Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

Resumen

El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como modelo para analizar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en el corazón.

Resumen

Mitocondrias y metabolismo oxidativo son críticos para mantener la función del músculo cardiaco. Investigaciones han demostrado que la disfunción mitocondrial es un factor importante que contribuye al deterioro de la función cardiaco en insuficiencia cardíaca. Por el contrario, la restauración de la función mitocondrial defectuosa puede tener efectos beneficiosos para mejorar la función cardiaca en el corazón de la falla. Por lo tanto, estudiar los mecanismos de regulación y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial pueden proporcionar la penetración que podría utilizarse para desarrollar nuevos blancos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades del corazón. Aquí, la respiración mitocondrial del miocito cardiaco se analiza mediante un sistema de cultivo de célula única. En primer lugar, se ha optimizado un protocolo para aislar rápidamente y cultura alta viabilidad neonatal ratón cardiomiocitos. Entonces, un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos se utiliza para evaluar la tasa de consumo de oxígeno de estos cardiomiocitos. De este protocolo, optimizar las condiciones de siembra y demostró que tasa de consumo de oxígeno de cardiomiocitos de ratón neonatal puede evaluarse fácilmente en un analizador de flujo extracelular. Por último, observamos que nuestro protocolo se puede aplicar a un tamaño más grande de la cultura y análisis de la función de otros estudios, como la señalización intracelular y contráctil.

Introducción

Para mantener una función contráctil cardiaca continua, cardiomiocitos deben mantener un suministro constante de energía celular principalmente en forma de ATP¹. En el corazón, se genera aproximadamente el 95% de ATP por las mitocondrias, principalmente a través de la fosforilación oxidativa, mostrando que las mitocondrias desempeñan un papel crucial de la bioenergético en la función cardiaca^2,3. Apoyo a esta noción es que la desregulación de la función mitocondrial puede conducir a cardiomiopatía e insuficiencia cardíaca^4,5. Por el contrario, restauración de la función mitocondrial se ha demostrado para mejorar la función cardiaca de la falla del corazón^6,7. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de la bioenergética mitocondrial y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial en los cardiomiocitos no sólo revela ideas mecanicistas de la producción energética cardiaca pero también pueden proporcionar la penetración que desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades del corazón^6,8.

Comparado con el corazón entero, que contiene una mezcla de miocitos y miocitos no⁹, cultivos de cardiomiocitos son extremadamente puro, con la mínima contaminación de no miocitos del corazón, tales como fibroblastos y células endoteliales¹⁰. Además, aislar los cardiomiocitos de los cachorros neonatales permite cultivar un gran número de células en una pequeña cantidad de tiempo, comparado con el aislamiento de las células de corazones adulto^10,11. Lo más importante, ratón adulto culto primario cardiomiocitos tienen supervivencia corta veces (p. ej. 24 h) y en tiempo de puntos de diferencian. Cardiomiocitos neonatales ratón pueden sobrevivir y ser manipulada por más de 7 días en cultivo, lo que es ideal para probar los efectos de los compuestos de drogas y manipulación de genes en la función de la mitocondria en cardiomiocitos¹⁰. Por supuesto, existen diferencias biológicas importantes entre las células de adulto y neonatales, pero la duración más larga disponible para el cultivo de células neonatales los hace apropiados para diferentes tipos de estudios, los de la función mitocondrial incluidos.

Hasta la fecha, cardiomiocitos neonatales cultivados primarias de la rata y ratón se han utilizado como modelos para estudiar bioenergética cardíaca^12,13. En los últimos años, estudios utilizan un analizador de flujo extracelular para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y evaluar la capacidad oxidativa en ratón y rata cardiomiocitos neonatales^14,15. Mientras que en comparación con las ratas, la viabilidad celular de cardiomiocitos neonatales de ratón es menor y tiene una mayor variabilidad¹⁶. Además, la capacidad para el estudio de células a partir de modelos de ratón modificados genéticamente hace muy importante el modelo de célula de ratón. Dado que estudios de OCR son tan sensibles a la célula número y densidad de siembra, es necesario el desarrollo de un protocolo simple, reproducible y confiable para lograr la viabilidad y rendimiento constante de la célula.

Aquí, Divulgamos un protocolo optimizado que se ha desarrollado que utiliza ratón cultivados cardiomiocitos neonatales junto con un analizador de flujo extracelular 96-bien-formato para el análisis de OCR. Este protocolo aumenta la reproducibilidad del ensayo. Además, el Protocolo no sólo proporciona un método reproducible para el análisis de OCR y novela, sino que también podría adaptarse a una cultura más grande de tamaño para propósitos experimentales, como la que puede ser necesario estudiar las funciones miofibrilar e intracelular vías de señalización.

En particular, este protocolo describe un procedimiento de un día para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón en una placa de cultivo celular de 96 pozos. Además, describe el procedimiento para medir el consumo de oxígeno usando un analizador de flujo extracelular. Todas las soluciones utilizadas son estériles o filtrado estéril. Todas las herramientas son esterilizadas por el etanol del 75%. Le ofrecemos una Tabla de materiales para diferentes partes del procedimiento. Para el cultivo de cardiomiocitos, todos los procedimientos y pasos se llevan a cabo en una campana de la cultura de célula estándar. Este protocolo está desarrollado para el aislamiento de corazones de ratón neonatal de una camada (aproximadamente 8-10 crías). Sin embargo, el protocolo también puede adaptarse para aislar cardiomiocitos de camadas múltiples.

Protocolo

Para el trabajo con ratones neonatales, se refieren al conjunto de pautas locales Instituto adelante por los programas de cuidado de los animales y se adhieren a la institucional y otras regulaciones apropiadas. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por la UC San Diego Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) y adhieran a regulaciones federales y estatales.

1. preparación de reactivos

1. Preparar 25 mL de solución de digestión previa: HBSS (sin Ca^{2 +} y Mg^{2 +}) complementada con tripsina (0.5 mg/mL). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión previa en el día del experimento.
   Nota: Es fundamental utilizar HBSS sin Ca^{2 +} y Mg^{2 +}, Ca^{2 +} y Mg^{2 +} hará que la contracción del miocito y la muerte subsecuente de la célula durante el aislamiento.
2. Preparar 30 mL de tampón de digestión colagenasa: colagenasa (0,8 mg/mL, aproximadamente 350 U/mL) disuelto en tampón HBSS (sin Ca^{2 +} y Mg^{2 +}). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión de colagenasa en el día del experimento.
3. Preparar 500 mL de medio de cultivo de cardiomiocitos (medios de cultivo): se mezclan 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de suero de caballo y 12,5 mL de SBF. Suplemento con penicilina de 1% y 1% solución de estreptomicina.
4. Preparación de medio de prueba de estrés mitocondrial: hacer 200 mL de DMEM basado en prueba de esfuerzo suplementado (DMEM sin NaHCO₃, véase Tabla de materiales) con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina y glucosa 10 mM y 2 mM Hepes.
   Nota: Hacer 1 L de medio con DMEM sin piruvato de sodio, L-glutamina, glucosa y Hepes, filtro estéril y almacenar a 4 ° C. Preparar el medio de prueba de esfuerzo en el día del ensayo mediante la adición de otros reactivos. Con DMEM medio sin NaHCO₃ es fundamental.
5. Ajustar el pH de los medios de prueba de estrés mitocondrial a 7.4 en el día de uso. Medios de comunicación tibia a 37 ° C antes de usar.
6. Preparar oligomycin: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
7. Preparar FCCP: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
8. Preparar la antimicina A: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
9. Preparar la rotenona: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
   Nota: Todos los reactivos y soluciones utilizadas en el presente Protocolo se enumeran en la tabla 1.

2. recolección y pre digestión de corazones de ratones neonatales (día 1)

1. Autoclave tijeras, pinzas y una cuchara de Moria para esterilizar.
2. Realizar todos los pasos en la campana de la cultura de célula para la esterilidad.
3. 5 mL alícuota de HBSS (sin Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) en cada pocillo de una placa de cultivo celular 6-bien; Coloque en hielo. Alícuota 10 mL de HBSS en una placa de cultivo celular de 10 cm.
4. Prepare 20 mL de solución de la digestión de tripsina en un tubo cónico estéril de 50 mL. Mantenga todas las soluciones en el hielo.
5. Rápidamente sumergir ratones recién nacidos (día 0) en la solución de etanol 70% para la esterilización.
6. Decapitar a PUP utilizando tijeras estériles (recto) sin anestesia y luego abre el cofre a lo largo del esternón para permitir el acceso a la cavidad torácica y el corazón. (Figura 1A)
   Nota: 1) es importante utilizar ratones neonatales P0 para lograr viabilidad celular alta. 2) este método de eutanasia está permitida para los recién nacidos con arreglo a las pautas de NIH y la Asociación Médica Veterinaria americana ¹⁷.
7. Extraer corazones del cuerpo con tijeras finas y transferencia inmediatamente en el plato de cultura de célula estéril con HBSS (sin Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) (figura 1B).
8. Eliminar cualquier tejido pulmonar residual, los buques más grandes, etc. (y atria, si lo desea). Lavar el corazón en la solución HBSS con agitación suave.
9. Cortar cada corazón con unas tijeras finas en 8 pedazos y transferir todo el tejido de corazón con unas pinzas en un pozo de una placa de cultivo celular 6-bien con HBSS (figura 1C y 1D).
10. Lavar los corazones mediante la transferencia de los corazones de bien a bien en la placa de 6 pozos con HBSS, con una cuchara de Moria (figura 1).
    Nota: Transferencia de los corazones de bien a bien es suficiente para lavar la sangre. Puesto que la sangre interfiere con la digestión enzimática es importante lavar los corazones con HBSS y sacar sangre.
11. Transferir el corazón con una cuchara de Moria en un tubo cónico que contiene 20 mL de tripsina (0.5 mg/mL) e incubar con agitación suave a 4° C por 4 h (Figura 1E).

3. prepare una placa de cultivo de 96 pocillos (día 1)

1. Preparar 5 mL de solución de recubrimiento: PBS con 0,5% gelatina (autoclave antes de su uso) y fibronectina solución al 1%. (por ejemplo, 5 mL de solución de gelatina y 50 μl de solución de fibronectina)
2. Alícuota de 50 μl de solución de recubrimiento en cada pocillo de la placa de cultivo celular de 96 pozos (véase Tabla de materiales). Si las burbujas están presentes, eliminarlos utilizando una pipeta de 20 μl para aspirar las burbujas hacia fuera.
   Nota: Es importante cubrir toda la superficie de cada pocillo con la solución de recubrimiento.
3. Incube la placa en una incubadora de cultura de célula de 37 ° C durante 1 h o más para permitir el secado de la capa de matriz.
4. Aspirar cualquier solución de capa residual antes de sembrar de cardiomiocitos.

4. enzimática digestión y galjanoplastia de células (día 1)

1. Caliente previamente la solución de digestión de colagenasa en un baño de agua de 37 ° C.
   Nota: Este paso es importante para lograr la digestión enzimática eficiente.
2. Mover el tubo cónico que contiene corazones y solución de digestión antes de 4 ° C a una campana de cultivo celular. (Figura 1F)
3. Deja que el corazón se hunde hasta el fondo del tubo y retirar la solución de la digestión mediante el uso de una pipeta serológica de 10 mL (1 a 2 mL del medio de aislamiento puede permanecer en el tubo).
4. Añadir 10 mL de HBSS en el tubo. Vuelva a suspender los corazones con HBSS 2 - 3 veces a lavar con una pipeta serológica de 10 mL de tripsina. Aspirar HBSS (1 a 2 mL puede permanecer en el tubo).
5. Añadir 10 mL de solución de digestión con colagenasa en el tubo con el corazón. (Figura 1)
6. Incubar el tubo con el corazón en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos sin agitación (1 º digestión).
7. Después de la 1 º digestión, mueva el tubo a la campana de la cultura de célula. Suavemente triturate corazones por volver a suspender los corazones dentro del tubo suavemente 10 veces usando una pipeta serológica de 10 mL. Esto permitirá que corazones para dispersar y células liberadas del tejido cardíaco. (Figura 1 H)
   Nota: Cardiomiocitos son frágiles, trituración suave es importante para lograr alta viabilidad.
8. Que el tejido no digerido fregadero, transferencia digerido solución enriquecida en cardiomiocitos (aproximadamente 9-10 mL) a un tubo cónico nuevo y añadir la misma cantidad de medios de cultivo celular para detener la digestión de la colagenasa.
9. Añadir 10 mL de solución de digestión de colagenasa en el tubo que contiene el tejido restante del corazón sin digerir.
10. Incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua de 37 ° C durante 10 min (2 º digestión).
11. Repita el procedimiento 4.7 y 4.8.
    Nota: Si hay tejido todavía mucho no digerida, repita una vez más la digestión. Sin embargo, en la mayoría de los casos, dos digestiones son suficientes para dispersar la mayoría de las células de los tejidos del corazón.
12. Coloque un filtro de células estéril (malla de nylon de 100 μm) en un tubo cónico estéril 50 mL nuevo. Humedezca previamente el filtro de la célula con 2-3 mL de medio de cultivo celular y pasar las células a través de la coladera de la célula. Enjuague el colador celular con 2-3 mL de medio de cultivo celular. (Figura 1I)
13. Centrifugar el tubo cónico que contiene cardiomiocitos durante 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspirar el sobrenadante (figura 1 K), que contienen restos de tejidos celulares y Resuspenda el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo celular (figura 1 L).
14. Resuspender las células y las células de la placa sobre una placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún tipo de recubrimiento de plástico) e Incube por 1 h en una incubadora de cultivo celular (pre-placas 1) (figura 1 M). Este paso de la pre-galjanoplastia permite no cardiomiocitos, como fibroblastos y células endoteliales, a adherirse a la placa de cultivo de células sin recubrimiento.
    Nota: En este punto, cardiomiocitos son típicamente una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. (Figura 1N).
15. Después de la incubación de 1 h, suavemente agite la placa, lave las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm y Resuspenda las células mediante pipeteo repetidamente el medio de cultivo celular sobre el plato con una pipeta serológica de 10 mL. Luego, transferir las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) en una nueva placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún recubrimiento de plástico) e incubar durante una 1 h adicional en una incubadora de cultivo celular (placas previos 2 º).
    Nota: Las células que se adhieren a la placa sin revestimiento son dominantemente no cardiomiocitos: fibroblastos y células endoteliales, que pueden visualizarse bajo el microscopio (figura 1O).
16. Después de 2 º pre-galjanoplastia, suavemente agitar la placa, lave las células no adherentes (cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm, luego transferir los cardiomiocitos en un nuevo tubo cónico de 50 mL.

5. recuento de células y células de revestimiento en una placa de cultivo celular de 96 pozos (día 1)

1. Contar las células usando un hemocitómetro.
2. Las células de la placa en una placa de cultivo celular de 96 pozos matriz extracelular revestido con una densidad entre 10 – 30 x 10³ células/pocillo utilizando una pipeta multicanal en un volumen final de 200 μl (figura 1 P). Utiliza pozos A1, A12, H1 y H12 para fondo: Añadir 200 μL de medio de cultivo como otros pozos en estos pozos (sin células). Incube la placa en una incubadora de 37 ° C de la célula cultura.
   Nota: En este estudio, el consumo de oxígeno fue probado mediante el uso de densidades de diferentes células como 10 x 10³, 20 x 10³30 x 10³ células/pocillo. (Figura 2A). También, como arriba, cardiomiocitos inmediatamente después del aislamiento suelen ser una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. Células viables se aplanen en 16-24 h de cultivo.

6. oxígeno consumo ensayo utilizando un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos (día 2)

Nota: Ensayo de consumo de oxígeno puede llevar a cabo un día después de las células de la galjanoplastia o posterior. Cardiomiocitos neonatales cultivados utilizando este protocolo puede sobrevivir hasta 7 días post aislamiento.

1. Un cartucho de sensor de flujo analizador del hidrato (véase Tabla de materiales) durante al menos 3 horas, pero ideal para un día completo, antes de la prueba. Añadir 200 μL de solución Calibrant (véase Tabla de materiales) en cada pocillo de la placa de la utilidad, el cartucho de sensor vuelva a colocar la placa de la utilidad e incubar en una incubadora de 37 ° C sin CO₂ o O₂ suplementación.
2. Cambiar los medios de cultivo celular al medio de prueba de estrés de las mitocondrias una hora antes del ensayo. Cardiomiocitos son frágiles. Por lo tanto, suavemente quitar los medios de cultivo celular mediante una pipeta multicanal y lavan las células con 200 μL de los medios de prueba de estrés mitocondrial precalentado dos veces. Después del segundo lavado, añadir 175 μl de los medios de prueba de estrés con las mitocondrias y las células en una incubadora de 37 ° C sin CO₂ o O₂ suplementos de la cultura.
3. Preparar compuestos de prueba concentrado. Para prueba de esfuerzo de las mitocondrias, preparar 3,0 mL de 16 oligomycin μm, μm 9 FCCP y una mezcla de 20 rotenona μm y 20 μm antimicina A, todo en medio de la prueba de estrés mitocondrial.
   Nota: Cada compuesto en la concentración que se describe ha sido probado. Sin embargo, es necesario valorar la concentración de cada compuesto en laboratorio propio.
4. Carga 25 μl de cada compuesto en los orificios del inyector del cartucho sensor utilizando una pipeta multicanal (figura 1Q). El volumen y la concentración final se describen en la tabla 2.
5. Configurar el protocolo de ensayo de flujo extracelular. El programa se describe en tabla 3.
6. Inicie el programa. En primer lugar, ponga el cartucho de sensor en la máquina de calibración (figura 1R). Reemplazar el calibrant para la placa de ensayo una vez hecho el paso de calibración.
   Nota: Utilizando el software proporcionado por el fabricante, indican grupos de pozos y cada uno de ellos y el puerto.
7. Si lo desea, después del ensayo, deseche cuidadosamente todo medio de ensayo usando una pipeta multicanal y almacenar la microplaca de la cultura de célula a-20 ° C para la normalización de la futura célula usando análisis de proteína.
8. Medir el contenido de proteína. Añadir 50 μl de solución de lisis de la célula RIPA estándar (véase Tabla de materiales). Incubar la placa de hielo durante 30 minutos completamente Lyse las células. Transferir todo el material para una nueva placa de ensayo bien fondo claro plano 96.
9. Medir la concentración de proteína por ensayo BCA según protocolo del fabricante.
   Nota: Recubrimiento del pozo con matriz extracelular resulta en una concentración de proteínas en cada pozo. Por lo tanto, restar la cantidad de pozos fondo (sin células) para obtener la concentración de la proteína de la célula real. La concentración de proteína derivada de células es baja en una placa de cultivo de 96 pozos. Además, la concentración de proteína puede variar de pozo a pozo debido a la capa de matriz extracelular. Por lo tanto, se sugiere usar numero de celular para normalizar el OCR.

Resultados

Mediante el protocolo descrito, corazones fueron aislados de los cachorros neonatales día 0. se obtuvieron 5 x 10⁵ células/pup y cardiomiocitos fueron sembrados a densidades de 10 x 10³, 20 x 10³o 30 x 10³ células/pocillo, en placas bien 96 (figura 2A). Después de la cultura durante la noche, se encontraron cardiomiocitos bien adheridos a la superficie recubierta de plástico y había muy pocas células sueltas ...

Discusión

En este estudio, hemos establecido un protocolo simple para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mediante el uso de estos cardiomiocitos, hemos optimizado también las condiciones para medir la tasa de consumo de oxígeno mediante un sistema de analizador de flujo extracelular. El protocolo permite utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como un modelo de sistema para examinar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en las células principales del trabajo del corazó...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	SIGMA	A8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores	FALCON	352360	To capture undigested tissue
Collagenase type II	Worthington	LS004176	To make collagenase digestion solution
D-Glucose	SIGMA	75351	To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose	Life technologies	11965-092	To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	SIGMA	C2920	Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies	26140-079	To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma	SIGMA	F1141-5MG	To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors	Fine Sciences Tools	14060-10	For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin	SIGMA	G-1890	To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum	Life technologies	26050-088	To make cell culture medium
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	To make mitochodnrial stress test medium
M-199	Cellgro	10-060-CV	To make cell culture medium
Moria spoon	Fisher scientific	NC9190356	To wash hearts
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer	Fisher scientific	89900	To lyse the cells for protein assay
Rotenone	SIGMA	R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent		Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors	Fine Sciences Tools	91401-12	For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size			For sterile filtration of digestion medium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	To make pre-digestion solution