Analizzando il tasso di consumo di ossigeno nei Cardiomyocytes neonatali coltivati primari del topo utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di illustrare come utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nel cuore.

Abstract

Mitocondri e metabolismo ossidativo sono fondamentali per mantenere la funzione del muscolo cardiaco. La ricerca ha dimostrato che la disfunzione mitocondriale è un fattore importante che contribuisce alla funzione cardiaca alterata trovato nello scompenso cardiaco. Al contrario, ristabilimento della funzione mitocondriale difettosa può avere effetti benefici per migliorare la funzione cardiaca nel cuore di venire a mancare. Pertanto, lo studio dei meccanismi di regolamentazione e identificando nuovi regolatori per la funzione mitocondriale potrebbe fornire insight che potrebbero essere usate per sviluppare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie cardiache. Qui, la respirazione mitocondriale cardiaca del miocita è analizzata utilizzando un sistema di coltura cellulare unico. In primo luogo, un protocollo è stato ottimizzato per isolare rapidamente e cardiomiociti neonatali del mouse ad alta redditività della coltura. Quindi, un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti viene utilizzato per valutare il tasso di consumo di ossigeno di questi cardiomiociti. Per questo protocollo, abbiamo ottimizzato le condizioni di semina ed abbiamo dimostrato che tasso di consumo ossigeno cardiomiociti neonatali del mouse può essere facilmente valutata in un analizzatore di flusso extracellulare. Infine, notiamo che il nostro protocollo può essere applicato a una dimensione maggiore di cultura e altri studi, come ad esempio la segnalazione intracellulare e contrattile funzionano analisi.

Introduzione

Per sostenere una continua funzione contrattile cardiaca, cardiomiociti devono mantenere una fornitura costante di energia cellulare principalmente sotto forma di ATP¹. Nel cuore, circa il 95% del trifosfato di adenosina è generato dai mitocondri, principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa, mostrando che i mitocondri svolgono un ruolo cruciale di bioenergetico nella funzione cardiaca^2,3. Sostenere questa nozione è che disregolazione della funzione mitocondriale può condurre a cardiomiopatia e insufficienza cardiaca^4,5. Al contrario, ripristinare la funzione mitocondriale è stato indicato per migliorare la funzione cardiaca di failover cuore^6,7. Pertanto, studiando il meccanismo della bioenergetica mitocondriale e identificando nuovi regolatori della funzione mitocondriale in cardiomiociti non rivelerà solo intuizioni meccanicistiche della produzione di energia cardiaca ma anche potrebbe fornire la comprensione che porterà allo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie di cuore^6,8.

Rispetto a tutto il cuore, che contiene una miscela di miociti e non miociti⁹, culture dei cardiomiociti sono estremamente puro, con contaminazione minima del non-miociti dal cuore, come fibroblasti e cellule endoteliali¹⁰. Inoltre, isolando cardiomiociti da cuccioli neonatali consente la coltura di un gran numero di cellule in una piccola quantità di tempo, rispetto alle celle d'isolamento dal cuore adulto^10,11. La cosa più importante, cardiomiociti coltivati primari del topo adulto hanno breve sopravvivenza volte (es. 24 ore) e a più lungo tempo punti de-differenziano. Cardiomiociti neonatali del mouse possono sopravvivere ed essere manipolati per più di 7 giorni nella cultura, che li rende ideali per testare gli effetti della droga composti e manipolazione del gene sulla funzione dei mitocondri in cardiomiociti¹⁰. Naturalmente, ci sono significative differenze biologiche tra le cellule adulte e neonatali, ma la durata più lunga disponibile per la coltura di cellule neonatali li rende adatti a diversi tipi di studi, compresi quelli della funzione mitocondriale.

Ad oggi, cardiomyocytes neonatali coltivati primario di topo e di ratto sono stati utilizzati come modelli per lo studio cardiaco bioenergetica^12,13. Negli ultimi anni, studi utilizzato un analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e valutare la capacità ossidativa nel topo e nel ratto cardiomiociti neonatali^14,15. Mentre rispetto ai ratti, l'attuabilità delle cellule di cardiomiociti neonatali del mouse è più basso e ha una maggiore variabilità¹⁶. Inoltre, la possibilità di studiare le cellule da modelli murini geneticamente rende il modello di cella del mouse molto importante. Dato che gli studi OCR sono così sensibili alla cella numero e densità di semina, è necessario lo sviluppo di un protocollo riproducibile, affidabile e semplice per raggiungere la redditività e il rendimento delle celle coerente.

Qui, segnaliamo un protocollo ottimizzato che è stato sviluppato che utilizza cardiomyocytes neonatali coltivati del topo con un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti per analisi OCR. Questo protocollo aumenta notevolmente la riproducibilità del test. Inoltre, il protocollo non solo fornisce un romanzo e un metodo riproducibile per analisi OCR, ma anche può essere adattato ad una cultura di dimensioni più grande per altri scopi sperimentali, come quello che potrebbe essere necessario per studiare funzioni miofibrillare e intracellulare vie di segnalazione.

In particolare, il presente protocollo descrive una procedura di un giorno di isolamento e coltura dei cardiomiociti neonatali del mouse in una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti. Inoltre, descrive la procedura per misurare il consumo di ossigeno utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tutte le soluzioni utilizzate sono sterili o filtrato sterile. Tutti gli strumenti sono sterilizzati con etanolo al 75%. Forniamo una Tabella materiali per le varie parti della procedura. Per la coltura di cardiomiociti, tutte le procedure e i passaggi vengono eseguiti in una cappa di cultura cellulare standard. Questo protocollo è sviluppato per l'isolamento dei cuori neonatali del mouse da una cucciolata (circa 8-10 cuccioli). Tuttavia, il protocollo può anche essere adattato per isolare i cardiomiociti da cucciolate più.

Protocollo

Per il lavoro con topi neonatali, fare riferimento al set di linee guida locale Università/Istituto indietro dai programmi di cura degli animali e aderire a di uno istituzionali e altri regolamenti appropriati. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal UC San Diego istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) e rispettano i regolamenti federali e statali.

1. preparazione dei reagenti

1. Preparare 25 mL della soluzione di pre-digestione: HBSS (senza Ca^{2 +} e Mg^{2 +}) completati con tripsina (0,5 mg/mL). Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo. Fare pre-digestione soluzione il giorno dell'esperimento.
   Nota: È fondamentale utilizzare HBSS senza Ca^{2 +} e Mg^{2 +}, come Ca^{2 +} e Mg^{2 +} provocherà la contrazione del miocita e morte successiva delle cellule durante l'isolamento.
2. Preparare 30 mL di buffer di digestione della collagenosi: collagenasi (0,8 mg/mL, circa 350 U/mL) disciolto nel buffer di HBSS (senza Ca^{2 +} e Mg^{2 +}). Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo. Il giorno dell'esperimento effettuare soluzione digestione della collagenosi.
3. Preparare 500 mL di cardiomyocyte terreni di coltura (coltura): mescolare 375 mL di DMEM, 125 mL di M-199, 25 mL di siero equino e 12,5 mL di FBS. Supplemento con penicillina 1% e 1% soluzione di streptomicina.
4. Preparare il supporto mitocondriale stress test: fare 200 mL di DMEM basato stress test medium (DMEM senza NaHCO₃, Vedi Tabella materiali) completate con piruvato di sodio di 1 mM, 2 mM L-Glutammina e glucosio di 10 mM e 2 mM Hepes.
   Nota: Fare 1 L del mezzo con DMEM senza sodio piruvato, L-Glutammina, glucosio e Hepes, filer sterile e conservare a 4 ° C. Preparare il supporto di test di stress il giorno del test con l'aggiunta di altri reagenti. Utilizzando DMEM medio senza NaHCO₃ è importante.
5. Regolare il pH dei mitocondriale stress test media 7.4 il giorno di utilizzo. Media calda a 37 ° C prima dell'uso.
6. Preparare oligomycin: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
7. Preparare FCCP: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
8. Preparare antimycin A: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
9. Preparare il rotenone: preparare 5 mL di una soluzione di riserva di 5 mM in DMSO, rendere aliquote di 250 µ l e conservare a-20 ° C.
   Nota: Tutti i reagenti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo sono elencati nella tabella 1.

2. raccolta e pre-digestione dei cuori dai topi neonatali (giorno 1)

1. Autoclave forbici, pinze e un cucchiaio di Moria per sterilizzare.
2. Eseguire tutti i passaggi della cappa di cultura delle cellule per la sterilità.
3. Aliquotare 5ml di HBSS (senza Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura delle cellule 6 pozzetti; mettere sul ghiaccio. Aliquotare 10 mL di HBSS in una piastra di coltura delle cellule di 10 cm.
4. Preparare 20 mL della soluzione di pre-digestione della tripsina in una provetta conica sterile 50 mL. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio.
5. Immergere rapidamente topi neonati (giorno 0) in soluzione di etanolo 70% per la sterilizzazione.
6. Decapitare cuccioli utilizzando forbici sterili (dritto) senza anestesia e quindi aprire il torace lungo lo sterno per consentire l'accesso alla cavità toracica e il cuore. (Figura 1A)
   Nota: 1) è fondamentale utilizzare topi neonatali P0 per ottenere alta attuabilità. 2) questo metodo di eutanasia è consentito per i neonati in conformità con le linee guida NIH e associazione medica veterinaria americana ¹⁷.
7. Estrarre i cuori dal corpo con una forbice e trasferire immediatamente nella piastra di coltura sterile cella contenente HBSS (senza Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) (Figura 1B).
8. Rimuovere qualsiasi tessuto polmonare residuo, navi più grandi, ecc (e atri, se lo si desidera). Lavare i cuori nella soluzione di HBSS utilizzando agitazione delicata.
9. Tagliare ogni cuore con una forbice in 8 pezzi e trasferire il tessuto cardiaco tutti con forcipe in un pozzetto di una piastra di coltura delle cellule 6-pozzetti con HBSS (Figura 1 e 1 D).
10. Lavare i cuori trasferendo i cuori da un pozzetto a altro nella piastra 6-Pozzo riempita con HBSS, utilizzando un cucchiaio di Moria (Figura 1).
    Nota: Trasferire i cuori da un pozzetto a altro è sufficiente lavare il sangue. Poiché il sangue interferisce con la digestione enzimatica è importante lavare i cuori con HBSS e rimuovere il sangue.
11. Trasferire i cuori con un cucchiaio di Moria in un tubo conico contenente 20 mL di tripsina (0,5 mg/mL) e incubare con agitazione delicata a 4° C per 4 h (Figura 1E).

3. preparare una piastra a 96 pozzetti cultura (giorno 1)

1. Preparare 5 mL di soluzione di rivestimento: PBS contenente 0.5% di gelatina (in autoclave prima dell'uso) e 1% soluzione di fibronectina. (ad es. 5 mL di soluzione di gelatina più 50 µ l di soluzione di fibronectina)
2. Aliquotare 50 µ l di soluzione di rivestimento in tutti i pozzetti della piastra 96 pozzetti cella cultura (Vedi Tabella materiali). Se le bolle sono presenti, è possibile rimuoverli utilizzando una pipetta di 20 µ l a succhiare le bolle fuori.
   Nota: È importante coprire tutta l'area della superficie di ciascun pozzetto con soluzione di rivestimento.
3. Incubare la piastra in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per 1 ora o più per consentire l'asciugatura del rivestimento matrice.
4. Aspirare qualsiasi soluzione di rivestimento residuo prima della semina cardiomyocytes.

4. enzimatica digestione e placcatura delle cellule (giorno 1)

1. Pre-riscaldare la soluzione di digestione della collagenosi in bagnomaria a 37 ° C.
   Nota: Questo passaggio è importante raggiungere efficiente digestione enzimatica.
2. Spostare il tubo conico che contengono cuori e la soluzione di pre-digestione da 4 ° C per un cappuccio di cultura cellulare. (Figura 1F)
3. Lasciate che i cuori sul fondo del tubo e rimuovere la soluzione di pre-digestione utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL (1-2 mL di terreno isolamento può rimanere nel tubo).
4. Aggiungere 10 mL di HBSS nel tubo. Risospendere i cuori con HBSS 2 - 3 volte per lavare fuori utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL di tripsina. Aspirare HBSS (1-2 mL può rimanere nel tubo).
5. Aggiungere 10 mL di soluzione di digestione della collagenosi pre-riscaldato nel tubo con i cuori. (Figura 1)
6. Incubare la provetta con cuori in bagnomaria a 37 ° C per 10 minuti senza agitazione (1 ° digestione).
7. Dopo la 1 ° digestione, spostare il tubo alla cappa di cultura cellulare. Triturare delicatamente cuori sospendendo nuovamente i cuori all'interno del tubo delicatamente 10 volte utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL. Ciò consentirà di cuori per disperdere e cellule di essere liberato dal tessuto del cuore. (Figura 1 H)
   Nota: Poiché i cardiomiociti sono fragili, triturazione delicato è importante raggiungere alta attuabilità.
8. Lavello, trasferire digerito soluzione arricchita in cardiomiociti (circa 9-10 mL) ad un nuovo tubo conico e immediatamente aggiungere una pari quantità di terreni di coltura cellulare per interrompere la digestione della collagenosi, lasciare che il tessuto non digerito.
9. Aggiungere 10 mL di soluzione di digestione della collagenosi nella provetta contenente il tessuto restante del cuore non digerito.
10. Incubare la provetta con il tessuto del cuore in bagnomaria a 37 ° C per 10 min (2 ° digestione).
11. Ripetere la procedura 4.7 e 4.8.
    Nota: Se c'è ancora molto non digerito tessuto, ripetere ancora una volta di digestione. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, due digestioni sono sufficienti per disperdere la maggior parte delle cellule dal tessuto del cuore.
12. Inserire un cella sterile-setaccio (maglia di nylon di 100 µm) in una nuova provetta conica sterile 50 mL. Pre-bagnato il filtro cella con 2-3 mL di terreno di coltura cellulare e passare le cellule attraverso la cella-colino. Sciacquare la cella-colino con 2-3 mL di terreno di coltura delle cellule. (Figura 1I)
13. Centrifugare la provetta contenente cardiomyocytes per 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspirare il supernatante (Figura 1 K), che conterrà i detriti del tessuto cellulare e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura delle cellule (Figura 1 L).
14. Risospendere le cellule e le cellule di piastra su una piastra di coltura di cellule di 10cm (plastica senza alcun tipo di rivestimento) delicatamente e incubare per 1 h in un'incubatrice di coltura cellulare (1 ° pre-placcatura) (Figura 1 M). Questa fase di pre-placcatura permette non-cardiomiociti, come fibroblasti e cellule endoteliali, di aderire al piatto non patinata di coltura cellulare.
    Nota: A questo punto, cardiomiociti sono tipicamente una forma rotonda e appaiono lucidi sotto il microscopio. (Figura 1N).
15. Dopo l'incubazione di 1h, delicatamente agitare la piastra, lavare le cellule non-aderenti (arricchite in cardiomiociti) dalla piastra di coltura di 10cm e risospendere le cellule pipettando ripetutamente il terreno di coltura cellulare sopra il piatto utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL. Quindi, trasferire cellule non aderenti (arricchite in cardiomiociti) in un piatto di coltura delle cellule (plastica senza alcun rivestimento) 10cm nuovo e incubare per un ulteriore 1 h in un'incubatrice di coltura cellulare (2 ° pre-placcatura).
    Nota: Le cellule che si attaccano alla piastra non rivestiti sono dominante non cardiomiociti: fibroblasti e cellule endoteliali, che possono essere visualizzate al microscopio (Figura 1O).
16. Dopo 2 ° pre-placcatura, delicatamente di agitare la piastra, lavare le cellule non-aderenti (cardiomiociti) dalla piastra di coltura di 10cm, quindi trasferire i cardiomiociti in una nuova provetta conica 50 mL.

5. conteggio celle e celle di placcatura in una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti (giorno 1)

1. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
2. Piastra le cellule in una piastra di coltura 96 pozzetti cella matrice extracellulare rivestita con una densità tra 10 – 30 x 10³ cellule/pozzetto usando una pipetta multicanale in un volume finale di 200 µ l (Figura 1 P). Utilizzare pozzetti A1, A12, H1 e H12 per sfondo: aggiungere 200 µ l di terreno di coltura come altri pozzi in questi pozzetti (senza cellule). Incubare la piastra in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C.
   Nota: In questo studio, il consumo di ossigeno è stato testato utilizzando la densità delle cellule differenti quali³10 x 10, 20 x 10³o 30 x 10³ cellule per pozzetto. (Figura 2A). Inoltre, come sopra, cardiomiociti subito dopo l'isolamento sono tipicamente una forma rotonda e appaiono lucidi sotto il microscopio. Cellule vitali si appiattiscono entro 16-24 h di cultura.

6. ossigeno consumo analisi usando un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti (giorno 2)

Nota: Analisi del consumo di ossigeno può essere effettuata un giorno dopo il placcaggio delle cellule o versione successiva. Cardiomiociti neonatali coltivati utilizzando questo protocollo può sopravvivere fino a 7 giorni post isolamento.

1. Idratare una cartuccia sensore di flusso analizzatore (Vedi Tabella materiali) per almeno 3 ore, ma idealmente per un giorno intero, prima del dosaggio. Aggiungere 200 µ l di soluzione di calibratore (Vedi Tabella materiali) nella ciascun pozzetto della piastra utilità, rimettere la cartuccia sensore sulla piastra di utilità e incubare in un incubatore a 37 ° C senza CO₂ o il completamento di₂ O.
2. Cambiare i terreni di coltura delle cellule per mezzo di prova di stress di mitocondri un'ora prima del dosaggio. Cardiomiociti sono fragili. Di conseguenza, delicatamente rimuovere i terreni di coltura cellulare utilizzando una pipetta multicanale e lavare le cellule con 200 µ l di supporti pre-riscaldato mitocondriale stress test due volte. Dopo il secondo lavaggio, 175 µ l di mezzi di prova di stress pre-riscaldato i mitocondri e le cellule in un incubatore a 37 ° C senza CO₂ o il completamento di₂ O di cultura.
3. Preparare composti concentrati prova. Per test di stress di mitocondri, preparare 3,0 mL ciascuna di 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP e una miscela di 20 µM rotenone e 20 µM antimycin A, tutti in mezzo mitocondriale stress test.
   Nota: Ogni mescola alla concentrazione descritta è stato testato. Tuttavia, la concentrazione di ciascun composto nel proprio laboratorio di titolazione è necessario.
4. Caricare 25 µ l di ciascun composto nelle porte iniettore della cartuccia sensore usando una pipetta multicanale (Figura 1Q). Il volume e la concentrazione finale sono descritte nella tabella 2.
5. Impostare il protocollo di analisi di flusso extracellulare. Il programma è descritto in tabella 3.
6. Avviare il programma. In primo luogo, mettere la cartuccia sensore nella macchina per la taratura (Figura 1R). Sostituire il calibratore per la piastra di dosaggio una volta fatto il passo di calibrazione.
   Nota: Utilizzando il software fornito dal produttore, indicare gruppi di pozzi e ogni composto e porto.
7. Se lo si desidera, dopo il dosaggio, attentamente scartare tutti i medium di analisi mediante una pipetta multicanale e memorizzare la micropiastra cultura cella a-20 ° C per la normalizzazione dei futuri cella usando analisi di proteine.
8. Misurare il contenuto di proteine. Aggiungere 50 µ l di soluzione di lisi cellulare RIPA standard (Vedi Tabella materiali). Incubare la piastra sul ghiaccio per 30 min a completamente lisare cellule. Trasferire tutto il materiale per una nuova piastra di fondo chiaro piatto 96 ben saggio.
9. Misurare la concentrazione di proteina dall'analisi di BCA secondo il protocollo del produttore.
   Nota: Rivestimento del pozzo con la matrice extracellulare si traduce in una concentrazione ad alta percentuale proteica in ciascun pozzetto. Quindi sottrarre la quantità di compresi i pozzetti di sfondo (nessuna cella) per ottenere la concentrazione nella proteina di cella effettivo. La concentrazione di proteine derivata da cellule è bassa in una piastra a 96 pozzetti cultura. Inoltre, la concentrazione nella proteina può variare da pozzetto a altro grazie al rivestimento di matrice extracellulare. Di conseguenza, utilizzando il numero di cellulare per normalizzare l'OCR è suggerito.

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto, i cuori sono stati isolati da cuccioli neonatale giorno 0. 5 x 10⁵ cellule/pup sono stati ottenuti, e cardiomiociti sono stati seminati a densità di 10 x 10³, 20 x 10³o 30 x 10³ cellule/pozzetto, a 96 pozzetti (Figura 2A). Dopo una notte cultura, cardiomiociti sono stati trovati ben attaccati alla superficie rivestita in plastica e c'erano pochissime cellule non collegate (le ce...

Discussione

In questo studio, abbiamo stabilito un protocollo semplice per isolamento e la coltura del mouse cardiomiociti neonatali. Utilizzando questi cardiomiociti, abbiamo ottimizzato anche le condizioni per misurare il tasso di consumo di ossigeno utilizzando un sistema di analisi di flusso extracellulare. Il protocollo permette di utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nelle cellule del lavoro principale del cuore, simile a que...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	SIGMA	A8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores	FALCON	352360	To capture undigested tissue
Collagenase type II	Worthington	LS004176	To make collagenase digestion solution
D-Glucose	SIGMA	75351	To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose	Life technologies	11965-092	To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	SIGMA	C2920	Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies	26140-079	To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma	SIGMA	F1141-5MG	To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors	Fine Sciences Tools	14060-10	For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin	SIGMA	G-1890	To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum	Life technologies	26050-088	To make cell culture medium
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	To make mitochodnrial stress test medium
M-199	Cellgro	10-060-CV	To make cell culture medium
Moria spoon	Fisher scientific	NC9190356	To wash hearts
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer	Fisher scientific	89900	To lyse the cells for protein assay
Rotenone	SIGMA	R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent		Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors	Fine Sciences Tools	91401-12	For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size			For sterile filtration of digestion medium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	To make pre-digestion solution