형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

요약

여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.

초록

이 방법의 목적은 복잡 한 생물 학적 샘플의 분해 활동을 측정 하는 것입니다. 샘플 분자량 분해성 기판 임베디드 해결 젤 통해 전기 이동 법을 사용 하 여 구분 됩니다. 이 방법은 다릅니다 전통적인 젤 zymography에서 담금질된 fluorogenic 펩 티 드 covalently 전체 길이 단백질, 젤라틴 또는 카 세 인 등 대신 해결 젤에 통합 됩니다. Fluorogenic 펩 티 드의 사용에는 추가 착 단계 없이 분해 활동의 직접 감지 수 있습니다. 생물 학적 샘플 내에서 효소 쪼개 침묵과 fluorogenic 펩 티 드, 형광에 있는 증가 결과로. 젤에 형광 신호 다음 표준 형광 젤 스캐너로 몇 군데 이며 densitometry를 사용 하 여 계량 합니다. 분해성 기판으로 펩 티 드를 사용 하 여 크게 zymographic 기술로 감지 가능한 프로 테아 제를 확장합니다.

서문

젤 zymography은 생물 학적 샘플, 체액 세포 배양^1,2,3등 분해 활동을 측정 하는 생물학 기술입니다. 샘플 그들의 분자 무게 분해성 기판 임베디드 polyacrylamide 젤을 통해 전기 이동 법으로 구분 됩니다. 젤라틴, 카 세 인, 콜라겐과 엘라 스 틴, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, 및-11, cathepsins^1,2 의 다양 한 뿐만 아니라의 활동을 측정 하기 위해 사용 된 일반적인 분해성 기판 포함 ^{, 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. 후 전기 이동 법, 효소 renatured와 젤 내 단백질을 저하 될 수. 전통적인 젤 zymography, 젤 Coomassie 파란 등 단백질 염료와 스테인드 하 고 효소 활동 즉, 흰색 밴드 (단백질의 저하)는 진한 파란색 배경에 신호의 손실으로 감지 합니다.

여기, 우리는 젤 zymography, 있는 분해성 기판은 짧은, fluorogenic 펩 티 드 covalently polyacrylamide 젤 (그림 1)에 통합 하는 대체 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 분해성 기판으로 합성 펩 티 드의 대체 기본 단백질⁹전통적인 젤 zymography에 비해 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다. Fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 펩 티 드 보급 및 이전 방법^9,10관찰 하는 젤 전기 이동 법 동안 마이그레이션 방지 합니다. 또한, fluorogenic 기판의 사용은 추가 얼룩-얼룩 단계 없이 프로 테아 제 활동의 직접 검출을 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 zymogram 젤에서 fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 통해 생물학 견본에서 효소 활동의 탐지.

프로토콜

1입니다. 해결 젤 층의 준비

1. 10 %polyacrylamide 젤 솔루션 표 1에 의하여 해결을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 Tetramethylethylenediamine (TEMED)와 암모늄 Persulfate (AP)를 추가 합니다.
2. 10% 해결 젤 솔루션 빈 1.5 m m 미니 젤 카세트 절반 방법 (5 mL)을 작성.
3. 레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 레이어를 추가 합니다. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응은 완료 (40 분)입니다.

2. Azido-PEG3-maleimide 링커 분자의 준비

1. 첫 번째 해결 젤 레이어 polymerizing 동안-20 ° C 저장에서 azido-PEG3-maleimide 키트를 검색 하 고 실내 온도 도달 하는 구성 요소를 허용. 각 키트에는 두 개의 구성 요소가 있습니다. 유리병 1 maleimide-NHS 에스테 르를, 회색 단색 미색에 포함 되어 있습니다. 유리병 2 azido-PEG3-아민, 약간 노란색 오일에 포함 되어 있습니다.
   참고: 저자 제안만 시간 (1-2 시간)의 짧은 기간 동안 저장할 수로 25 mg azido-PEG3-maleimide 키트를 사용 하 여-20 ° C에서 저하을 시작 하기 전에 준비 되 고 후. 25 밀리 그램 10 펩 티 드 젤을 생산 하기 위해 충분 하다. 준비의 3 주 안에 젤을 사용 합니다.
2. 제조업체에서 권장 하는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 30에 대 한 소용돌이의 볼륨에서 유리병 2의 구성 요소를 분해 s 액체 되도록 잘 혼합 되어있다.
3. 파문 bar가 포함 된 깨끗 하 고 마른 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 유리병 1의 내용을 전송 합니다.
   참고: 아세톤과 플라스 크를 헹 구 고 습기 반응에 방해가 되지 않도록 하려면 사용 하기 전에 완전히 건조.
4. 즉시 플라스 크의 입으로는 주사기 구멍 수는 막으로 고무 심장 마 개를 삽입 합니다. 플라스 크에 들어가기에서 습기를 방지 하기 위해 신속 하 게 작동 합니다.
5. 삽입 2 18 게이지 횡 경 막에 바늘 주사기 하 고 하나는 불활성 가스 탱크 (예: 아르곤 가스)를 연결 합니다. 3 분 믹스에 대 한 플라스 크를 채우기 위해 불활성 가스 튜브 1 2 불활성 가스에서 방지 하 고 바람직하지 않은 반응 제품의 구성 요소를 허용 합니다.
   주의: 두 번째 주사기 바늘 불활성 가스로 채우고 플라스 크에서 흐름을 플라스 크에 포함 된 대기 공기 수 있도록 통풍구를 제공 하는. 환기 바늘을 포함 하는 것을 잊지 마세요!
6. 불활성 가스에서 종료 하 고 바늘에서 분리. 주사기를 사용 하 여 플라스 크에 유리병 2의 전체 내용을 삽입할.
7. 바늘과 주사기를 제거 하 고 교 반 하면서 실 온에서 30 분 동안 혼합 구성 요소를 허용 합니다.
8. 고무 심장 마 개를 제거 하 고 깨끗 한 5 mL 원심 분리기 튜브에 콘텐츠를 전송. Azido-PEG3-maleimide 솔루션은 실 온에서 1 시간 안에 사용 되어야 한다.

3. 젤 레이어를 해결 하는 펩 티 드의 준비

1. 첫 번째 해결 젤 레이어 생산은, 일단 소 프로 파 놀 레이어 붓는 다. 젤 상단 pipetting 1 mL 젤 상단에 있는 이온된 수로 린스 하 고 물을 붓는 다.
2. -80 ° C 저장소에서 thiol 기능성된 형광 펩 티 드를 검색 하 고 실 온에서 해 동 있습니다.
   참고: 앞에서 설명한^11,12thiol 기능성된 펩 티 드를 준비 될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 펩 티 드 또한 사용 될 수 있습니다 하지만 maleimide thiol 있도록 터미널 시스테인 잔류물의 추가 클릭 반응 필요. 10 m m 재고 농도에 펩 티 드를 분해 하 고 반복된 freeze-thaw 주기를 제한 하는 작은 (30 uL) aliquots에서-80 ° C에서 그것을 저장.
3. Azido-PEG3-maleimide 링커 분자 및 표 1에 의하여 형광 펩 티 드를 포함 하는 젤 솔루션 해결 10%를 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 APS와 TEMED를 추가 합니다.
4. 펩 티 드 젤 솔루션을 해결 절반 젤 카세트 (3 mL)의 나머지 부분을 채우십시오.
   참고: 다중 층 해결 젤 접근 펩 티 드와 각 젤에 필요한 링커의 줄어듭니다. 펩 티 드 해결 젤 층의 크기는 필요에 따라 분자 무게의 더 큰 범위에 맞게 조정할 수 있습니다.
5. 레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 층을 플라스틱. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응은 완료 (40 분)입니다.
   참고: 형광 펩타이드는 빛에 민감한. 젤 젤 준비, 전기, 세탁 및 개발 하는 동안 photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일로 덮여 유지.
6. 소 프로 파 놀 레이어 부 어 해결 단계 3.1에서 이온된 수 젤 펩 티 드의 상단을 씻어.
7. 경우 4 단계로 진행 즉시는 젤을 사용 하 여, 그렇지 않으면, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)는 젤 밖으로 건조 하지 않도록 플라스틱 상자에 4 ° C에서 x 1의 100 mL에 준비 된 젤을 담가. Photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일에 상자를 포장. 젤은 사용 전에 최대 3 주 동안 PBS에 저장할 수 있습니다.

4입니다. 겹쳐 쌓이는 젤의 준비

1. 표 1당 5%의 스태킹 젤 솔루션을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 APS와 TEMED를 추가 합니다.
2. 겹쳐 쌓이는 젤 솔루션 젤 카세트 (~ 2 mL)의 남은 빈 부분을 채우십시오.
3. 신속 하 게 1.5 m m 젤 빗 쌓기 젤 레이어 삽입, 확신 없는 거품 남아 있다 우물 아래 갇혀. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응 완료 (~ 10 분)입니다.
4. 부드럽게 빗 및 테이프 젤 카세트의 뒷면에서 제거 합니다.

5입니다. 전기 이동 법에 대 한 생물 학적 샘플의 준비

1. 비 감소 조건²아래 설명 되어 있는 대로 조절된 세포, 세포 lysates, 조직 homogenates, 언론과 MMP 표준 준비. 샘플이 열 하지 마십시오.
2. 예를 들어 다음과 같이 조건된 셀 미디어를 준비 하십시오.
   1. 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 문화 미디어에 6 잘 플레이트에 플레이트 40, 000 셀/cm² 셀. 24 시간 동안 습도 챔버 (5% CO₂ 37 ° C에서)에 셀을 품 어 고 합류 70-80%에 도달 하도록 허용 합니다.
      참고: 셀 24 시간 후 원하는 confluency를 도달 하지 않은 경우 추가 24 시간에 대 한 10 %FBS 문화 매체에서 성장 하도록 허용 합니다.
   2. PBS로 두 번 셀을 세척 하 고 혈 청 자유로운 문화 매체의 2 개 mL를 추가. 추가 24 시간 동안 습도 챔버 (5% CO₂ 37 ° C에서)에 셀을 품 어.
   3. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 각 우물에서 바른된 미디어를 수집 합니다. 어떤 세포 파편을 제거 하려면 3 분 1200 rpm에서 미디어 원심 상쾌한 고 15 mL, 10 kDa 분자량 컷오프 원심 필터 단위를 사용 하 여 집중. X g 진동 물통 회전자에서 15 분 또는 고정된 각도 터에 15 분 동안 5000 x g 4000에서 필터 단위 원심
      참고:이 단계는 선택 사항 하지만 펩 티 드 zymography 젤에서 분해 밴드의 강도 향상 시킬 수 있습니다.
   4. 신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 집중 된 여과 액을 전송 합니다. 최대 3 개의 freeze-thaw 주기-80 ° C에서 약 수와 매장 샘플.
3. 계량 표준 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 단백질 콘텐츠 (예: BCA, Bradford 분석 실험, 등).

6. 펩 티 드 Zymography 젤에서 전기 이동 법 생물의 샘플

1. 기존의 zymography 샘플 버퍼에서 샘플을 분해 (62.5 mM Tris HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 4 %SDS, 0.01 %bromophenol 블루). 세포 및 조직 샘플 잘 당 총 단백질의 ~ 30 µ g을 사용 하는 것이 좋습니다, 그리고 MMP 표준 단백질의 50-100 ng.
2. 추가 1의 400 mL 젤 기구 하 트리 스-글리신 SDS 실행 버퍼 x. 잘 당 샘플의 최대 35 µ L을 로드 합니다. 1.5 시간 또는 분자량 표준 관심의 프로 테아 제 펩 티 드 (이 보이는 오렌지 색상) 젤 레이어를 해결 내는 나타냅니다 때까지 4 ° C에서 120 V에서 샘플을 실행 합니다.
   참고: 대부분 MMPs와 그들의 이체 35-100 kDa의 범위 내에서을. 분자량 표준 나타냅니다 그 무게 젤 레이어를 해결 하는 펩 티 드 내, 전기 이동 법 중지 될 수 있습니다. 동일한 원리는 알려진된 분자 무게와 프로 테아의 다른 클래스에 적용할 수 있습니다. 분자 무게의 더 큰 범위에 걸쳐 여러 프로 테아 제를 감지 하는에 관심이 있다면, 해결 젤 계층의 크기를 줄일 하 고 펩 티 드 해결 젤 계층의 크기를 증가.
3. 전기 이동 법, 플라스틱 카세트에서는 젤을 제거 하 고 2.5% 트라이 톤 X-100, 1 µ M ZnCl₂, 그리고 50 m m에서 5 mM CaCl₂ renaturing 버퍼에 부드러운 동요에서 실내 온도에 3 시간 10 분 대 한 젤을 씻어 Tris HCl, pH 7.5
4. 전송 개발 버퍼 솔루션을 포함 하는 1% 트라이 톤 X-100, 1 µ M ZnCl₂ 젤 및 50 mM Tris HCl, 신선한 개발 15 분 바꾸기 위한 pH 7.5에에서 5mm CaCl₂ 솔루션을 버퍼링 하 고 24 시간 동안 부드러운 동요에서 37 ° C에서 젤을 품 어 는 젤 솔루션에서 submersed 완벽 하 게는 다는 것을 확인.

7. 영상 펩 티 드 Zymography의 젤

1. 24 시간 후에 형광을 사용 하 여 이미지 젤 젤 스캐너/영상 적절 한 여기 및 방출 필터를 사용 하 여. 예를 들어 대표적인 결과에 표시 된 펩 티 드 젤 Fluorescein로 활용 하 고 488의 여기 필터를 사용 하 여 몇 군데 있었다 nm와 521의 방출 필터 nm. 당신의 fluorophore에 대 한 적절 한 필터를 사용 하 여 분해 활동의 탐지를 극대화할 것입니다.
   참고: 이미지 또한 ethidium 평범한 사람으로 물 DNA 젤의 이미지를 위해 자주 사용 하는 UV transilluminator을 갖춘 젤 영상을 함께 취할 수 있습니다. 젤 UV transilluminator를 사용 하 여 이미지 (365 nm) 설정 및 590의 방출 필터 nm.
2. ImageJ¹³설명 되어 있는 대로 사용 하 여 밴드 농도의 densitometric 평가 실시 합니다.

결과

여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 두 개의 형광 효소 분해 펩 티 드 polyacrylamide 젤에 통합 했다: GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (텍스트와 그림을 통해 QGIW로 약식)와 GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (텍스트와 그림을 통해 LACW로 약식). ↓ 분열의 위치를 나타냅니다. QGIW는 콜라겐은-난 파생 시퀀스 세포 collagenases¹⁴을 탐지 하도록 설계 되었습니다. LACW는 MMP ...

토론

현재 zymographic 기법으로 polyacrylamide 젤 베이스의 검출에 대 한 기본 기판의 설립에 의존합니다. 이러한 기술을 광범위 하 게 사용을 얻고 있다, 하는 동안 그들은 여전히 프로 테아 제 감지할 수의 숫자에 제한 됩니다. 여기, 프로토콜은 형광, 효소 분해 펩 티 드에 polyacrylamide 젤 해결에 통합 하는 설명 했다. 사용 하 여 연결 공유는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자 수 있습니다 분리 및 다양 한 프로 테아?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086