细胞外通量分析仪分析原代培养小鼠新生心肌细胞的耗氧率

摘要

该方案的目的是说明如何使用小鼠新生儿心肌细胞作为一个模型系统, 以检查各种因素如何改变心脏的耗氧量。

摘要

线粒体和氧化代谢是维持心肌功能的关键。研究表明, 线粒体功能障碍是心力衰竭中心脏功能受损的重要因素。相比之下, 恢复有缺陷的线粒体功能可能对改善心脏衰竭患者的心功能有有益的效果。因此, 研究线粒体功能的调节机制和确定新的调节剂可以提供见解, 可用于制定治疗心脏病的新的治疗靶点。在这里, 心脏肌细胞线粒体呼吸使用独特的细胞培养系统进行分析。首先, 优化了一项协议, 以快速分离和培养高生存能力的新生儿小鼠心肌细胞。然后, 用96孔格式的细胞外流量分析仪来评估这些心肌细胞的耗氧率。对于该方案, 我们优化了播种条件, 并证明新生儿小鼠心肌细胞耗氧率可以很容易地评估在细胞外流量分析仪。最后, 我们注意到, 我们的协议可以应用于更大的培养规模和其他研究, 如细胞内信号转导和收缩功能分析。

引言

为了维持持续的心脏收缩功能, 心肌细胞必须保持细胞能量的恒定供应, 主要是 atp¹的形式。在心脏中, 大约95% 的 atp 是由线粒体产生的, 主要是通过氧化磷酸化, 表明线粒体在心脏功能^2,3 中发挥着至关重要的生物能量作用。支持这一观点的是, 线粒体功能的失调可导致心肌病和心力衰竭⁴,⁵。相反, 恢复线粒体功能已被证明可以改善心脏^衰竭的心功能 6^,7。因此, 研究线粒体生物能量学的机制, 确定心肌细胞线粒体功能的新调节剂, 不仅可以揭示心脏能量产生的机械洞察, 还可以提供导致心脏能量产生的洞察制定治疗心脏病的新治疗靶点 6^,8。

与包含肌细胞和非心肌细胞^{的混合物的}整个心脏相比, 心肌细胞培养非常纯净, 非心肌细胞受到的心脏污染最小, 如成纤维细胞和内皮细胞¹⁰。此外, 将心肌细胞从新生幼崽中分离, 可以在短时间内培养大量细胞, 而成人心脏中的细胞^{为 10,11.}最重要的是, 原代培养的成年小鼠心肌细胞存活时间短 (例如 24小时), 并在较长的时间点去分化。新生小鼠心肌细胞可以存活并在培养过程中纵 7 天以上 , 使其成为测试药物化合物和基因操作对心肌细胞线粒体功能的影响的理想选择 10 .当然, 成人和新生儿细胞之间存在显著的生物学差异, 但可用于新生儿细胞培养的时间较长, 使其适合许多不同类型的研究, 包括线粒体功能的研究。

迄今为止, 原代培养的新生小鼠和大鼠心肌细胞已被用作研究心脏生物能量 12^{,13 的}模型。近年来, 研究使用细胞外助焊剂分析仪测量耗氧率 (ocr), 并评估小鼠和大鼠新生儿心肌细胞的氧化能力 14^,15。与大鼠相比, 小鼠新生儿心肌细胞的细胞活力较低, 变异性较大 16.另外, 研究基因工程小鼠模型细胞的能力也使得老鼠细胞模型非常重要。鉴于 ocr 研究对细胞数量和播种密度非常敏感, 因此需要开发一种可重现、可靠和简单的协议, 以实现一致的细胞产量和活力。

在这里, 我们报告了一个优化的协议, 已经开发, 使用培养的小鼠新生儿心肌细胞与96良好的格式细胞外流量分析仪 ocr 分析。该方案大大提高了检测的重现性。此外, 该协议不仅为 ocr 分析提供了一种新颖、可重复的方法, 而且还可以适应用于其他实验目的的更大尺寸的培养, 例如研究肌纤维功能和细胞内功能可能需要的培养方法信号通路。

特别是, 该协议描述了一个为期一天的程序, 分离和培养新生儿小鼠心肌细胞在96孔细胞培养板。此外, 它还描述了使用细胞外流量分析仪测量耗氧量的过程。所有使用的溶液都经过无菌或无菌过滤。所有工具均采用75% 乙醇消毒。我们为程序的各个部分提供材料表。用于培养心肌细胞, 所有的程序和步骤都是在标准的细胞培养罩中进行的。该协议是为将新生小鼠心脏与一个垃圾 (约8-10 只小狗) 隔离而开发的。然而, 该协议也可用于隔离心肌细胞从多个垃圾。

研究方案

对于使用新生鼠, 请参考当地大学/研究所动物护理计划规定的指南, 并遵守自己的机构和其他适当规定。本协议中描述的所有方法都已得到加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准, 并遵守联邦和州法规。

1. 试剂的制备

1. 准备25 毫升的预处理溶液: hbss (不含 ca^{2 +}和 mg^{2 +}) 补充胰蛋白酶 (0.5 mg/ml)。使用0.22μm 过滤器对溶液进行灭菌, 并保持在冰上, 直至使用。在实验当天制作消化前溶液。
   请注意:使用没有 ca^{2 +}和 mg^{2 + 的}hbss 是至关重要的, 因为 ca^{2 +}和 mg2^{+ 会}在隔离过程中导致心肌细胞收缩和随后的细胞死亡。
2. 制备30 毫升胶原酶消化缓冲液:胶原酶 (0.8 mg/ml, 约 350 uml) 溶解在 hbss (不含 ca^{2 +}和 mg^{2 +}) 缓冲液中。使用0.22μm 过滤器对溶液进行灭菌, 并保持在冰上, 直至使用。在实验当天制作胶原酶消化液。
3. 制备500毫升的心肌细胞培养基 (生长培养基): 混合375毫升的 dmem, 125 毫升的 m-199, 25 毫升的马血清, 12.5 毫升的 fbs。补充1% 青霉素和1% 链霉素溶液。
4. 制备线粒体应力试验介质: 制备 200 ml 的 dmem 基应力试验介质 (dmem 不含 nhco₃, 见材料表), 辅以 1 mm 丙酮酸钠、2 mm l-谷氨酰胺、10 mm 葡萄糖和 2 mm 肝。
   请注意:用不含丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、葡萄糖和肝的 dmem 制备1升培养基, 无菌, 并储存在4°c。在检测当天添加其他试剂, 准备压力测试介质。使用不含 nhco₃的 dmem 介质至关重要。
5. 在使用当天将线粒体应力测试介质的 ph 值调整为7.4。使用前将介质加热至37°c。
6. 准备寡霉素: 在 dmso 中准备 5 mm 库存溶液的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下储存。
7. 准备fccp: 在 dmso 中准备 5 mm 库存解决方案的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下存储。
8. 准备抗霉素 a: 在 dmso 中准备 5 mm 库存溶液的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下存储。
9. 准备鱼龙酮: 在 dmso 中准备 5 mm 库存溶液的5毫升, 制作 250μl aliquots, 并在-20°c 下存储。
   请注意:表 1列出了本协议中使用的所有试剂和解决方案。

2. 从新生小鼠中采集和消化心脏 (第1天)

1. 高压灭菌剪刀、钳子和莫里亚勺子消毒。
2. 为不孕不育执行细胞培养罩中的所有步骤。
3. 6井细胞培养板的每口井5毫升 hbss (不含 ca^{2 +}, mg^{2 +});在冰上的地方。将10毫升的 hbss 注入10厘米的细胞培养盘。
4. 在50毫升无菌锥形管中制备20毫升胰蛋白酶预处理溶液。将所有解决方案放在冰上。
5. 快速浸渍70% 乙醇溶液中的新生 (第0天) 小鼠进行灭菌。
6. 用无菌剪刀 (直) 斩首幼崽, 不麻醉, 然后沿着胸骨打开胸部, 让进入胸腔和心脏。(图 1 a)
   注: 1) 使用 p0 新生小鼠以实现高细胞活力至关重要。2) 根据 nih 和美国兽医协会的指南 17, 这种安乐死方法^允许对新生儿使用。
7. 用一把精细的剪刀从体内提取心脏, 并立即转移到含有 hbss 的无菌细胞培养皿中 (不含 ca 2 +, mg^{2 +}) (图 1^b)。
8. 去除任何残留的肺组织、较大的血管等(如果需要, 还切除心房)。用温和的搅拌清洗 hbss 溶液中的心脏。
9. 用一把精细的剪刀把每个心脏切割成8个部分, 用钳子将所有心脏组织转移到一个带有 hbss 的6井细胞培养板的井中 (图 1c 和 1C)。
10. 用莫里亚勺子 (图 1d), 在装满 hbss 的6井板中, 将心脏从井中转移到井中, 清洗心脏。
    请注意:把心脏从井转到井就足以洗掉血。由于血液干扰酶消化, 用 hbss 洗心、去除血液是很重要的。
11. 用莫里亚勺子将心脏转移到含有20毫升胰蛋白酶 (0.5 mg/ml) 的锥形管中, 在4°C 下温和搅拌孵育 4小时 (图 1e)。

3. 准备96井文化板 (第1天)

1. 制备5毫升的涂层溶液: pbs 含有0.5% 的明胶 (使用前的高压灭菌器) 和1% 的纤维连接蛋白溶液。(例如5毫升明胶溶液加上50μl 的纤维连接蛋白溶液)
2. 将50μl 涂层溶液注入96孔细胞培养板的每口井 (见材料表)。如果存在气泡, 请使用20μl 移液器将气泡取出。
   请注意:重要的是要覆盖每个井的所有表面积与涂层溶液。
3. 将板材孵育在37°c 细胞培养孵化器中1小时或更长时间, 使基质涂层干燥。
4. 在播种心肌细胞之前, 吸入任何残留的涂层溶液。

4. 酶消化和细胞电镀 (第1天)

1. 在37°c 的水浴中使用预热胶原酶消化液。
   请注意:这一步对于实现高效的酶消化非常重要。
2. 将含有心脏的锥形管和消化前溶液从4°c 移动到细胞培养罩。(图 1f)
3. 让心脏沉到试管底部, 并使用10毫升血清学移液器 (分离介质的1至2毫升可能留在管内) 去除消化前溶液。
4. 在试管中加入10毫升的 hbss。用 hbss 重新暂停心脏2-3 次, 使用10毫升血清学移液器冲洗胰蛋白酶。吸气 hbss (1 至2毫升可能仍留在试管中)。
5. 将预热胶原酶消化液加入10毫升。(图 1g)
6. 在37°c 的水浴中用心脏将输卵管加氢 10分钟, 无需搅拌 (第一次消化)。
7. 第一次消化后, 将管子移动到细胞培养罩上。用10毫升血清学移液器轻轻将心脏重新悬浮在管内, 轻轻三分心。这将使心脏分散, 细胞从心脏组织中释放。(图 1h)
   请注意:由于心肌细胞是脆弱的, 温和的三化是重要的, 以实现高生存能力。
8. 让未消化的组织下沉, 将富含心肌细胞 (约 9-10 ml) 的消化溶液转移到新的锥形管中, 并立即添加等量的细胞培养基, 以阻止胶原酶的消化。
9. 在含有剩余未消化心脏组织的试管中加入10毫升的胶原酶消化液。
10. 在37°c 的水浴中用心脏组织将输卵管加氢 10分钟 (第二次消化)。
11. 重复过程4.7 和4.8。
    请注意:如果仍有许多未消化的组织, 请再重复消化一次。然而, 在大多数情况下, 两个消化方法足以分散心脏组织中的大部分细胞。
12. 将无菌细胞过滤器 (100μm 尼龙网) 放入新的无菌 50 ml 锥形管中。用2-3 毫升的细胞培养培养基预湿细胞过滤器, 并通过细胞过滤器。用2-3 毫升的细胞培养培养基冲洗细胞过滤器。(图 1i)
13. 在 180 x g 的情况下, 含有心肌细胞的离心锥形管 5分钟 (图 1j)。吸吸上清液 (图 1k), 它将含有细胞组织碎片, 并在细胞培养培养基的10毫升中重新悬浮细胞颗粒 (图 1K)。
14. 轻轻地将细胞和板细胞重新悬浮到10厘米长的细胞培养盘 (塑料无任何类型的涂层) 上, 并在细胞培养孵化器 (第一次预电镀) 中孵育 1小时 (图 1m)。此预电镀步骤允许非心肌细胞, 如成纤维细胞和内皮细胞, 粘附在未涂层细胞培养盘。
    请注意:此时, 心肌细胞通常是圆形的, 在显微镜下呈闪亮。(图 1n)。
15. 1小时孵育后, 轻轻搅拌板, 从10厘米培养盘中清洗非粘附细胞 (富含心肌细胞), 并使用10毫升血清学移液器在培养皿上反复移液细胞培养基, 重新悬浮细胞。然后, 将非粘附细胞 (富含心肌细胞) 转移到一个新的10厘米细胞培养盘 (塑料无任何涂层), 并在细胞培养孵化器 (第二次预电镀) 中孵育1小时。
    请注意:附着在非涂层板上的细胞主要是非心肌细胞: 成纤维细胞和内皮细胞, 可以在显微镜下显示 (图 1o)。
16. 第二次预电镀后, 轻轻搅拌板, 从10厘米培养盘中清洗非粘附细胞 (心肌细胞), 然后将心肌细胞转移到一个新的50毫升锥形管中。

5. 将细胞计数并将细胞放入96孔细胞培养板 (第1天)

1. 用血细胞仪计数细胞。
2. 通过使用最终体积为200μl 的多通道移液器, 将细胞层分为细胞外基质, 在 10-30 x¹⁰ 3 活孔的密度下涂覆96孔细胞培养板 (图 1p)。使用 a1、a12、h1 和 h12 作为背景: 在这些井 (无细胞) 中添加200μl 培养基作为其他井。在37°c 细胞培养孵化器中孵育板。
   请注意:在这项研究中, 使用不同的细胞密度, 如 10 x 10³, 20 x 10^3,或 30 x^{10 3 细胞}/井, 测试耗氧量。(图 2a)。此外, 如上所述, 分离后立即出现心肌细胞通常是圆形的, 在显微镜下呈闪亮。在培养的16-24小时内, 可存活的细胞会变平。

6. 使用96良好格式的细胞外通量分析仪进行耗氧量测定 (第2天)

请注意:耗氧量测定可以在细胞电镀后一天进行, 也可以在后一天进行。使用该协议培养的新生儿心肌细胞可在隔离后7天内存活。

1. 在检测前, 将流量分析仪传感器墨盒 (参见材料表) 的水合物至少用 3个小时, 但理想情况下是一整天。在公用板的每口井中加入200μl 的校准溶液 (见材料表), 将传感器墨盒放回公用板, 并在没有 co2 或_{o 2}补充的37°C 孵化器中孵育 。
2. 在检测前一小时将细胞培养培养基改为线粒体压力测试介质。心肌细胞是脆弱的。因此, 使用多通道移液器轻轻去除细胞培养介质, 并用200μl 预热线粒体应力测试介质清洗细胞两次。二次洗涤后, 加入175μl 的预热线粒体应力测试介质, 并在没有 co2 或 o₂补充的37°C 孵化器中培养细胞。
3. 准备浓缩测试化合物。对于线粒体应力测试, 准备 3.0 ml, 每16μm 寡霉素, 9μm fccp, 和 20μm rotenone 和20μm 抗霉素 a 的混合物, 均在线粒体应力测试介质中。
   请注意:所述浓度下的每一种化合物都经过了测试。然而, 在自己的实验室中滴定每种化合物的浓度是必要的。
4. 使用多通道移液器将每个化合物的25μl 加载到传感器墨盒的喷射器端口 (图 1q)。体积和最终浓度见表 2。
5. 建立细胞外通量检测方案。该程序在表 3中进行了描述。
6. 启动该程序。首先, 将传感器墨盒放入机器进行校准 (图 1r)。校准步骤完成后, 请更换检测板的校准器。
   请注意:使用制造商提供的软件, 指示井组以及每个化合物和端口。
7. 如果需要, 在检测后, 使用多通道移液器小心丢弃所有检测介质, 并使用蛋白质检测将细胞培养微板存储在-20°c, 以便将来进行细胞归一化。
8. 测量蛋白质含量。加入50μl 的标准 ripa 细胞裂解溶液 (见材料表)。在冰上加层 30分钟, 使细胞完全裂解。将所有材料转移到一个新的透明平底96井检测板。
9. 根据制造商的协议, 用 bca 法测定蛋白质浓度。
   请注意:用细胞外基质涂井会使每口井的蛋白质浓度都很高。因此, 减去背景井 (无细胞) 的量, 以获得实际的细胞蛋白浓度。96孔培养基中从细胞中提取的蛋白质浓度较低。此外, 由于细胞外基质涂层, 蛋白质浓度可能因良好而异。因此, 建议使用单元格数对 ocr 进行规范化。

结果

通过使用所描述的协议, 从第0天的新生幼崽中分离出心脏。获得了 5 x¹⁰ 5 细胞/幼崽, 并在96个井板的密度为 10 x 10 3、20x 10^{3 或}30 x^{10 3}的心肌细胞 (图 2a)。经过一夜的培养, 发现心肌细胞很好地附着在涂层的塑料表面, 很少有未附着的细胞 (与传播的健康的、附着的细胞相比, 未附着的细胞仍然会出现圆形和闪亮的样子) (

讨论

在这项研究中, 我们建立了一个简单的方案, 用于分离和培养小鼠新生儿心肌细胞。通过使用这些心肌细胞, 我们还优化了条件, 以测量耗氧率使用细胞外流量分析仪系统。该协议允许人们使用小鼠新生儿心肌细胞作为模型系统, 以检查各种因素如何改变心脏主要工作细胞的耗氧量, 类似于在完整的器官中测量的东西。我们的协议不同于以前发布的协议^16、18.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	SIGMA	A8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores	FALCON	352360	To capture undigested tissue
Collagenase type II	Worthington	LS004176	To make collagenase digestion solution
D-Glucose	SIGMA	75351	To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose	Life technologies	11965-092	To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	SIGMA	C2920	Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies	26140-079	To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma	SIGMA	F1141-5MG	To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors	Fine Sciences Tools	14060-10	For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin	SIGMA	G-1890	To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum	Life technologies	26050-088	To make cell culture medium
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	To make mitochodnrial stress test medium
M-199	Cellgro	10-060-CV	To make cell culture medium
Moria spoon	Fisher scientific	NC9190356	To wash hearts
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer	Fisher scientific	89900	To lyse the cells for protein assay
Rotenone	SIGMA	R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent		Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors	Fine Sciences Tools	91401-12	For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size			For sterile filtration of digestion medium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	To make pre-digestion solution