Analyse des taux de consommation d’oxygène dans les Cardiomyocytes néonatals cultivés primaires de souris à l’aide d’un analyseur de Flux extracellulaire

Résumé

Le but du présent protocole est d’illustrer l’utilisation de souris néonatales cardiomyocytes comme système modèle pour examiner comment divers facteurs peuvent modifier la consommation d’oxygène au coeur.

Résumé

Mitochondries et métabolisme oxydatif sont essentiels pour maintenir la fonction du muscle cardiaque. Les recherches démontrent que le dysfonctionnement mitochondrial est un facteur important contribuant à la fonction cardiaque altérée trouvé dans l’insuffisance cardiaque. En revanche, restaurer la fonction mitochondriale défectueuse peut-être avoir des effets bénéfiques pour améliorer la fonction cardiaque au cœur défaillant. Par conséquent, étudier les mécanismes de régulation et d’identifier les nouveaux régulateurs de la fonction mitochondriale pourraient fournir insight qui pourrait servir à développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies cardiaques. Ici, la respiration mitochondriale de myocytes cardiaques est analysée à l’aide d’un système de culture cellulaire unique. Tout d’abord, un protocole a été optimisé pour isoler rapidement et culture viabilité haute souris néonatales cardiomyocytes. Ensuite, un analyseur de flux extracellulaire format 96 puits sert à évaluer le taux de consommation d’oxygène de ces cardiomyocytes. Pour ce protocole, nous avons optimisé seeding conditions et démontré que taux de consommation de l’oxygène de cardiomyocytes souris néonatales peut être facilement évalué dans un analyseur de flux extracellulaire. Enfin, nous constatons que notre protocole peut être appliqué à une plus grande taille de culture et d’autres études, telles que la signalisation intracellulaire et contractiles fonctionnent analyse.

Introduction

Pour maintenir une fonction contractile cardiaque continue, cardiomyocytes doit maintenir un apport constant d’énergie cellulaire principalement sous la forme d’ATP¹. Dans le coeur, environ 95 % de l’ATP est généré par les mitochondries, principalement par le biais de la phosphorylation oxydative, montrant que les mitochondries jouent un rôle de bioénergétique crucial dans la fonction cardiaque^2,3. Soutenant cette notion est que le dérèglement de la fonction mitochondriale peut conduire à une cardiomyopathie et une insuffisance cardiaque^4,5. À l’inverse, restaurer la fonction mitochondriale a été établi afin d’améliorer la fonction cardiaque de la défaillance cardiaque^6,7. Par conséquent, étudier le mécanisme de bioénergétique mitochondriale et identifier les nouveaux régulateurs de la fonction mitochondriale dans les cardiomyocytes ne révéleront pas seulement les perspicacités mécanistes de la production énergétique cardiaque mais également pourraient fournir un aperçu qui mèneront au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les maladies cardiaques,^6,8.

Par rapport au coeur entier, qui contient un mélange de myocytes et non-myocytes⁹, cultures cardiomyocyte sont extrêmement pure, avec une contamination minimale des non-myocytes du cœur, comme les fibroblastes et les cellules endothéliales¹⁰. En outre, isolant les cardiomyocytes des chiots nouveau-nés permet de cultiver un grand nombre de cellules dans un peu de temps, par rapport à l’isolement de cellules coeurs adultes^10,11. Plus important encore, cardiomyocytes adultes cultivés primaires de souris ont la survie à court temps (p. ex. 24 h) et en des temps plus longs points de différencient. La souris néonatales cardiomyocytes peut survivre et être manipulés pendant plus de 7 jours de culture, ce qui les rend idéaux pour tester les effets des médicaments composés et des manipulations génétiques sur la fonction des mitochondries dans les cardiomyocytes¹⁰. Bien sûr, il y a des différences biologiques importantes entre les cellules adultes et néonatales, mais la durée plus longue disponible pour la culture de cellules néonatales qui les rend appropriés pour différents types d’études, y compris ceux de la fonction mitochondriale.

A ce jour, primaire néonatale souris et rat cardiomyocytes cultivés ont servi comme modèles d’études cardiaques bioénergétique^12,13. Ces dernières années, des études a utilisé un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les taux de consommation d’oxygène (OCR) et évaluer la capacité oxydative dans souris et rat néonatal cardiomyocytes^14,15. Alors que comparativement à des rats, la viabilité des cellules de souris néonatales cardiomyocytes est plus faible et a une plus grande variabilité¹⁶. Aussi, la possibilité d’étudier des cellules à partir des modèles de souris génétiquement modifiées rend le modèle de cellule de souris très important. Étant donné que les études de l’OCR sont tellement sensibles à la cellule le nombre et la densité de semis, élaboration d’un protocole simple, fiable et reproductible pour atteindre la viabilité et le rendement cellulaire compatible est nécessaire.

Nous rapportons ici un protocole optimisé qui a été développé qui utilise des cardiomyocytes néonatals cultivés de souris avec un analyseur de flux extracellulaire 96-puits-format pour l’analyse de l’OCR. Ce protocole augmente considérablement la reproductibilité du dosage. En outre, le protocole non seulement fournit un procédé nouveau et reproductible pour l’analyse de l’OCR, mais également pourrait être adapté à une culture de taille plus grande et à d’autres fins expérimentales, telles que celle qui peut être nécessaire d’étudier les fonctions myofibrillaires et intracellulaire voies de signalisation.

En particulier, ce protocole décrit une procédure d’une journée pour l’isolement et culture des cardiomyocytes de souris néonatales dans une plaque de culture de cellules de 96 puits. En outre, il décrit la procédure pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Toutes les solutions utilisées sont stériles ou filtré stérile. Tous les outils sont stérilisés à 75 % d’éthanol. Nous fournissons une Table des matières pour les différentes parties de la procédure. Pour la culture des cardiomyocytes, toutes les procédures et les mesures sont effectuées dans une hotte de culture cellulaire standard. Ce protocole est développé pour l’isolement des coeurs de souris néonatales d’une portée (environ 8-10 chiots). Toutefois, le protocole peut être également adapté pour isoler les cardiomyocytes provenant de plusieurs portées.

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Protocole

Pour travail avec souris néonatales, veuillez vous référer à l’ensemble de lignes directrices locales / l’Institut de l’Université de suite par les programmes de soins aux animaux et adhérer à son établissement ou des règlements appropriés. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par l’UC San Diego institutionnels et animalier utilisation Comité (IACUC) et se conformer aux règlements fédéraux et d’état.

1. préparation des réactifs

1. Préparer 25 mL de solution de prédigestion: HBSS (sans Ca^{2 +} , Mg^{2 +}) additionné de la trypsine (0,5 mg/mL). Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 µm et rester sur la glace jusqu'à utilisation. Font de prédigestion solution le jour de l’expérience.
   Remarque : Il est essentiel d’utiliser HBSS sans Ca^{2 +} et Mg^{2 +}, comme Ca^{2 +} et Mg^{2 +} causera myocyte contraction et la mort cellulaire ultérieure lors de l’isolation.
2. Préparer 30 mL de tampon de digestion de collagénase: collagénase (0,8 mg/mL, environ 350 U/mL) dissoute dans un tampon HBSS (sans Ca^{2 +} , Mg^{2 +}). Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 µm et rester sur la glace jusqu'à utilisation. Solution de digestion de collagénase effectuez le jour de l’expérience.
3. Préparer 500 mL de cardiomyocyte milieux de culture (milieux de culture): mélanger 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de sérum de cheval et 12,5 mL de FBS. Compléter avec la pénicilline 1 % et 1 % solution de streptomycine.
4. Préparer mitochondrial test d’effort moyen: faire 200 mL de DMEM base milieu de stress test (DMEM sans NaHCO₃, voir la Table des matières) additionné de pyruvate de sodium 1 mM, 2 mM de L-glutamine et 10 mM de glucose et 2 mM Hepes.
   Remarque : Faire 1 L de milieu DMEM sans pyruvate de sodium, L-glutamine, de glucose et Hepes, déclarant stérile et stocker à 4 ° C. Préparer le milieu d’épreuve de stress le jour du test en ajoutant d’autres réactifs. À l’aide de DMEM moyen sans NaHCO₃ est critique.
5. Ajuster le pH des médias mitochondrial stress test à 7.4 le jour d’utilisation. Médias chauds à 37 ° C avant utilisation.
6. Préparer l’oligomycine: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
7. Préparer le FCCP: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
8. Préparer l’antimycine A: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
9. Préparer la roténone: préparer 5 mL d’une solution mère de 5 mM dans le DMSO, faire 250 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
   Remarque : Tous les réactifs et les solutions utilisées dans le présent protocole sont énumérées au tableau 1.

2. récolte et prédigestion des cœurs de souris néonatales (jour 1)

1. Autoclave ciseaux, pinces et une cuillère de Moria pour stériliser.
2. Exécutez toutes les étapes dans la hotte de culture cellulaire pour la stérilité.
3. Aliquote 5 mL de HBSS (sans Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) dans chaque puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits ; placer sur la glace. Aliquote 10 mL de HBSS dans une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm.
4. Préparer 20 mL de solution de trypsine prédigestion dans un tube conique stérile de 50 mL. Garder toutes les solutions sur la glace.
5. Tremper rapidement la souris nouveau-né (jour 0) dans la solution d’éthanol à 70 % pour la stérilisation.
6. Décapiter des chiots avec des ciseaux stériles (tout droit) sans anesthésie et puis ouvrez le coffre le long du sternum pour permettre l’accès à la cage thoracique et le cœur. (Figure 1 a)
   Remarque : 1) il est essentiel d’utiliser souris néonatales P0 pour atteindre la viabilité cellulaire élevée. 2) cette méthode d’euthanasie est autorisée pour les nouveau-nés conformément aux NIH et l’American Veterinary Medical Association directives ¹⁷.
7. Coeurs extrait le corps avec des ciseaux fins et transférer immédiatement dans la boîte de Petri stérile cellule contenant HBSS (sans Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) (Figure 1 b).
8. Supprimer n’importe quel tissu pulmonaire résiduelle, navires plus grands, etc. (et les oreillettes, si vous le souhaitez). Laver les coeurs dans la solution HBSS selon agitation douce.
9. Couper chaque coeur avec une paire de ciseaux fine en 8 morceaux et transférer le tissu cardiaque tous avec une pince dans un puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits avec HBSS (Figure 1 et D 1).
10. Laver les coeurs en transférant les cœurs de puits à puits de la plaque 6 puits remplie de HBSS, à l’aide d’une cuillère de Moria (Figure 1).
    Remarque : Transférer les cœurs de puits à puits est suffisante pour laver le sang. Puisque le sang interfère avec la digestion enzymatique, il est important de laver les coeurs avec HBSS et enlever le sang.
11. Transférer les coeurs avec une cuillère de Moria dans un tube conique contenant 20 mL de trypsine (0,5 mg/mL) et incuber avec agitation modérée à 4° C pendant 4 h (Figure 1E).

3. préparer une microplaque 96 puits de Culture (jour 1)

1. Préparer 5 mL de solution d’enrobage : PBS contenant 0,5 % de gélatine (autoclave avant utilisation) et la fibronectine solution à 1 %. (par exemple 5 mL de solution de gélatine plus 50 µL de solution de fibronectine)
2. Aliquote 50 µL de solution d’enrobage dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire de 96 puits (voir Table des matières). Si les bulles sont présentes, supprimez-les à l’aide d’une pipette de 20 µL à sucer des bulles sur.
   Remarque : Il est important de couvrir toute la surface de chaque puits avec solution d’enrobage.
3. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire de 37 ° C pendant 1 h ou plus pour permettre un séchage de l’enduit de la matrice.
4. Aspirer toute solution de revêtement résiduel avant d’ensemencer les cardiomyocytes.

4. enzymatique Digestion et bordé de cellules (jour 1)

1. Réchauffez la solution de digestion de collagénase dans un bain-marie à 37 ° C.
   Remarque : Cette étape est importante pour réaliser une digestion enzymatique efficace.
2. Déplacer le tube conique contenant les cœurs et solution de prédigestion de 4 ° C pour une hotte de culture cellulaire. (Figure 1F)
3. Laisser le cœur se déposent au fond du tube et enlever la solution de digestion préalable à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL (1 à 2 mL de milieu d’isolement peuvent rester dans le tube).
4. Ajouter 10 mL de HBSS dans le tube. Remettre en suspension les coeurs avec HBSS 2 ou 3 fois pour laver la trypsine à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Aspirer HBSS (1 à 2 mL peuvent rester dans le tube).
5. Ajouter 10 mL de solution de digestion de collagénase préchauffé dans le tube avec un cœur. (Figure 1)
6. Incuber le tube avec un cœur dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min sans agitation (1er digestion).
7. Après digestion 1er, déplacer le tube à la hotte de la culture cellulaire. Triturer doucement coeurs en re-suspendant les coeurs à l’intérieur du tube délicatement 10 fois en utilisant une pipette sérologique de 10 mL. Cela permettra aux coeurs de se disperser et les cellules qui sortira du tissu cardiaque. (Figure 1 H)
   Remarque : Cardiomyocytes étant fragiles, douce trituration est importante de parvenir à la viabilité de haute.
8. Laissez les tissus non digérés couler, transvaser digérée solution enrichie dans les cardiomyocytes (environ 9 à 10 mL) dans un nouveau tube conique et immédiatement ajouter une quantité égale de milieux de culture cellulaire pour arrêter la digestion de collagénase.
9. Ajouter 10 mL de solution de digestion de collagénase dans le tube contenant le tissu cardiaque non digérés restants.
10. Incuber le tube avec le tissu cardiaque dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min (2ème digestion).
11. Répétez la procédure 4.7 et 4.8.
    Remarque : S’il y a encore beaucoup non digéré tissu, répéter une fois de plus la digestion. Toutefois, dans la plupart des cas, deux digestions sont assez pour disperser la plupart des cellules du tissu cardiaque.
12. Placer une cellule stérile-passoire (mailles de nylon de 100 µm) dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL. Pré mouillage le tamis cellulaire avec 2-3 mL de milieu de culture cellulaire et passer des cellules par l’intermédiaire de la cellule-crépine. Rincer la crépine-cellule avec 2-3 mL de milieu de culture cellulaire. (Figure 1I)
13. Centrifuger conique tube contenant des cardiomyocytes pendant 5 min à 180 g (Figure 1J). Aspirer le surnageant (Figure 1 K), qui contiendra les débris tissulaires cellulaires et resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture cellulaire (Figure 1 L).
14. Doucement remettre en suspension les cellules et les cellules de la plaque sur une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm (plastique sans n’importe quel type de revêtement) et incuber pendant 1 heure dans un incubateur de culture cellulaire (1er pré bordé) (Figure 1 M). Cette étape préalable de placage permet aux non-cardiomyocytes, tels que les fibroblastes et les cellules endothéliales, à adhérer au plat culture cellulaire non couché.
    Remarque : À ce stade, cardiomyocytes sont généralement une forme ronde et être brillants sous le microscope. (Figure 1N).
15. Après l’incubation de 1 h, doucement agiter la plaque, laver les cellules non adhérentes (enrichis dans les cardiomyocytes) de la boîte de Petri de 10 cm et remettre en suspension les cellules en pipettant également à plusieurs reprises, le milieu de culture cellulaire sur le plat à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Ensuite, transférer les cellules non adhérentes (enrichis dans les cardiomyocytes) dans une boîte de Petri de nouveau 10 cm cellule (plastique sans revêtement) et incuber pendant une 1 heure supplémentaire dans un incubateur de culture cellulaire (2ème pré bordé).
    Remarque : Les cellules qui s’attachent à la plaque non revêtues sont principalement non-cardiomyocytes : les fibroblastes et les cellules endothéliales, qui peuvent être visualisées au microscope (Figure 1O).
16. Après la 2e avant électrodéposition, doucement agiter la plaque, laver les cellules non adhérentes (cardiomyocytes) de la boîte de Petri de 10 cm, puis transférer les cardiomyocytes dans un nouveau tube conique de 50 mL.

5. comptage des cellules et bordé dans une plaque de Culture cellulaire de 96 puits (jour 1)

1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
2. Les cellules de la plaque dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits matrice extracellulaire enduite à une densité comprise entre 10-30 x 10³ cellules/puits à l’aide d’une pipette multi-canaux dans un volume final de 200 µL (Figure 1 P). Utiliser le puits A1, A12, H1 et H12 pour arrière-plan : ajouter 200 µL de milieu de culture comme les autres puits dans ces puits (pas de cellules). Incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° C cell culture.
   Remarque : Dans cette étude, la consommation d’oxygène a été testée à l’aide de la densité des cellules différentes tels que 10 x 10³, 20 x 10³ou 30 x 10³ cellules par puits. (Figure 2 a). Aussi, comme ci-dessus, cardiomyocytes immédiatement après l’isolement sont généralement une forme ronde et être brillants sous le microscope. Cellules viables seront aplatissent au sein de 16 à 24 heures de culture.

6. test de consommation d’oxygène à l’aide d’un analyseur de Flux extracellulaire format 96-puits (jour 2)

Remarque : Test de consommation d’oxygène peut être effectuée un jour après l’ensemencement les cellules ou version ultérieure. Néonatales cardiomyocytes cultivés à l’aide de ce protocole peut survivre jusqu'à 7 jours après isolement.

1. Hydrater une cartouche de sonde d’analyseur de flux (voir Table des matières) pour au moins 3 heures, mais idéalement pour une journée complète, avant le dosage. Ajouter 200 µL de solution de degré (voir Table des matières) dans chaque puits de la plaque de l’utilitaire, replacez la cartouche de la sonde sur la plaque de l’utilitaire et incuber dans un incubateur à 37 ° C sans O₂ supplémentation ou de CO₂ .
2. Milieux de culture cellulaire à changer au milieu de stress test de mitochondries une heure avant le dosage. Cardiomyocytes sont fragiles. Par conséquent, doucement enlever les milieux de culture cellulaire à l’aide d’une pipette multi-canaux et laver les cellules avec 200 µL de médias préchauffé mitochondrial stress test deux fois. Après le deuxième lavage, ajouter 175 µL de milieux d’essai de stress mitochondries préchauffé et culture les cellules dans un incubateur à 37 ° C sans O₂ supplémentation ou de CO₂ .
3. Préparer des composés d’essai concentré. Pour le test de stress de mitochondries, préparer 3,0 mL de chacune des 16 µM l’oligomycine, 9 µM FCCP et un mélange de 20 µM roténone et 20 µM l’antimycine A, tous en milieu d’épreuve de stress mitochondrial.
   Remarque : Chaque composé à la concentration décrite a été testé. Cependant, le titrage de la concentration de chaque composé dans son propre laboratoire est nécessaire.
4. Charger 25 µL de chaque composé dans les raccords d’injecteur de la cartouche de sonde à l’aide d’une pipette multicanaux (Figure 1 q). Le volume et la concentration finale sont décrites dans le tableau 2.
5. Mettre en place le protocole d’analyse de flux extracellulaire. Le programme est décrit en tableau 3.
6. Démarrez le programme. Tout d’abord, mettre la cartouche de sonde dans la machine pour l’étalonnage (Figure 1R). Remplacer le degré pour la plaque de test une fois terminée l’étape de calibrage.
   Remarque : À l’aide du logiciel fourni par le fabricant, indiquent les groupes de puits et de chaque composé et le port.
7. Si vous le souhaitez, après l’essai, soigneusement jeter tous les milieu à l’aide d’une pipette multi-canaux et stocker la microplaque de culture cellulaire à-20 ° C pour la normalisation future cellule à dosage protéique.
8. Mesurer la teneur en protéines. Ajouter 50 µL de solution étalon de lyse cellulaire RIPA (voir Table des matières). Incuber les plaques sur la glace pendant 30 min à entièrement lyser les cellules. Transférer tout le matériel pour une nouvelle plaque de fond clair plat 96 puits assay.
9. Mesurer la concentration de protéines par dosage de la BCA selon le protocole du fabricant.
   Remarque : Revêtement du puits avec matrice extracellulaire entraîne une concentration élevée en protéines dans chaque puits. Par conséquent, soustrayez le montant du puits de fond (pas de cellules) pour obtenir la concentration de protéines cellulaires réelles. La concentration de protéines dérivée de cellules est faible dans une plaque à 96 puits de culture. En outre, la concentration de protéines peut varier de puits à puits à cause du revêtement de la matrice extracellulaire. Par conséquent, en utilisant le nombre de cellules de normaliser l’OCR est suggéré.

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Résultats

En utilisant le protocole décrit, les coeurs ont été isolées de chiots nouveau-nés jour 0. 5 x 10⁵ cellules/pup ont été obtenues, et les cardiomyocytes ont été injectées à des densités de 10 x 10³, 20 x 10³ou 30 x 10³ cellules/puits, en plaques bien 96 (Figure 2 a). Après une culture, les cardiomyocytes trouvées bien attaché à la surface recouverte de plastique et il y avait très peu de cellules seu...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons établi un protocole simple pour isoler et à cultiver des cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris. En utilisant ces cardiomyocytes, nous avons également optimisé les conditions pour mesurer le taux de consommation d’oxygène à l’aide d’un système d’analyseur de flux extracellulaire. Le protocole permet d’utiliser des cardiomyocytes de rats nouveau-nés de souris comme système modèle pour examiner la façon dont les différents facteurs peuvent modifier la consommation ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	SIGMA	A8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores	FALCON	352360	To capture undigested tissue
Collagenase type II	Worthington	LS004176	To make collagenase digestion solution
D-Glucose	SIGMA	75351	To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose	Life technologies	11965-092	To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	SIGMA	C2920	Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies	26140-079	To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma	SIGMA	F1141-5MG	To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors	Fine Sciences Tools	14060-10	For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin	SIGMA	G-1890	To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum	Life technologies	26050-088	To make cell culture medium
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	To make mitochodnrial stress test medium
M-199	Cellgro	10-060-CV	To make cell culture medium
Moria spoon	Fisher scientific	NC9190356	To wash hearts
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer	Fisher scientific	89900	To lyse the cells for protein assay
Rotenone	SIGMA	R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent		Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors	Fine Sciences Tools	91401-12	For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size			For sterile filtration of digestion medium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	To make pre-digestion solution