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Neste Artigo

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  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O objetivo do presente protocolo é ilustrar como usar rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio no coração.

Resumo

Mitocôndrias e metabolismo oxidativo são essenciais para manter a função do músculo cardíaco. A pesquisa mostrou que a disfunção mitocondrial é um importante fator contribuinte para insuficiência cardíaca encontrada na insuficiência cardíaca. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial defeituosa pode ter efeitos benéficos para melhorar a função cardíaca no coração falhar. Portanto, estudar os mecanismos de regulação e identificando novos reguladores de função mitocondrial poderiam fornecer uma visão que poderia ser usada para desenvolver novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças cardíacas. Aqui, a respiração mitocondrial miócito cardíaco é analisada usando um sistema de cultura de célula única. Primeiro, um protocolo foi otimizado para isolar rapidamente e cultura alta viabilidade neonatal do mouse cardiomyocytes. Então, um analisador de fluxo extracelular de 96 poços formato é usado para avaliar a taxa de consumo de oxigênio destas cardiomyocytes. Para este protocolo, nós otimizado semeadura condições e demonstrou que essa taxa de consumo de oxigênio de cardiomyocytes rato neonatal pode ser facilmente avaliada em um analisador de fluxo extracelular. Finalmente, notamos que nosso protocolo pode ser aplicado a um tamanho maior de cultura e outros estudos, tais como sinalização intracelular e contrátil função de análise.

Introdução

Para sustentar uma função contrátil cardíaca contínua, cardiomyocytes deve manter um fornecimento constante de energia celular, principalmente na forma de ATP1. No coração, aproximadamente 95% de ATP é gerado pela mitocôndria, principalmente através da fosforilação oxidativa, mostrando que as mitocôndrias desempenham um papel bioenergético crucial na função cardíaca2,3. Esta noção de apoio é que a desregulação da função mitocondrial pode levar a miocardiopatia e insuficiência cardíaca4,5. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial foi mostrado para melhorar a função cardíaca de falhar o coração6,7. Portanto, estudar o mecanismo de bioenergética mitocondrial e identificando novos reguladores da função mitocondrial em cardiomyocytes não revelarei apenas insights mecanicistas de produção de energia cardíaca, mas também poderiam fornecer uma visão que vai levar para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para tratar doenças cardíacas6,8.

Em comparação com todo o coração, que contém uma mistura de miócitos e miócitos não9, casos de culturas são extremamente puro, com contaminação mínima de non-miócitos do coração, como fibroblastos e células endoteliais10. Além disso, isolar cardiomyocytes de filhotes neonatais permite cultivo um grande número de células em uma pequena quantidade de tempo, em comparação com células isolantes de corações adultos10,11. Mais importante ainda, principal do rato adulto culto cardiomyocytes têm curta sobrevivência vezes (por exemplo, 24 h) e no tempo mais pontos de diferenciam. Cardiomyocytes rato neonatal pode sobreviver e ser manipulado por mais de 7 dias em cultura, tornando-os ideais para testar os efeitos dos compostos de drogas e manipulação genética sobre a função das mitocôndrias em cardiomyocytes10. Claro, existem significativas diferenças biológicas entre as células de adultas e Neonatais, mas a duração mais longa disponível para cultura de células neonatais fá-los apropriados para diversos tipos de estudos, incluindo os da função mitocondrial.

Até à data, principal culto neonatal camundongo e rato cardiomyocytes têm sido utilizados como modelos para estudar bioenergética cardíaca12,13. Nos últimos anos, estudos utilizados um analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e avaliar a capacidade oxidativa em camundongo e rato neonatal cardiomyocytes14,15. Enquanto comparado com ratos, a viabilidade celular de rato cardiomyocytes neonatal é mais baixa e tem maior variabilidade16. Também, a capacidade de estudar células de modelos do rato geneticamente o modelo de célula de rato faz muito importante. Dado que os estudos de OCR são tão sensíveis ao celular número e densidade de semeadura, desenvolvimento de um protocolo simples, confiável e reprodutível para alcançar a viabilidade e rendimento consistente da célula é necessário.

Aqui, nós relatamos um protocolo otimizado que tem sido desenvolvido que usa culta rato neonatal cardiomyocytes juntamente com um analisador de fluxo extracelular 96-bem-formato para análise de OCR. Este protocolo aumenta a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, o protocolo não só fornece um método reprodutível para análise de OCR e romance, mas também pode ser adaptado para uma cultura de tamanho maior para outros fins experimentais, como a que pode ser necessária para estudar funções miofibrilar e intracelular vias de sinalização.

Em particular, este protocolo descreve um procedimento de um dia para isolamento e cultura de rato neonatal cardiomyocytes em uma placa de cultura de células 96 poços. Além disso, ele descreve o procedimento para medir o consumo de oxigênio, usando um analisador de fluxo extracelular. Todas as soluções utilizadas são estéreis ou filtrado estéril. Todas as ferramentas são esterilizadas por 75% de etanol. Nós fornecemos uma Tabela de materiais para várias partes do processo. Para cultivo cardiomyocytes, todos os procedimentos e as etapas são executadas em uma capa de cultura de célula padrão. Este protocolo é desenvolvido para o isolamento de corações de rato neonatal de uma ninhada (aproximadamente 8-10 filhotes). No entanto, o protocolo também pode ser adaptado para isolar cardiomyocytes de várias ninhadas.

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Protocolo

Para trabalho com ratos neonatais, por favor consulte a universidade local/Instituto conjunto de diretrizes adiante pelos programas de cuidados com animais e aderir a institucionais e outros regulamentos adequados. Todos os métodos descritos no presente protocolo tenham sido aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e UC San Diego institucional Cuidado Animal e aderirem aos regulamentos federais e estaduais.

1. preparação dos reagentes

  1. Prepare-se 25 mL da solução de pré-digestão: HBSS (sem o Ca2 + e Mg2 +) suplementado com tripsina (0,5 mg/mL). Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. Fazer pré-digestão solução no dia do experimento.
    Nota: É fundamental usar HBSS sem Ca2 + e Mg2 +, como Ca2 + e Mg2 + causará contração miócito e morte celular subsequente durante o isolamento.
  2. Prepare 30 mL de tampão de digestão de colagenase: colagenase (0,8 mg/mL, aproximadamente 350 U/mL) dissolvido em tampão HBSS (sem o Ca2 + e Mg2 +). Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. Fazer a solução de digestão de colagenase no dia do experimento.
  3. Preparar 500 mL de casos cultura media (mídia de crescimento): misture 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de soro de cavalo e 12,5 mL de FBS. Suplemento com penicilina 1% e 1% solução de estreptomicina.
  4. Preparar o meio de teste de estresse mitocondrial: fazer 200 mL de DMEM com base em teste de estresse suplementado (DMEM sem NaHCO3, consulte Tabela de materiais) com piruvato de sódio 1 mM, 2 mM L-glutamina e glicose 10 mM e 2 mM Hepes.
    Nota: Faça 1 L de meio com DMEM sem piruvato de sódio, L-glutamina, glicose e Hepes, limador estéril e armazene em 4 ° C. Prepare o suporte de teste de stress no dia do ensaio, adicionando outros reagentes. Usando DMEM meio sem NaHCO3 é crítico.
  5. Ajuste o pH da mídia mitocondrial teste de estresse para 7.4 no dia da utilização. Mídia aquecida a 37 ° C antes do uso.
  6. Preparar oligomicina: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
  7. Prepare-se Compararia: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
  8. Prepare-se antimycin A: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
  9. Preparar a rotenona: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.
    Nota: Todos os reagentes e soluções utilizados neste protocolo são listadas na tabela 1.

2. colheita e pré-digestão de corações de ratos Neonatal (dia 1)

  1. Autoclave tesouras, pinças e uma colher de Moria para esterilizar.
  2. Execute todas as etapas do capuz de cultura celular para esterilidade.
  3. Alíquota 5 mL de HBSS (sem o Ca2 +, Mg2 +) em cada poço de uma placa de cultura de células de 6-poços; Coloque no gelo. Alíquota 10 mL de HBSS em um prato de cultura de célula de 10 cm.
  4. Prepare-se 20 mL da solução de tripsina pré-digestão em um tubo cônico estéril de 50 mL. Mantenha todas as soluções no gelo.
  5. Mergulhe rapidamente os ratos recém-nascido (dia 0) em solução de etanol 70% para a esterilização.
  6. Decapitar filhotes usando uma tesoura esterilizada (direto) sem anestesia e então abra o baú ao longo do esterno para permitir o acesso à cavidade torácica e o coração. (Figura 1A)
    Nota: 1) é fundamental usar ratos neonatais P0 para alcançar a viabilidade celular alta. 2) este método de eutanásia é permitido para recém-nascidos em conformidade com diretrizes de NIH e Associação Médica Veterinária americana 17.
  7. Extrair o coração de um corpo com uma tesoura bem e transferir imediatamente para o prato de cultura de células estéreis contendo HBSS (sem o Ca2 +, Mg2 +) (figura 1B).
  8. Remover qualquer tecido pulmonar residual, vasos maiores, etc. (e átrios, se desejado). Lave os corações na solução HBSS usando agitação suave.
  9. Corte cada coração com uma tesoura bem em 8 pedaços e transferir o todo o tecido cardíaco com pinças em um poço de uma placa de cultura de células de 6-poços com HBSS (Figura 1 e 1 D).
  10. Lave os corações, transferindo os corações de bem para bem na placa 6-bem preenchida com HBSS, usando uma colher de Moria (Figura 1).
    Nota: Transferir os corações de poço para poço é suficiente para lavar o sangue. Desde que o sangue interfere com a digestão enzimática é importante lavar os corações com HBSS e remover o sangue.
  11. Transferir os corações com uma colher de Moria em um tubo cônico contendo 20 mL de tripsina (0,5 mg/mL) e incubar com agitação suave a 4° C por 4 h (Figura 1E).

3. prepare uma placa de cultura de 96 poços (dia 1)

  1. Prepare-se 5 mL da solução de revestimento: PBS contendo 0,5% de gelatina (autoclave antes do uso) e 1% solução de fibronectina. (por exemplo, 5 mL de solução de gelatina mais 50 µ l de solução de fibronectina)
  2. Alíquota 50 µ l de solução de revestimento em cada poço da placa de cultura de células 96 poços (ver Tabela de materiais). Se as bolhas estiverem presentes, removê-los usando uma pipeta de 20 µ l de chupar as bolhas para fora.
    Nota: É importante cobrir toda a área da superfície de cada poço com solução de revestimento.
  3. Incube a placa numa incubadora de cultura de célula de 37 ° C por 1h ou mais para permitir a secagem do revestimento matriz.
  4. Aspire qualquer solução de revestimento residual antes da semeadura cardiomyocytes.

4. enzimática digestão e chapeamento de células (dia 1)

  1. Pré-aquecer a solução de digestão de colagenase em banho maria a 37 ° C.
    Nota: Este passo é importante para alcançar eficiente digestão enzimática.
  2. Mova o tubo cônico contendo solução de pré-digestão de 4 ° C para uma capa de cultura celular e corações. (Figura 1F)
  3. Deixe o coração afunda até o fundo do tubo e remove a solução de pré-digestão usando uma pipeta sorológica 10ml (1 a 2 mL do meio de isolamento podem permanecer no tubo).
  4. Adicione 10 mL de HBSS dentro do tubo. Re-suspender os corações com HBSS 2 - 3 vezes a desbotar tripsina utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Aspire HBSS (1 a 2 mL podem permanecer no tubo).
  5. Adicione 10 mL de solução de digestão de colagenase previamente aquecido dentro do tubo com corações. (Figura 1)
  6. Incubar o tubo com corações em banho-maria 37 ° C por 10 min sem agitação (1º digestão).
  7. Após a digestão 1º, mova o tubo ao capô de cultura de células. Delicadamente, Triture corações, re-suspendendo os corações no interior do tubo suavemente 10 vezes utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Isto permitirá que corações para dispersar e células ser liberado do tecido cardíaco. (Figura 1 H)
    Nota: Desde que cardiomyocytes são frágeis, trituração suave é importante para alcançar alta viabilidade.
  8. Deixe o tecido não digerido afundar, transferir a solução digerida enriquecida em cardiomyocytes (aproximadamente 9-10 mL) para um novo tubo cónico e imediatamente adicionar uma quantidade igual de meios de cultura celular para parar a digestão de colagenase.
  9. Adicione 10 mL de solução de digestão de colagenase no tubo contendo o tecido restante do coração não digerido.
  10. Incubar o tubo com o tecido do coração em um banho de água de 37 ° C por 10 min (2º digestão).
  11. Repita o procedimento 4.7 e 4.8.
    Nota: Se há tecido muito ainda não digerido, repita a digestão mais uma vez. No entanto, na maioria dos casos, duas digestões são suficientes para dispersar a maioria das células do tecido do coração.
  12. Coloque um celular-filtro estéril (100 µm de malha de nylon) em um novo tubo cônico estéril 50 mL. Pre-molhado o filtro célula com 2-3 mL de meio de cultura celular e passar as células até a célula-filtro. Lave o filtro-célula com 2-3 mL de meio de cultura celular. (Figura 1I)
  13. Centrifugar o tubo cônico contendo cardiomyocytes por 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspire o sobrenadante (Figura 1 K), que irá conter os restos de tecido celular e ressuspender o sedimento celular em 10 mL de meio de cultura celular (Figura 1 L).
  14. Delicadamente Ressuspender as células e as células da placa numa placa de cultura de células de 10 cm (sem qualquer tipo de revestimento de plástico) e incube por 1h em uma incubadora de cultura celular (1º pré-plating) (Figura 1 M). Esta etapa pré-chapeamento permite que não-cardiomyocytes, como fibroblastos e células endoteliais, para aderir ao prato sem revestimento de cultura de células.
    Nota: Neste ponto, cardiomyocytes são normalmente uma forma redonda e aspecto brilhante ao microscópio. (Figura 1N).
  15. Após a incubação de 1 h, suavemente agitar a placa, lavar as células não-aderente (enriquecidas em cardiomyocytes) da placa de cultura de 10 cm e ressuspender as células pipetando repetidamente o meio de cultura celular sobre o prato com uma pipeta sorológica 10ml. Em seguida, transferir as células não-aderente (enriquecidas em cardiomyocytes) para uma nova placa de cultura de células de 10 cm (sem qualquer revestimento de plástico) e incubar durante uma 1h adicional em uma incubadora de cultura celular (2ª pré-plating).
    Nota: As células que prendem a placa não revestidos são predominantemente não-cardiomyocytes: fibroblastos e células endoteliais, que podem ser visualizadas sob um microscópio (Figura 1O).
  16. 2º Pré-chapeamento, suavemente agitar a placa, lavar as células não-aderente (cardiomyocytes) do prato 10cm cultura depois de transferir o cardiomyocytes para um novo tubo cónico de 50 mL.

5. contagem de células e chapeamento de células em uma placa de cultura de células 96 poços (dia 1)

  1. Conte as células usando um hemocytometer.
  2. As células da placa em uma placa de cultura de células 96 poços revestida da matriz extracelular em uma densidade entre 10 a 30 x 103 células/poço usando uma pipeta multicanal em um volume final de 200 µ l (Figura 1 P). Use poços A1, A12, H1 e H12 para plano de fundo: Adicionar 200 µ l de meio de cultura como outros poços nesses poços (sem pilhas). Incube a placa numa incubadora de cultura de células de 37 ° C.
    Nota: Neste estudo, o consumo de oxigênio foi testado usando densidades de célula diferente como 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 células/poço. (Figura 2A). Também, como acima, cardiomyocytes imediatamente depois de isolamento são geralmente uma forma redonda e aspecto brilhantes ao microscópio. Células viáveis vão achatar dentro 16-24h de cultura.

6. oxigênio consumo ensaio utilizando um analisador de fluxo extracelular 96-bem-formato (dia 2)

Nota: Ensaio de consumo de oxigênio pode ser realizado um dia depois do chapeamento as células ou mais tarde. Cardiomyocytes neonatal cultivadas usando este protocolo pode sobreviver até 7 dias pós o isolamento.

  1. Hidratar um cartucho de sensor de analisador de fluxo (ver Tabela de materiais) para pelo menos 3 horas, mas idealmente para um dia inteiro, antes do ensaio. Adicionar 200 µ l de solução de Calibrant (ver Tabela de materiais) em cada poço da placa de utilitário, volte a colocar o cartucho do sensor na placa de utilitário e incubar em uma incubadora de 37 ° C sem CO2 ou suplementação de2 O.
  2. Mudar de meios de cultura celular para meio de teste de estresse de mitocôndrias uma hora antes do ensaio. Cardiomyocytes são frágeis. Portanto, suavemente remover os meios de cultura de células usando uma pipeta multicanal e lavar as células com 200 µ l de mídia mitocondrial pré-aquecido estresse teste duas vezes. Depois da segunda lavagem, adicione 175 µ l de mídia de teste de estresse de mitocôndrias pré-aquecido e cultura de células em uma incubadora de 37 ° C sem CO2 ou suplementação de2 O.
  3. Prepare teste concentrada compostos. Teste de estresse de mitocôndrias, prepare 3,0 mL de 16 µM oligomicina, 9 µM Compararia e uma mistura de 20 rotenona µM e 20 µM antimycin A, tudo no meio de teste de estresse mitocondrial.
    Nota: Cada composto na concentração descrito foi testado. No entanto, titulada a concentração de cada composto no próprio laboratório é necessária.
  4. Carrega 25 µ l de cada composto para os portos de injector do cartucho sensor usando uma pipeta multicanal (Figura 1T). O volume e a concentração final são descritos na tabela 2.
  5. Configure o protocolo de ensaio de fluxo extracelular. O programa está descrito no tabela 3.
  6. Inicie o programa. Primeiro, coloque o cartucho de sensor na máquina para calibração (Figura 1R). Substitua o calibrant para a placa de ensaio, uma vez que a etapa de calibração é feita.
    Nota: Usando o software fornecido pelo fabricante, indicam que grupos de poços e cada composto e Porto.
  7. Se desejado, após o ensaio, cuidadosamente descartar todos doseamento usando uma pipeta multicanal e armazenar a microplaca de cultura de célula a-20 ° C para normalização futura célula usando o ensaio da proteína.
  8. Medir o teor de proteína. Adicionar 50 µ l de solução de lise celular RIPA padrão (veja a Tabela de materiais). Incube a placa no gelo por 30 min para totalmente lyse pilhas. Transferi todo o material para uma nova placa de ensaio bem fundo claro plano 96.
  9. Medir a concentração de proteína por ensaio BCA de acordo com o protocolo do fabricante.
    Nota: Revestimento do poço com matriz extracelular resulta em uma concentração de proteína em cada poço. Portanto, subtrai a quantidade de well(s) o plano de fundo (sem pilhas) para obter a concentração de proteína de célula real. A concentração de proteínas derivada de células é baixa em uma placa de cultura de 96 poços. Além disso, a concentração de proteína pode variar de para-bem graças ao revestimento de matriz extracelular. Portanto, usar o número do celular para normalizar o OCR é sugerido.

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Resultados

Usando o protocolo descrito, corações foram isoladas de filhotes neonatal dia 0. 5 x 105 células/filhote foram obtidos, e cardiomyocytes foram semeadas em densidades de 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 células/poço, em 96 placas bem (Figura 2A). Depois da cultura durante a noite, foram encontrados cardiomyocytes bem anexado à superfície revestida de plástico e havia muito poucas células solteira (as células n...

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Discussão

Neste estudo, nós estabelecemos um protocolo simples para isolar e cultivar cardiomyocytes neonatal do mouse. Usando estes cardiomyocytes, nós também Aperfeiçoamos as condições para medir a taxa de consumo de oxigênio por meio de um sistema analisador de fluxo extracelular. O protocolo permite que se use rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio nas células de trabalho principal do coração, semelhante ao que seria medido no órgã...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório de Murphy e laboratório de Ross. Este trabalho é apoiado pela associação americana do coração (14SDG17790005) para Y.C. NIH (HL115933, HL127806) e mérito de VA (BX003260) para R.S.R.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Antimycin ASIGMAA8674Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm poresFALCON352360To capture undigested tissue
Collagenase type IIWorthingtonLS004176To make collagenase digestion solution
D-GlucoseSIGMA75351To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucoseLife technologies11965-092To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and HepesSIGMAD5030-10X1LTo make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)SIGMAC2920Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)Life technologies26140-079To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasmaSIGMAF1141-5MGTo make coating solution for tissue culture plates
Fine scissorsFine Sciences Tools14060-10For dissection of hearts
Gelatin from porcine skinSIGMAG-1890To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)Cellgro21-022-CVTo wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)Fisher scientific15630080To make mitochodnrial stress test medium
Horse serumLife technologies26050-088To make cell culture medium
L-GlutamineSIGMAG-3126To make mitochodnrial stress test medium
M-199Cellgro10-060-CVTo make cell culture medium
Moria spoonFisher scientificNC9190356To wash hearts 
OligomycinSIGMA75351-5MGInhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA bufferFisher scientific89900To lyse the cells for protein assay
RotenoneSIGMAR8875Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux
Analyzer		AgilentDevice used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvateSIGMAP2256To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissorsFine Sciences Tools91401-12For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm sizeFor sterile filtration of digestion medium
TrypsinUSB Corporation22715 25GMTo make pre-digestion solution

Referências

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

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