Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

Özet

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Özet

Bu yöntemin amacı karmaşık biyolojik örneklerin proteolitik aktivite ölçmek etmektir. Örnekleri moleküler ağırlık kullanarak Elektroforez ile parçalanabilir bir substrat gömülü bir çözme jel ile ayrılır. Bu yöntem bir yüzeyi fluorogenic peptid kovalent jelatin veya kazein gibi tam uzunlukta proteinler yerine çözme jel içine dahil geleneksel jel zymography farklıdır. Fluorogenic peptidler proteolitik aktivite ek boyama adımları olmadan doğrudan algılama sağlar. Biyolojik örnekler içinde enzimler floresans içinde bir artış kaynaklanan çeliklerini fluorogenic peptid ayırmak. Jelleri floresan sinyalin sonra Standart Floresan jel tarayıcıyla görüntüsü ve Dansitometresi kullanarak sayılabilir. Parçalanabilir substrat olarak peptidler kullanımı büyük ölçüde zymographic teknikleri ile tespit mümkün proteaz genişletir.

Giriş

Jel zymography biyolojik örnekleri, vücut sıvıları veya hücre kültür medya^1,2,3gibi içinde proteolitik aktivite ölçmek için kullanılan biyolojik bir tekniktir. Örnekleri onların moleküler ağırlıkları aracılığıyla parçalanabilir bir substrat ile gömülü bir polyacrylamide jel elektroforez ile ayrılır. Jelatin, kazein, kolajen ve elastin, matriks metalloproteinazların (MMPs) -1, -2, -3 -7 -8, -9 ve cathepsins^1,2 çeşitli ek -11 etkinliğini ölçmek için kullanılan ortak parçalanabilir yüzeylerde dahil ^{, 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. sonra Elektroforez, enzim renatured vardır ve jel içinde protein düşmesine izin. Geleneksel jel zymography, jel Coomassie mavi gibi bir protein boya lekeli ve proteaz aktivitesi Yani, beyaz şeritler (protein yıkımı) koyu mavi zemin üzerine sinyal, bir kaybı algılanır.

Burada, jel zymography parçalanabilir substrat kısa bir fluorogenic peptid kovalent polyacrylamide jel (Şekil 1) dahil olduğu, alternatif bir yöntem için bir protokol açıklayın. Sentetik peptidler ikame olarak parçalanabilir yüzeylerde proteaz geleneksel jel zymography yerli protein⁹ile karşılaştırıldığında daha geniş olarak algılanmasını sağlar. Fluorogenic peptid kovalent bağ peptid difüzyon ve geçiş sırasında jel elektroforez ile önceki yöntemleri^9,10gözlenen engeller. Ayrıca, bir fluorogenic substrat kullanımı ek boyama ve de-boyama adımları proteaz aktivitesinin doğrudan algılama sağlar. Bu yöntem genel amacı fluorogenic peptidler zymogram jeller, kovalent Incorporation aracılığıyla biyolojik örneklerde proteaz aktivitesinin algılama olduğunu.

Protokol

1. çözme jel katman hazırlanması

1. Jel çözüm Tablo 1göre çözme bir % 10 polyacrylamide hazırlayın. Tetramethylethylenediamine (TEMED) ve amonyum Persülfat (APS) onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
2. Bir boş 1.5 mm mini jel kaset yarı yolda (5 mL) % 10 çözme jel çözüm ile doldurun.
3. Bir düzey jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için polyacrylamide jel üstüne ince bir tabaka halinde isopropanol (~ 500 µL) ekleyin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir.

2. Azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül hazırlanması

1. İlk çözme jel katman polymerizing, azido-PEG3-maleimide seti-20 ° C depolama--dan almak ve oda sıcaklığında ulaşmak bileşenleri sağlar. Her kit içinde iki bileşeni vardır. Şişe 1 maleimide-NHS ester, bir off-beyaz gri katı için içerir. Şişe 2 azido-PEG3-Amin, biraz sarı yağ içerir.
   Not: Yazarlar yalnızca kısa bir süre (1-2 saat) için saklanabilir gibi 25 mg azido-PEG3-maleimide kiti kullanmanızı-20 ° C'de aşağılamak başlamadan önce sonra hazırlıklı olmak öneririz. 25 mg 10 peptid jelleri üretmek yeterli olur. Jelleri hazırlık 3 hafta içinde kullanın.
2. Şişe 2 bileşenlerinde hacmi dimetil sülfoksit (DMSO) ve 30 için girdap tavsiye üreticisi dağıtılması sıvılar sağlamak için s-var karışık şey.
3. Şişe 1 içeriği bir heyecan çubuğunu içeren bir temiz, Kuru 100 mL yuvarlak alt şişesi aktarın.
   Not: şişeye aseton ile durulayın ve nem ile reaksiyonu engellemesini önlemek için kullanım önce kurumasını.
4. Hemen bir kauçuk septum tıpa şırıngayla balonun ağız içine delinmiş bir diyafram ile ekleyin. Hızlı nem şişeye girmesini önlemek için çalışın.
5. Ekle iki 18 gauge iğne diyafram şırınga ve bir asal gaz tankı (Örneğin argon gazı) birine bağlayın. 3 dk. Mix şişeye doldurmak için asal gaz tüpleri 1 ve 2 inert gaz altında istenmeyen reaksiyon ürünleri önlemek için bileşenleri sağlar.
   Dikkat: İkinci şırınga iğne böylece inert gaz ile doldurur gibi dışarı şişeye akmaya balonun içindeki atmosferik hava izin veren bir havalandırma sağlamaktır. Havalandırma iğne eklemeyi unutmayın!
6. İnert gaz kapalı kapa ve iğneden bağlantısını kesin. Bir Ģırınga kullanarak, şişe 2 tam içeriğini balonun enjekte.
7. İğne ve şırınga kaldırmak ve karıştırma sırasında oda sıcaklığında 30 dakika karıştırmak bileşenleri sağlar.
8. Ve içeriği bir temiz 5 mL santrifüj tüpü transfer kauçuk septum tıpa çıkarın. Azido-PEG3-maleimide çözüm oda sıcaklığında 1 saat içinde kullanılmalıdır.

3. jel katman çözme peptid hazırlanması

1. Sonra ilk çözme jel katman polimerli, isopropanol katman dökün. Pipetting 1 mL deiyonize su üstünde jel tarafından jel üst durulama ve sonra suyu dökün.
2. -80 ° C depodan thiol functionalized floresan peptid almak ve oda sıcaklığında erimek izin.
   Not: Thiol functionalized peptid^11,12daha önce açıklandığı gibi hazır olun. Piyasada bulunan peptidler de kullanılabilir ama maleimide thiol etkinleştirmek için terminal sistein kalıntıları eklenmesi tıklatın tepki gerektirir. 10 mM bir hisse senedi konsantrasyon için peptid erimesi ve tekrar tekrar donma-çözülme çevrimleri sınırlamak için küçük (30 uL) aliquots içinde-80 ° C'de saklayın.
3. % 10 azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ve Tablo 1göre floresan peptid içeren jel çözüm çözme hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
4. Jel kaset (3 mL) kalan bölümünün yarısını jel çözüm çözme peptid ile doldurun.
   Not: Bir çok katmanlı çözme jel yaklaşım peptid ve bağlayıcı her jel için gerekli miktarını azaltır. Peptid çözme jel katman boyutunu gerektiği gibi moleküler ağırlık daha büyük bir dizi karşılamak için ayarlanabilir.
5. İsopropanol (~ 500 µL) ince bir tabaka polyacrylamide düzey bir jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için jel tepesine pipette. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir.
   Not: Floresan peptid ışığa duyarlı olduğunu. Photobleaching jel hazırlık, Elektroforez, çamaşır ve geliştirme sırasında önlemek için alüminyum folyo ile kaplı jelleri tutun.
6. İsopropanol katman dökün ve jel gibi adım 3.1 deiyonize su ile çözme peptid üst durulayın.
7. Adım 4'e jelleri hemen, kullanmaya devam ederseniz, aksi takdirde, 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) jeller kurumasını önlemek için plastik bir kutu içinde 4 ° C'de x 100 ml hazırlanmış jelleri bırakın. Photobleaching önlemek için alüminyum folyo kutusunda sarın. Jelleri PBS içinde 3 hafta kadar önce kullanım için saklanır.

4. yığın jel hazırlanması

1. Bir % 5 yığın jel çözüm Tablo 1göre hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
2. Jel kaset (~ 2 mL) boş kalan kısmı yığın jel çözüm ile doldurun.
3. Hızlı bir şekilde bir 1.5 mm jel tarak hava kabarcığı yok wells altında sıkışıp kalır emin yığın jel katmanına yerleştirin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 10 dk) tepkidir.
4. Yavaşça tarak ve kaseti jel kaset arkasından çıkarın.

5. Elektroforez için biyolojik örnek hazırlanması

1. Klimalı hücre medya, hücre lysates, doku homogenates ve MMP standartları başka bir yerde sigara azaltarak koşulları²altında açıklandığı şekilde hazırlayın. Örnekleri ısı değil.
2. Örneğin, aşağıdaki gibi şartına hücre medya hazırlayın:
   1. Plaka 40.000 hücreleri/cm² hücrelerin % 10 fetal Sığır serum (FBS) Kültür medya bir 6-şey plaka. Hücrelere oksijen odası (%5 CO₂ 37 ° C'de) için 24 saat kuluçkaya ve % 70-80 izdiham ulaşmak izin.
      Not: hücreleri istenilen confluency 24 saat sonra ulaşılmış, ek bir 24 saat boyunca % 10 FBS kültür medyada büyümeye izin.
   2. PBS iki kez hücrelerle yıkama ve 2 mL serum serbest Kültür medya ekleyin. Oksijen odası (%5 CO₂ 37 ° C'de) hücrelerde için ek bir 24 saat kuluçkaya.
   3. Serolojik pipet kullanarak, klimalı ortam her kuyudan toplamak. Herhangi bir hücre artıkları kaldırmak 3 dakika için 1200 rpm'de medya santrifüj kapasitesi. Süpernatant al ve kullanarak 15 mL, 10 kDa molekül ağırlığı kesme santrifüj filtre ünitesi konsantre ol. 4000 x g sallanan bir kova Open End 15 dakika veya 15 dakika içinde bir sabit açılı rotor 5000 x g filtre daxilində santrifüj kapasitesi.
      Not: Bu adım isteğe bağlıdır ancak peptid zymography jeller proteolitik bantlarında şiddetini artırabilir.
   4. Konsantre filtrate taze 1,5 mL santrifüj tüpü aktarın. Aliquot ve mağaza örnekleri-80 ° c ilâ üç donma-çözülme döngüsü.
3. Protein içeriği bir standart protein miktar tahlil kullanarak ölçmek (Örneğin BCA, Bradford tahlil, vb).

6. biyolojik Elektroforez peptid Zymography jeller örnekleri

1. Geleneksel zymography örnek arabellek örneklerinde dağıtılması (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 25 gliserol, % 4 SDS, %0.01 bromophenol mavi). Hücre ve doku örnekleri için ~ 30 µg iyi başına toplam protein tavsiye edilir ve 50-100 ng protein MMP standartları için.
2. 1 400 mL ekleyin jel aparatı Tris-glisin SDS çalıştıran arabelleğe x. Örnek iyi başına 35 µL yükleyin. 1,5 saat ya da moleküler ağırlık standartları faiz proteaz (görünür bir portakal rengi olan) jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirtecek kadar 120 V 4 ° C'de örnekleri çalıştırmak.
   Not: Çoğu MMPs ve onların türevleri 35-100 kDa aralığı içinde düşer. Moleküler Ağırlık standartlarını o ağırlıkları jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirttiğinizde, Elektroforez durdurulabilir. Aynı prensip diğer sınıfların proteaz bilinen moleküler ağırlıkları ile uygulanabilir. Moleküler ağırlık daha büyük bir dizi üzerinde birden fazla proteaz algılama bir ilgi ise, çözme jel katman boyutunu ve peptid çözme jel katman boyutunu artırın.
3. Elektroforez, jelleri Plastik kaset kaldırmak ve nazik ajitasyon %2.5 Triton X-100, 1 µM ZnCl₂ve 5 mM CaCl₂ 50 mM'içeren renaturing tampon altında oda sıcaklığında jelleri 10 min için üç kez yıkamak Tris-HCl, pH 7.5.
4. Transfer % 1'i içeren gelişmekte olan bir arabellek çözüm Triton X-100, 1 µM ZnCl₂ jelleri ve 5 mM CaCl₂ . 50 mM Tris-HCl, taze geliştirme ile pH 7.5 15 dk. eski yerine koymak için çözüm tampon ve jelleri 24 saat nazik ajitasyon altında 37 ° C'de kuluçkaya , jelleri tam çözümde örtülü emin olmak istedim.

7. görüntüleme peptid Zymography jelleri

1. 24 saat sonra tarayıcı/Imager uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanarak bir floresan kullanarak görüntü jelleri jel. Örneğin, temsilcisi sonuçlarında gösterilen peptid jelleri floresein ile Birleşik ve 488 bir uyarma filtre kullanarak yansıma nm ve bir emisyon filtresi 521 nm. Senin fluorophore için uygun filtreler kullanarak proteolitik aktivite tespiti en üst düzeye çıkarır.
   Not: Görüntüleri de DNA jelleri etidyum bromür ile lekeli görüntüleme için sık kullanılan bir UV transilluminator ile donatılmış bir jel Imager ile alınabilir. UV transilluminator kullanarak jelleri görüntü (365 nm) ayarı ve bir emisyon filtre 590 nm.
2. Başka bir yerde¹³açıklandığı gibi ImageJ kullanarak bant yoğunluklarını densitometric değerlendirme yapmak.

Sonuçlar

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, iki floresan proteaz parçalanabilir peptidler polyacrylamide jeller dahil edilmiştir: GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (metin ve resimler QGIW kısaltılır) ve GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (metin ve resimler LACW kısaltılır). ↓ dekolte sitesi gösterir. QGIW olan bir kollajen-hücresel collagenases¹⁴algılamak için tasarlanmış sıra türetilmiş. LACW MMP-14 ve MMP-11¹⁵te...

Tartışmalar

Geçerli zymographic teknikleri yerel yüzeylerde birleşme polyacrylamide jeller proteolizis tespiti için içine güveniyor. Bu teknikler yaygın kullanımı topladı sahip iken, onlar-ebilmek bulmak proteaz sayısında hala sınırlıdır. Burada, bir protokol hangi floresan, proteaz parçalanabilir peptidler jel çözme polyacrylamide dahil edilmiştir tanımlanmıştır. Kovalent kullanarak kaplin bir azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ayrılık ve proteaz daha çok tespiti ile yerel yüzeylerde Şu anda ula...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086