Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Zusammenfassung

Der Zweck dieser Methode ist es, die proteolytische Aktivität von komplexen biologischen Proben zu messen. Die Proben werden durch Molekulargewicht mit Elektrophorese durch eine Lösung von Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Diese Methode unterscheidet sich von traditionellen Gel Zymography, dass eine abgeschreckt Fluorogenic Peptid in der Lösung von Gel statt voller Länge Proteine, wie Gelatine oder Kasein kovalent eingearbeitet ist. Verwendung der Fluorogenic Peptide ermöglicht direkte Nachweis der proteolytischen Aktivität ohne zusätzliche Färbung Schritte. Enzyme in den biologischen Proben cleave das abgeschreckt Fluorogenic Peptid, was zu einem Anstieg in Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal in die Gele ist dann mit einem standard Leuchtstofflampen Gel Scanner abgebildet und quantifiziert mit Densitometrie. Die Verwendung von Peptiden als abbaubare Substrat erweitert erheblich die möglichen Proteasen nachweisbar mit Zymographic Techniken.

Einleitung

Gel Zymography ist ein biologischer Verfahren zur Messung der proteolytischen Aktivität in biologischen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten oder Zelle Nährmedien^1,2,3. Die Proben werden durch ihre Molmassen mit Elektrophorese durch ein Polyacrylamid-Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Gemeinsamen abbaubaren Substrate enthalten Gelatine, Kasein, Kollagen und Elastin, die verwendet wurden, um die Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) -1,-2-3, -7,-8,-9 und-11, neben einer Vielzahl von Cathepsins^1,2 messen ^{, 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. nach Elektrophorese, die Enzyme sind renaturierte und durfte um das Protein innerhalb des Gels zu degradieren. In traditionellen Gel Zymography das Gel wird mit einem Protein-Farbstoff, z. B. Coomassie Blau gefärbt und Protease-Aktivität wird als Verlust des Signals, d. h. weiße Bänder (Abbau von Protein) auf einem dunkelblauen Hintergrund erkannt.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine alternative Methode der Gel Zymography, in dem das abbaubare Substrat kurzer Fluorogenic Peptid kovalent in das Polyacrylamid-Gel (Abbildung 1) integriert ist. Die Substitution von synthetische Peptide als abbaubare Substrate ermöglicht eine Erfassung von einer breiteren Palette von Proteasen im Vergleich zu traditionellen Gel Zymography mit native Proteine⁹. Kovalente Bindung des Peptids Fluorogenic verhindert Peptid Verbreitung und Migration während der Gelelektrophorese mit bisherigen Methoden^9,10beobachtet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Substrates Fluorogenic direkte Nachweis der Protease-Aktivität ohne zusätzliche Färbung und de-Färbung Schritte. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Erkennung von Protease-Aktivität in biologischen Proben über die kovalente Einbeziehung Fluorogenic Peptide in Zymogram Gele.

Protokoll

1. Vorbereitung der Lösung von Gelschicht

1. Bereiten Sie eine 10 %-Polyacrylamid-Gel-Lösung gemäß Tabelle 1zu lösen. Fügen Sie die Tetramethylethylenediamine (TEMED) und Ammonium Bleichen (APS) unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert.
2. Füllen Sie eine leere 1,5 mm Mini-Gel Kassette auf halbem Weg (5 mL) mit 10 % ige Lösung von Gel-Lösung.
3. Fügen Sie eine dünne Schicht von Isopropanol (~ 500 µL) an die Spitze der Polyacrylamid-Gel zu produzieren eine Ebene Gel und Luftblasen zu verhindern. Verwenden Sie die übrig gebliebenen Polyacrylamid-Lösung, um die Polymerisationsreaktion verfolgen. Wenn das Polyacrylamid in das Rohr vollständig erstarrt ist, ist die Reaktion abgeschlossen (~ 40 min).

2. Vorbereitung des Moleküls Azido-PEG3-Maleimide-Linker

1. Während die erste Lösung von Gelschicht dadurch ist, rufen Sie das Azido-PEG3-Maleimide-Kit von-20 ° C Speicher ab und lassen Sie die Komponenten auf Zimmertemperatur kommen. Es gibt zwei Komponenten in jedem Kit. 1 Durchstechflasche enthält eine Maleimide-NHS Ester, eine Weiß-gelbliche grau solide. 2 Fläschchen enthält Azido-PEG3-Amin, ein leicht gelbes Öl.
   Hinweis: Die Autoren schlagen mit dem 25 mg-Azido-PEG3-Maleimide-Kit, da es nur für kurze Zeit (1-2 Stunden) gespeichert und kann bei-20 ° C nach vorbereitet, bevor es beginnt zu erniedrigen. 25 mg reicht um 10 Peptid Gele zu produzieren. Verwenden Sie Gele innerhalb von 3 Wochen der Vorbereitung.
2. Lösen sich die Komponenten der Ampulle 2 in der vom Hersteller empfohlenen Menge Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Vortex für 30 s, um die Flüssigkeiten zu gewährleisten haben gut gemischt worden.
3. Übertragen Sie den Inhalt des Fläschchens 1 in einem sauberen, trockenen 100 mL Rundboden Kolben mit Stir Bar.
   Hinweis: Spülen Sie die Flasche mit Aceton und lassen Sie vollständig trocknen, vor dem Gebrauch zu verhindern, dass Feuchtigkeit stören die Reaktion.
4. Legen Sie sofort einen Gummistopfen Septum mit einer Membran, die mit einer Spritze in den Mund des Kolbens punktiert werden kann. Arbeit schnell zu verhindern, dass Feuchtigkeit in die Flasche.
5. Legen Sie zwei 18 Gauge Nadeln in die Membrane Spritze und verbinden zu einem inerten Gastank (z.B. Argon-Gas). Lassen Sie dem Edelgas füllen die Flasche für 3 min. Mix Komponenten Fläschchen 1 und 2 unter Schutzgas, unerwünschte Reaktionsprodukte zu verhindern.
   Achtung: Die zweite Spritzennadel ist ein Ventil, wodurch der atmosphärischen Luft in die Flasche, aus der Flasche zu fließen, wie es mit Inertgas füllt enthalten. Vergessen Sie nicht, eine Nadel Vent gehören!
6. Das Inertgas ausschalten und von der Nadel lösen. Mit einer Spritze, den vollständigen Inhalt des Fläschchens 2 Spritzen Sie in den Kolben.
7. Entfernen Sie Nadeln und Spritzen zu und lassen Sie die Komponenten für 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren mischen.
8. Entfernen Sie den Gummistopfen Septum und übertragen Sie den Inhalt auf eine saubere 5 mL Zentrifugenröhrchen. Die Azido-PEG3-Maleimide-Lösung muss innerhalb von 1 Stunde bei Raumtemperatur verwendet werden.

3. Vorbereitung des Peptids Gelschicht zu lösen

1. Sobald die erste Lösung von Gelschicht polymerisiert ist, Gießen Sie die Isopropanol-Schicht. Spülen Sie die Spitze des Gels durch Pipettieren 1 mL deionisiertes Wasser oben auf das Gel und dann abgießen.
2. Rufen Sie die Thiol-funktionalisiert fluoreszierende Peptid von-80 ° C Speicher ab und lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen.
   Hinweis: Die Thiol-funktionalisiert Peptid kann vorbereitet werden, wie oben beschrieben^11,12. Kommerziell verfügbare Peptide können auch verwendet werden, sondern erfordern der Zusatz eines terminal Cystein-Rückstands zu ermöglichen, die Maleimide-Thiol klicken Reaktion. Lösen Sie das Peptid Lager Konzentration von 10 mM zu, und bewahren sie bei-80 ° C im kleinen (30 uL) Aliquote, wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu begrenzen.
3. Bereiten Sie eine 10 % Lösung von Gel-Lösung mit dem Azido-PEG3-Maleimide-Linker-Molekül und das fluoreszierende Peptid gemäß Tabelle 1. Fügen Sie die TEMED und APS unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert.
4. Füllen Sie die Hälfte des verbleibenden Teils der Gel-Kassette (3 mL) mit das Peptid Gel Lösung zu lösen.
   Hinweis: Ein mehrschichtige Lösung von Gel Ansatz reduziert die Menge von Peptid und Linker für jedes Gel erforderlich. Die Größe der die Peptid-Lösung von Gelschicht kann angepasst werden einen größeren Bereich von Molekulargewichten nach Bedarf.
5. Pipette eine dünne Schicht von Isopropanol (~ 500 µL) an die Spitze der Polyacrylamid-Gel zu produzieren eine Ebene Gel und Luftblasen zu verhindern. Verwenden Sie die übrig gebliebenen Polyacrylamid-Lösung, um die Polymerisationsreaktion verfolgen. Wenn das Polyacrylamid in das Rohr vollständig erstarrt ist, ist die Reaktion abgeschlossen (~ 40 min).
   Hinweis: Das fluoreszierende Peptid ist lichtempfindlich. Halten Sie die Gele, abgedeckt mit Alufolie, Immunofluoreszenz während Gel Vorbereitung, Elektrophorese, Wasch- und Entwicklung zu verhindern.
6. Gießen Sie die Isopropanol-Schicht und spülen Sie die Spitze des Peptids Gel mit entionisiertem Wasser wie in Schritt 3.1 zu lösen.
7. Wenn mit der Gele sofort, fahren Sie mit Schritt 4, ansonsten Tauchen Sie die vorbereiteten Gele in 100 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C in einer Plastikbox, die Gele Austrocknen verhindert wird. Wickeln Sie die Box in Alufolie, Immunofluoreszenz zu verhindern. Gele können mit PBS-Puffer für bis zu 3 Wochen vor dem Gebrauch gespeichert werden.

4. Vorbereitung des stapelnden Gels

1. Bereiten Sie eine 5 % Stapeln Gel Lösung gemäß Tabelle 1. Fügen Sie die TEMED und APS unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert.
2. Füllen Sie den verbleibenden leeren Teil des Gel-Kassette (~ 2 mL) mit Stapeln Gel-Lösung.
3. Legen Sie schnell einen 1,5 mm Gel Kamm in Stapeln Gelschicht, sicherstellen, dass keine Luftblasen unter dem Brunnen gefangen bleiben. Verwenden Sie die übrig gebliebenen Polyacrylamid-Lösung, um die Polymerisationsreaktion verfolgen. Wenn das Polyacrylamid in das Rohr vollständig erstarrt ist, ist die Reaktion abgeschlossen (~ 10 min).
4. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und das Klebeband von der Rückseite der Kassette Gel.

5. Vorbereitung des biologischen Proben für Elektrophorese

1. Bereiten Sie konditionierten Zelle Medien, Zelle Lysates, Gewebe Homogenates und MMP-Standards, wie an anderer Stelle unter nicht-reduzierenden Bedingungen²beschrieben. Erwärmen Sie Proben nicht.
2. Zum Beispiel bereiten Sie konditioniert Zelle Medien wie folgt:
   1. Platte 40.000 Zellen/cm² Zellen in einem 6-Well-Platte in Kulturmedien 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Inkubieren Sie Zellen in eine feuchte Kammer (5 % CO₂ bei 37 ° C) für 24 Stunden und es ermöglichen Sie ihnen, Zusammenfluss von 70-80 % zu erreichen.
      Hinweis: Wenn die Zellen nicht die gewünschte Konfluenz nach 24 Stunden erreicht haben, können sie für weitere 24 Stunden in 10 % FBS Nährmedien wachsen.
   2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und 2 mL Serum-freie Kultur Medien. Inkubieren Sie die Zellen in eine feuchte Kammer (5 % CO₂ bei 37 ° C) für weitere 24 Stunden.
   3. Mit einer serologischen Pipette, sammeln Sie die konditionierten Medien aus jedem Brunnen. Zentrifugieren Sie die Medien bei 1200 u/min für 3 Minuten, jede Zelle Ablagerungen zu entfernen. Den Überstand und mit einem 15 mL, 10 kDa Molekulargewicht cutoff zentrifugale Filtereinheit. Zentrifugieren Sie die Filtereinheiten an 4.000 x g für 15 min in eine schwingende Eimer Rotor oder 5.000 x g für 15 min in einem festen Winkel Rotor.
      Hinweis: Diese Schritt ist optional, jedoch kann die Intensität der proteolytischen Bands die Peptid-Zymography-Gele erhöhen.
   4. Übertragen Sie das konzentrierte Filtrat auf eine frische 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Aliquoten und Store Proben bei-80 ° C für bis zu drei Gefrier-Tau-Zyklen.
3. Protein-Inhalt mit einem standard Protein Quantifizierung Assay zu quantifizieren (z. B. BCA, Bradford-Test, etc.).

6. Elektrophorese von biologischen Proben in Peptid Zymography Gele

1. Proben in konventionellen Zymography Probenpuffer auflösen (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25 % Glycerin, 4 % SDS, 0,01 % Bromophenol blue). Für Zellen und Gewebe Proben, ~ 30 µg des Gesamt-Protein pro Bohrloch wird empfohlen, und 50-100 ng Protein für MMP-Standards.
2. Fügen Sie 400 mL 1 x Tris-Glycin SDS laufen Puffer auf den Gel-Apparat. Laden Sie bis zu 35 µL Probe pro Bohrloch. Laufen Sie die Proben bei 120 V bei 4 ° C, 1,5 Stunden oder bis die Molekulargewicht Normen zeigen, dass die Proteasen von Interesse in das Peptid Gelschicht sind (hat eine sichtbare orange Farbe) zu lösen.
   Hinweis: Die meisten MMPs und deren Varianten liegen im Bereich von 35-100 kDa. Wenn die Molekulargewicht Standards zeigen, dass diese Gewichte in das Peptid Gelschicht zu lösen sind, kann die Elektrophorese gestoppt werden. Das gleiche Prinzip kann auf andere Klassen von Proteasen mit bekannten Molekulargewichten angewendet werden. Wenn es ein Interesse bei der Aufdeckung von mehreren Proteasen über einen größeren Bereich der Molekulargewichte, reduzieren Sie die Größe der Lösung von Gelschicht und vergrößern Sie die Peptid-Lösung von Gelschicht.
3. Entfernen Sie nach Elektrophorese die Gele aus Kunststoff Kassette und waschen Sie Gele dreimal für 10 min bei Raumtemperatur unter schonenden rühren in Renaturierungen Puffer mit 2,5 % Triton x-100, 1 µM ZnCl₂und 5 mM CaCl₂ in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
4. Transfer Gele zu entwickelnden Pufferlösung mit 1 % Triton x-100, 1 µM ZnCl₂ und 5 mM CaCl₂ in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 für 15 min. ersetzen mit der Entwicklung von frischen Lösung zu puffern und inkubieren Sie Gele bei 37 ° C unter sanften Agitation für 24 Stunden , dafür sorgen die Gele sind vollständig in die Lösung eingetaucht.

7. Darstellung der Peptid-Zymography Gele

1. Nach 24 Stunden gel Bild Gele mit einer fluoreszierenden Scanner/Imager entsprechende Anregung und Emission Filter verwenden. Beispielsweise die Peptid-Gele in die repräsentativen Ergebnisse gezeigt werden konjugiert mit Fluorescein und wurden abgebildet mit einem Filter Anregung von 488 nm und eine Emission Filter von 521 nm. Mit den entsprechenden Filtern für Ihre Fluorophor wird der Nachweis der proteolytischen Aktivität maximieren.
   Hinweis: Bilder können auch mit einer Gel-Imager, ausgestattet mit einem UV-Transilluminator, oft verwendet für die Darstellung der DNA-Gele mit Interkalation Bromid befleckt getroffen werden. Die Gele mit dem UV-Transilluminator Bild (365 nm) Einstellung und eine Emission Filter von 590 nm.
2. Führen Sie densitometrischen Auswertung der Band Intensitäten mit ImageJ wie an anderer Stelle¹³beschrieben.

Ergebnisse

Mit der beschriebenen Methode hier, zwei fluoreszierende Protease-abbaubar Peptide flossen in Polyacrylamid-Gele: GGPQG↓IWGQK(PEG)₂C (abgekürzt als QGIW in den Text und Zahlen) und GPLA↓C^pMeOBzlWARK(PEG)₂ C (abgekürzt als LACW im gesamten Text und Zahlen). ↓ gibt die Site der Spaltung. QGIW ist ein Kollagen-ich abgeleitet Sequenz entwickelt, um zelluläre Collagenases¹⁴erkennen. LACW ist eine Sequenz, die für die Erkennung ...

Diskussion

Aktuelle Zymographic Techniken beruhen auf dem Einbau von nativen Substraten in Polyacrylamid-Gele für den Nachweis der Proteolyse. Während diese Techniken weit verbreiteten Einsatz angesammelt haben, werden sie noch in der Anzahl der Proteasen beschränkt, die Sie erkennen können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, in welche Leuchtstofflampen, Protease-abbaubar Peptide in der Polyacrylamid-Gel zu lösen integriert sind. Kovalente Kupplung mit ermöglicht ein Linker Azido-PEG3-Maleimide-Molekül die Trennung und Na...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086