio para evitar fotobranqueamento. Géis podem ser armazenados em PBS por até 3 semanas antes do uso.

4. preparação do Gel de empilhamento

1. Prepare uma solução de gel de empilhamento de 5% conforme tabela 1. Adicione o TEMED e APS imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.
2. Preencha a parte restante vazia da fita gel (~ 2 mL) com a solução de gel de empilhamento.
3. Inserir rapidamente um pente de gel de 1,5 mm para a camada de gel de empilhamento, certificar-se de que não há bolhas permanecem presas sob os poços. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 10 min).
4. Remova cuidadosamente o pente e a fita na parte de trás da fita gel.

5. preparação de amostras biológicas para eletroforese

1. Prepare a mídia celular condicionado, lisados celulares, tecido homogenates e padrões MMP conforme descrito em outro lugar sob condições de não-redução². Não aqueça as amostras.
2. Por exemplo, prepare a mídia celular condicionado como segue:
   1. Placa 40.000 células/cm² células em uma placa de 6 em 10% de soro fetal bovino (FBS) meios de cultura. Incubar as células em uma câmara umidificada (5% CO₂ a 37 ° C) por 24 horas e permitir que alcancem a confluência de 70-80%.
      Nota: Se as células não tem atingido a confluência desejada após 24 horas, permita-lhes a crescer em meios de cultura FBS de 10% para um adicional de 24 horas.
   2. Lavar as células duas vezes com PBS e adicionar 2 mL de soro livre de meios de cultura. Incube as células em uma câmara umidificada (5% CO₂ a 37 ° C) por um adicional de 24 horas.
   3. Usando uma pipeta sorológica, colete os meios condicionados de cada poço. Centrifugue a mídia a 1200 rpm por 3 minutos remover os detritos de células. Leve o sobrenadante e concentrar-se usando um 15ml, kDa 10 unidade de filtro centrífugo corte de peso molecular. Centrifugar as unidades de filtro em 4.000 x g durante 15 minutos em um rotor de balde oscilante ou 5.000 x g, durante 15 min em um rotor de ângulo fixo.
      Nota: Este passo é opcional, mas pode aumentar a intensidade das bandas proteolíticas os géis de zimografia de peptídeo.
   4. Transferi o filtrado concentrado para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Alíquota e armazenamento de amostras a-80 ° C por até três ciclos de congelamento e descongelamento.
3. Quantificar o teor de proteínas usando um ensaio de quantificação de proteína padrão (por exemplo, BCA, ensaio de Bradford, etc.).

6. eletroforese de biológico amostras em peptídeo zimografia géis

1. Dissolver amostras no amortecedor da amostra zimografia convencional (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% de glicerol, SDS de 4%, 0,01% bromofenol). Para as amostras de células e tecidos, recomenda-se ~ 30 µ g de proteína total por bem e 50-100 ng de proteína para padrões MMP.
2. Adicione 400 mL de 1 x Tris-glicina SDS executando o Buffer para o aparelho de gel. Carrega até 35 µ l de amostra por bem. Execute os exemplos em 120 V a 4 ° C por 1,5 horas ou até que os padrões de peso molecular indicam que as proteases de interesse dentro do peptide resolver a camada de gel (que tem uma cor laranja visível).
   Nota: a maioria das MMPs e suas variantes abrangidos pela faixa de 35-100 kDa. Quando os padrões de peso molecular indicam que os pesos são dentro do peptide resolver a camada de gel, electroforese pode ser parada. O mesmo princípio pode ser aplicado a outras classes de proteases com conhecidos pesos moleculares. Se houver interesse na detecção de várias proteases sobre uma maior gama de pesos moleculares, reduzir o tamanho da camada de gel de resolução e aumentar o tamanho da camada de gel de resolução de peptídeo.
3. Após eletroforese, remover os géis de fita plástica e lave géis três vezes por 10 min cada à temperatura sob agitação suave em tampão de renaturing contendo 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl₂e 5 mM CaCl₂ em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
4. Géis de transferência para uma solução-tampão em desenvolvimento contendo 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl₂ e 5 mM CaCl₂ em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 15 min. substituir com fresco desenvolvendo solução de buffer e incubar gel a 37 ° C, sob agitação suave durante 24 horas , certificando-se que os geles são totalmente submersas na solução.

7. imagem latente do peptídeo zimografia geles

1. Após 24 horas, géis de imagem usando uma fluorescente de gel scanner/imager usando os filtros apropriados de excitação e emissão. Por exemplo, os géis de peptídeo mostrados nos resultados representativos são conjugados com fluoresceína e foi fotografados usando um filtro de excitação de 488 nm e um filtro de emissão de 521 nm. Usar os filtros adequados para seu fluoróforo irá maximizar a detecção de atividade proteolítica.
   Nota: Imagens também podem ser tomadas com um gel de tonalizador equipado com um transiluminador de UV, muitas vezes usado para o tratamento de imagens de DNA géis corados com brometo de etídio. Imagem do gel usando o transiluminador UV (365 nm) configuração e um filtro de emissão de 590 nm.
2. Conduzir a avaliação densitométricos das intensidades de banda usando o ImageJ conforme descrito em outro lugar¹³.

Resultados

Usando o método descrito aqui, dois péptidos protease-degradáveis fluorescentes foram incorporados em géis de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (abreviado como QGIW ao longo do texto e figuras) e GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (abreviado como LACW ao longo do texto e figuras). ↓ indica o local de clivagem. QGIW é um colágeno-que derivei sequência projetada para detectar colagenases celular¹⁴. LACW é uma sequência que foi ...

Discussão

As técnicas atuais de zymographic contam com a incorporação de substratos nativos em gel de poliacrilamida para a detecção de proteólise. Enquanto estas técnicas têm alcançado uso generalizado, eles ainda são limitados no número de proteases podem detectar. Aqui, um protocolo foi descrito em quais peptídeos fluorescentes, protease-degradáveis são incorporados a resolução de gel de poliacrilamida. Ligações covalentes acoplamento usando uma molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide permite a separaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086