Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour une technique mis à jour le zymographic dans lequel les peptides fluorescents sont utilisés comme substrat biodégradable en lieu et place des protéines natives. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans zymogrammes de peptides fluorescents permet la détection d’un plus large éventail de protéases que les techniques de zymographic précédente.

Résumé

Le but de cette méthode est de mesurer l’activité protéolytique des échantillons biologiques complexes. Les échantillons sont séparés par le poids moléculaire en utilisant l’électrophorèse par un gel résolution intégré avec un substrat biodégradable. Cette méthode diffère de zymographie gel traditionnel qu’un peptide fluorogène trempé est par covalence incorporé dans le gel résolution au lieu de protéines pleine longueur, tels que la gélatine ou de la caséine. Utilisation des peptides fluorogène permet une détection directe de l’activité protéolytique sans coloration des étapes supplémentaires. Enzymes dans les échantillons biologiques fendent le peptide fluorogène trempés, résultant en une augmentation de fluorescence. Le signal fluorescent dans les gels est alors photographié avec un scanner de gel fluorescent standard et quantifiées par densitométrie. L’utilisation de peptides comme le substrat biodégradable élargit considérablement les protéases possibles détectables avec les techniques de zymographic.

Introduction

Zymographie gel est une technique biologique utilisée pour mesurer l’activité protéolytique dans des échantillons biologiques, tels que des fluides corporels ou des milieux de culture de cellule pour^1,2,3. Les échantillons sont séparées par leurs poids moléculaires avec électrophorèse par un gel de polyacrylamide embarqué avec un substrat biodégradable. Substrats dégradables communs incluent gélatine, caséine, collagène et élastine, qui ont été utilisés pour mesurer l’activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 et -11, en plus d’une variété de cathepsines^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. après électrophorèse, les enzymes sont renaturé et laisse se pour dégrader les protéines dans le gel. En gel traditionnel zymographie, le gel est coloré avec un colorant de la protéine, comme le bleu de Coomassie, et activité de la protéase est détectée comme une perte de signal, c'est-à-dire blanc bandes (dégradation des protéines) sur un fond bleu foncé.

Nous décrivons ici un protocole pour une autre méthode de gel zymographie, dans laquelle le substrat biodégradable est un court, peptide fluorogénique par covalence incorporé dans le gel de polyacrylamide (Figure 1). La substitution de peptides synthétiques comme les substrats dégradables permet la détection d’un plus large éventail de protéases contre zymographie gel traditionnel avec des protéines natives⁹. Liaison covalente du peptide fluorogène empêche la diffusion de peptide et de migration au cours de l’électrophorèse sur gel, observée avec les précédentes méthodes^9,10. De plus, l’utilisation d’un substrat fluorogène permet la détection directe de l’activité de la protéase sans coloration supplémentaire et étapes de coloration. L’objectif général de cette méthode est la détection de l’activité protéase dans des échantillons biologiques via l’incorporation covalente des peptides fluorogéniques dans les gels zymogramme.

Protocole

1. préparation de la couche de Gel résolution

1. Préparer un 10 % de polyacrylamide résoudre solution de gel conformément au tableau 1. Ajouter la Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et le Persulfate d’Ammonium (APS) immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.
2. Remplir une cassette de mini gel de vide de 1,5 mm à mi-chemin (5 mL) avec la solution de gel résolution de 10 %.
3. Ajoutez une fine couche d’isopropanol (~ 500 µL) en haut du gel polyacrylamide de produire un gel niveau et éviter les bulles. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 40 min).

2. préparation de la molécule Azido-PEG3-maléimide Linker

1. Alors que la première couche de gel résolution est polymérisant, récupérer le kit azido-PEG3-maléimide du stockage-20 ° C et laisser les composants à température ambiante. Il y a deux composantes dans chaque kit. Flacon 1 contient un ester maléimide-NHS, un blanc cassé au gris solide. Flacon 2 contient azido-PEG3-amine, une huile légèrement jaune.
   Remarque : Les auteurs vous suggérons d’utiliser le kit d’azido-PEG3-maléimide 25 mg car il ne peut être stocké pendant de courtes périodes de temps (1 à 2 heures) à-20 ° C après être préparé avant de commencer à se dégrader. 25 mg est suffisante pour produire 10 gels de peptide. Utiliser des gels dans les 3 semaines de préparation.
2. Dissoudre les composants du flacon 2 dans le fabricant recommandé volume de diméthylsulfoxyde (DMSO) et vortexer pendant 30 s pour assurer les liquides ont été bien mélangés.
3. Transvaser le contenu du flacon 1 dans un ballon à fond rond propre et sec 100 mL contenant une barre de remuer.
   Remarque : Rincer le ballon avec de l’acétone et sécher complètement avant utilisation pour empêcher l’humidité d’interférer avec la réaction.
4. Insérer immédiatement un bouchon en caoutchouc de cloison avec un diaphragme qui peut être percé avec une seringue dans la bouche du ballon. Travailler rapidement pour empêcher l’humidité d’entrer dans la fiole.
5. Insérer deux 18 jauge aiguilles de seringues dans le diaphragme et connecter l’un à un réservoir de gaz inerte (gaz argon,etc. ). Laisser le gaz inerte pour remplir la fiole pendant 3 min. mélanger les composants des flacons 1 et 2 sous gaz inerte pour éviter que des produits de réaction indésirable.
   Attention : La deuxième aiguille de seringue est de fournir un évent, permettant ainsi à l’air atmosphérique, contenue dans le ballon s’écouler de la fiole qu’il remplit de gaz inerte. N’oubliez pas d’inclure une aiguille de vent !
6. Couper le gaz inerte et retirez-le de l’aiguille. À l’aide d’une seringue, injecter la totalité du contenu du flacon 2 dans la fiole.
7. Retirer les aiguilles et seringues et laisser les composants à mélanger pendant 30 min à température ambiante tout en remuant.
8. Enlever le bouchon du septum en caoutchouc et verser le contenu dans un tube à centrifuger propre de 5 mL. La solution azido-PEG3-maléimide doit être utilisée au sein de 1 heure à température ambiante.

3. préparation du Peptide résoudre la couche de Gel

1. Une fois la première couche de gel résolution a polymérisé, décanter la couche de l’isopropanol. Rincez la partie supérieure du gel par pipetage 1 mL d’eau désionisée sur le dessus du gel et puis versez l’eau.
2. Extraire le peptide fluorescent fonctionnalisés thiol du stockage de-80 ° C et laisser décongeler à température ambiante.
   Remarque : Le peptide fonctionnalisés thiol peut être préparé comme décrit plus haut^11,12. Peptides disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés, mais exigent l’ajout d’un résidu cystéine terminale pour permettre le maléimide-thiol cliquez sur réaction. Dissoudre le peptide à une concentration de stock de 10 mM et conserver à-80 ° C dans de petites aliquotes (30 uL) pour limiter les cycles répétés de gel-dégel.
3. Préparer une solution de gel contenant la molécule azido-PEG3-maléimide linker et le peptide fluorescent conformément au tableau 1de résoudre de 10 %. Ajouter le TEMED et APS immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.
4. Remplir la moitié de la portion restante de la cassette de gel (3 mL) avec le peptide résoudre solution de gel.
   Remarque : Une approche multicouche de gel résolution réduit la quantité de peptide et linker nécessaire à chaque gel. La taille de la couche de gel résolution de peptide est réglable pour s’adapter à un plus large éventail de poids moléculaires au besoin.
5. Pipeter une mince couche d’isopropanol (~ 500 µL) vers le haut du gel polyacrylamide de produire un gel niveau et éviter les bulles. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 40 min).
   Remarque : Le peptide fluorescent est sensible à la lumière. Garder les gels recouverts de papier aluminium pour éviter le Photoblanchiment au développement, électrophorèse, lavage et préparation du gel.
6. Décanter la couche isopropanol et rincer la partie supérieure du peptide résoudre le gel avec de l’eau désionisée comme au point 3.1.
7. Si utiliser les gels immédiatement, passez à l’étape 4, dans le cas contraire, immergez les gels préparés dans 100 mL de 1 x tamponné phosphate salin (PBS) à 4 ° C dans une boîte en plastique pour éviter les gels ne se dessèchent pas. Envelopper la boîte en papier d’aluminium pour éviter le Photoblanchiment. Gels peuvent être stockées dans du PBS jusqu'à 3 semaines avant son utilisation.

4. préparation du Gel empilable

1. Préparer une solution de gel empilage de 5 % selon le tableau 1. Ajouter le TEMED et APS immédiatement avant de couler le gel comme leur ajout initie la réaction de polymérisation.
2. Remplir la partie restante de vide de la cassette de gel (environ 2 mL) avec la solution de gel empilage.
3. Insérer rapidement un peigne de gel de 1,5 mm dans la couche de gel d’empilement, n’assurant aucune bulle reste coincés sous les puits. Utiliser la solution de restes de polyacrylamide pour suivre l’avancement de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube est complètement durcie, la réaction est complète (~ 10 min).
4. Retirez délicatement le peigne et le ruban à l’arrière de la cassette de gel.

5. préparation des échantillons biologiques pour l’électrophorèse

1. Préparer les milieux cellulaires conditionné, lysats cellulaires, homogénats tissulaires et les normes MMP comme décrit ailleurs sous des conditions de non réducteur². Ne pas chauffer les échantillons.
2. Par exemple, préparer des milieux cellulaires conditionné comme suit :
   1. Plaque 40 000 cellules/cm² cellules dans la plaque de 6 puits dans les milieux de culture pour le sérum fœtal (SVF) 10 %. Incuber les cellules dans une chambre humidifiée (5 % CO₂ à 37 ° C) pendant 24 heures et leur permet d’atteindre le confluent de 70 à 80 %.
      Remarque : Si les cellules n’ont pas atteint la confluence désirée après 24 heures, leur permettre de se développer dans les milieux de culture pour le BF 10 % pendant 24 heures supplémentaires.
   2. Laver les cellules deux fois avec du PBS et ajouter 2 mL de milieu de culture sans sérum. Incuber les cellules dans une chambre humidifiée (5 % CO₂ à 37 ° C) pendant 24 heures supplémentaires.
   3. À l’aide d’une pipette sérologique, recueillir les milieux conditionnés dans chaque puits. Centrifuger les médias à 1200 tr/min pendant 3 minutes pour enlever les débris cellulaires. Prenez le surnageant et concentré à l’aide d’un 15 mL, 10 kDa poids moléculaire coupure filtre centrifuge. Centrifuger les blocs filtrants à 4 000 x g pendant 15 min dans un rotor oscillant de seau ou 5 000 x g pendant 15 min dans un rotor à angle fixe.
      Remarque : Cette étape est facultative mais peut augmenter l’intensité des bandes protéolytiques dans les gels de zymographie peptide.
   4. Transvaser le filtrat concentré dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL. Échantillons aliquote et magasin à-80 ° C pendant jusqu'à trois cycles de gel-dégel.
3. Quantifier la teneur en protéines à l’aide d’un test de quantification des protéines standard (p. ex. BCA, analyse de Bradford, etc.).

6. électrophorèse of Biological Samples in Peptide Zymographie Gels

1. Dissoudre les échantillons dans un tampon échantillon zymographie classiques (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25 % de glycérol, 4 % SDS, 0,01 % bleu de bromophénol). Pour les échantillons de cellules et de tissus, ~ 30 µg de protéines totales par puits est recommandé et 50-100 ng de protéines pour les normes MMP.
2. Ajouter 400 mL de 1 x Tris-Glycine SDS exécutant le tampon à l’appareil de gel. Charge jusqu'à 35 µL de l’échantillon par puits. Exécuter les exemples à 120 V à 4 ° C pendant 1 h 30 ou jusqu'à ce que les normes de poids moléculaire indiquent que les protéases d’intérêt sont dans le peptide résoudre la couche de gel (qui a une couleur orange visible).
   Remarque : La plupart des MMPs et leurs variantes entraient dans le cadre de 35 à 100 kDa. Lorsque les normes de poids moléculaire indiquent que ces poids sont dans le peptide résoudre la couche de gel, électrophorèse peut être arrêté. Le même principe peut être appliqué à d’autres classes de protéases avec des poids moléculaires connus. S’il y a un intérêt dans la détection de plusieurs protéases sur un plus large éventail de poids moléculaires, réduire la taille de la couche de gel de résoudre et augmenter la taille de la couche de gel résolution de peptide.
3. Après électrophorèse, retirez les gels de la cassette en plastique et lavez les gels trois fois pour chaque 10 min à température ambiante sous agitation modérée dans un tampon de renaturation contenant 2,5 % X-100 de Triton, 1 µM ZnCl₂et 5 mM CaCl₂ à 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
4. Gels de transfert à une pays en développement solution tampon contenant 1 % Triton X-100, 1µm ZnCl₂ et 5 mM CaCl₂ en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 pendant 15 min. remplacer avec frais de développement solution tampon et incuber les gels à 37 ° C sous agitation modérée pendant 24 heures , en s’assurant que les gels sont complètement immergés dans la solution.

7. imagerie du Peptide Zymographie gelées

1. Après 24 heures, gels d’image à l’aide d’un fluorescent gel scanner/imageur en utilisant les filtres appropriés d’excitation et d’émission. Par exemple, les gels de peptide montrés les résultats représentatifs sont conjugués à la fluorescéine et ont été photographiés à l’aide d’un filtre d’excitation de 488 nm et un filtre d’émission de 521 nm. En utilisant les filtres appropriés pour votre fluorophore maximisera la détection d’activité protéolytique.
   NOTE : Images peuvent également être prises avec un imageur de gel équipé d’un transilluminateur UV, souvent utilisé pour l’imagerie des gels d’ADN coloré au bromure d’éthidium. Image les gels en utilisant le transilluminateur UV (365 nm) réglage et un filtre d’émission de 590 nm.
2. Effectuer une évaluation densitométrique des intensités de bande à l’aide de ImageJ comme décrit ailleurs¹³.

Résultats

À l’aide de la méthode décrite ici, deux peptides fluorescents de protéase-dégradables ont été incorporées dans des gels de polyacrylamide : GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (abrégé en QGIW dans tout le texte et les figures) et GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (abrégé en LACW dans tout le texte et les figures). ↓ indique le site de clivage. QGIW est un collagène-j’ai dérivé séquence conçu pour détecter les collagénases cellulaire^...

Discussion

Les techniques actuelles de zymographic s’appuient sur l’incorporation des substrats indigènes dans des gels de polyacrylamide pour la détection de la protéolyse. Alors que ces techniques ont rallié la généralisation, elles sont encore limitées dans le nombre des protéases, qu'ils peuvent détecter. Ici, un protocole a été décrite dans les peptides fluorescents, protéase-dégradables sont incorporés dans le polyacrylamide gel de résoudre. À l’aide de couplage covalent une molécule azido-PEG3-maléim...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086