細胞外フラックス アナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析

要約

このプロトコルの目的は、心臓の酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル システムとしてマウス新生児心筋細胞を使用する方法を説明するためにです。

要約

ミトコンドリアおよび酸化的代謝心臓筋肉の機能を維持するために重要です。研究は、心不全、心臓機能障害の重要な要因のミトコンドリアの機能低下を示しています。対照的に、不良ミトコンドリア機能を復元すると、失敗した心における心機能の改善に有益な効果があります。したがって、調節のメカニズムを勉強して、ミトコンドリア機能の新しい調節の識別は、心臓病の治療のための新しい治療上のターゲットを開発するために使用可能性があります洞察力を提供できます。ここでは、ユニークな細胞培養系を用いた心筋細胞のミトコンドリア呼吸を分析します。まず、プロトコルは急速に分離し、高生存率新生児マウス心筋細胞の培養に最適化されています。その後、96-well 細胞フラックス アナライザーを使用してこれらの心筋の酸素消費量を評価します。このプロトコルの播種条件を最適化し、示した細胞フラックス アナライザーでその新生児マウス心筋酸素消費量を簡単に評価できます。最後に、我々 は大きく文化に私達のプロトコルを適用できるし、他の研究は、細胞内シグナル伝達などと収縮機能解析を注意してください。

概要

連続的な心臓の収縮機能を維持するために、心筋細胞は ATP¹の形で主に細胞のエネルギーの安定供給を維持しなければなりません。中心部には、ATP の約 95% はミトコンドリア酸化的リン酸化、ミトコンドリアが心機能^2,3で重要な生体エネルギーの役割を再生表示を中心にによって生成されます。この概念を支えるは、ミトコンドリア機能の不全心筋症や心不全の^4,5につながることができます。逆に、失敗の心機能を改善するために示されているミトコンドリアの機能を復元する^6、7の心します。したがって、ミトコンドリアのエネルギー代謝のメカニズムを勉強して、心筋細胞のミトコンドリア機能の新しい調節を識別する心臓エネルギーの生産の機械論的な洞察力を明らかにはしない、またつながる洞察力を提供できます。心疾患^6,8の治療に新しい治療上のターゲットの開発。

心臓全体と比較して、非常に純粋な非筋細胞線維芽細胞や血管内皮細胞¹⁰など、心の底からの雑菌は心筋細胞と非筋細胞⁹、心筋細胞文化の混合物が含まれています。さらに、新生児の子犬から心筋細胞を分離する大人の心^10,11から分離する細胞と比較して時間の少量の細胞の数が多いを養殖できます。最も重要なは、一次培養アダルト マウス心筋細胞 (例えば 24 h) 回生存期間が短縮、長い時間でポイントが逆差別化します。新生児マウス心筋細胞は生き残ることができる、7 日間の培養、心筋細胞¹⁰薬剤化合物とミトコンドリアの機能に関する遺伝子操作の効果をテストに最適な上向きの操作します。もちろん、成人と新生児の細胞の重要な生物的違いがあるが、新生児の細胞の培養のため長い期間使用可能なため、ミトコンドリア機能のそれらを含む研究の多くの異なる種類の適切です。

までに、一次培養新生児マウスおよびラットの心筋細胞は、心臓の生体エネルギー^12,13を研究するモデルとして使用されています。近年では、研究は酸素消費量 (OCR) を測定し、マウスおよびラット新生児心筋細胞^14,15酸化能力を評価する細胞フラックス アナライザーを使用しました。一方、ラットと比較して、マウス新生児心筋細胞の細胞生存率が低い、大きい変動¹⁶です。また、遺伝子改変マウスのモデルから細胞を調査する機能はマウス細胞モデルを非常に重要ななります。OCR 研究が細胞数および播種密度に敏感、一貫性のある細胞収量および生存率を達成するために再現性のある、信頼性の高い、簡単なプロトコルの開発が必要です。

ここでは、OCR 解析 96 ウェル フォーマット細胞フラックス アナライザーと共に培養マウス新生児心筋細胞を使用して開発されている最適化されたプロトコルを報告します。このプロトコルは、アッセイの再現性を大きく向上します。また、プロトコルだけでなく小説や OCR 分析の再現性のある方法を提供がも、筋原繊維機能を研究するために必要と細胞内となるよう、他の実験目的のためはより大きいサイズの文化に適応することができます。シグナル伝達経路。

特に、このプロトコルは 96-well 細胞培養プレート新生仔マウスにおける心筋細胞の分離と培養の 1 日プロシージャを記述します。さらに、それは細胞外フラックス アナライザーを使用して酸素消費量を測定する手順を説明します。使用されるすべてのソリューションが滅菌、滅菌フィルタ リングします。すべてのツールは、75% エタノールで滅菌されています。プロシージャのさまざまな部分の材料のテーブルを提供します。心筋細胞を培養するためすべての手続きや手順は、標準セル文化フードで実行されます。このプロトコルは、1 リットル (約 8-10 子犬) から新生児マウス心を分離するため開発されています。ただし、プロトコルは、複数の仔から心筋細胞を分離するために適応させることができます。

プロトコル

新生仔マウスの仕事のためなど動物プログラムによってローカル大学のガイドラインのセットを参照してくださいして 1 つの機関およびその他適切な法律を遵守ください。このプロトコルで記述されているすべてのメソッドは UC サンディエゴ機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、連邦および州の規制に準拠します。

1. 試薬の調製

1. 事前消化液25 mL を準備: トリプシン (0.5 mg/mL) を添加した Ca^{2 +}と Mg^{2 +}) を除いた HBSS。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションを殺菌し、使用するまで氷の上を保ちます。実験の日は、事前消化ソリューション。
   注:Ca^{2 +}なし HBSS を使用することが重要と Mg^{2 +}Ca^{2 +}と Mg^{2 +}は、心筋収縮と分離の間にそれに続く細胞死。
2. 30 mL のコラゲナーゼ消化バッファーを準備: コラゲナーゼ (0.8 mg/mL、約 350 U/mL) (Ca^{2 +}と Mg^{2 +}) なし HBSS バッファーに溶解しました。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションを殺菌し、使用するまで氷の上を保ちます。実験の日は、コラゲナーゼ消化ソリューション。
3. 心筋細胞培養媒体 (成長媒体)の 500 mL を準備: DMEM の 375 mL、M-199 の 125 mL、25 mL のウマ血清の FBS の 12.5 mL をミックスします。1% ペニシリンとストレプトマイシン溶液を補足します。
4. ミトコンドリア ストレス テスト メディアの準備: DMEM を作る 200 mL ベース 1 mM ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン, 2 mM と 10 mM グルコース 2 mM Hepes と補われる (DMEM NaHCO₃、なし参照テーブルの材料) ストレス テスト中。
   注:ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、ブドウ糖、Hepes、ファイラー、滅菌せず DMEM 培地 1 L を作るし、4 ° C で保存アッセイの日にストレス テスト媒体を準備するには、その他の試薬を追加します。DMEM を使用せず NaHCO₃媒体は重要です。
5. 使用の日の 7.4 にミトコンドリア ストレス テスト メディアの pH を調整します。使用前に 37 ° c の暖かいメディア。
6. オリゴマイシンの準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
7. FCCPの準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
8. アンチマイシン Aの準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
9. ロテノンを準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
   注:すべての試薬およびソリューションをこのプロトコルで使用される表1 のとおりです。

2. 収穫と新生児マウス (1 日目) から心の事前消化

1. オートクレーブ ハサミ、鉗子、モリア スプーンを消毒します。
2. 無菌細胞文化フードのすべての手順を実行します。
3. (せずに Ca^{2 +}Mg^{2 +}) HBSS の 6 も細胞培養プレートの各ウェルに分注 5 mL氷の上を配置します。分注 10 mL HBSS の 10 cm 細胞培養ディッシュに。
4. 50 mL の生殖不能の円錐管のトリプシン事前消化液 20 mL を準備します。氷の上のすべてのソリューションをしてください。
5. すぐに殺菌のため 70% エタノール溶液で新生児 (0 日) マウスを浸しなさい。
6. 麻酔なしで、(まっすぐ) 滅菌はさみを使用して子犬の首をはねるし、胸部キャビティおよび中心へのアクセスを許可するように胸骨に沿って胸を開きます。(図 1 a)
   注: 1) P0 新生児マウスを高細胞生存率を達成するために使用することが重要です。2) この安楽死方法は NIH とアメリカの獣医の医学連合のガイドライン¹⁷に従って新生児許可します。
7. 高級はさみ (せずに Ca^{2 +}Mg^{2 +}) HBSS を含む無菌細胞培養皿はすぐに転送と体から心を抽出 (図 1 b)。
8. 残存肺組織、大型船舶等を削除 (と心房、必要な場合)。利用した穏やかな攪拌 HBSS ソリューションで心を洗います。
9. 高級ハサミで 8 個にそれぞれの心をカットし、HBSS (図 1 と 1 D) と 6 も細胞培養プレートの 1 つのウェルに鉗子ですべての心臓組織を転送します。
10. HBSS、モリアのスプーン (図 1) を使用して満ちて 6 ウェル プレートで井戸から井戸に心を移すことによって心を洗います。
    注:転送心よくからよく血を洗うのに十分です。血液酵素消化を妨げますので、HBSS で心の中を洗浄し、血液を除去することが重要です。
11. 20 mL のトリプシン (0.5 mg/mL) を含む円錐管にモリアのスプーンで心を移すし、4 h (図 1E) の 4 ° C で穏やかな攪拌と孵化します。

3. 準備 96 ウェル培養プレート (1 日目)

1. コーティング溶液 5 mL を準備: 0.5% のゼラチン (使用する前にオートクレーブ) と 1% フィブロネクチン溶液を含む PBS。(例えば 5 mL ゼラチン溶液とフィブロネクチン溶液 50 μ L)
2. 96 ウェルの細胞培養プレートの各ウェルにコーティング溶液 50 μ L 分注 (材料の表を参照してください)。気泡が存在する場合を泡を吸う 20 μ L ピペットを使用してそれらを削除します。
   注:コーティング液の各ウェルの表面すべての領域をカバーすることが重要です。
3. マトリックス コーティングの乾燥を許可する 1 h 以上の 37 ° C 細胞文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。
4. 心筋細胞を播種する前に任意の残留塗液を吸い出しなさい。

4. 酵素消化、細胞 (1 日目) のめっき

1. 37 ° C の水浴中のコラゲナーゼ消化ソリューションは事前に暖かい。
   注:これは、手順は効率的な酵素の消化力を達成するために重要です。
2. 心と細胞文化フードに 4 ° C から事前消化ソリューションを含む円錐管を移動します。(図 1 f)
3. 心管の底に沈むと 10 mL の血清ピペットを使用して事前消化ソリューションを削除 (分離培地の 1 ~ 2 mL チューブに残る場合があります)。
4. HBSS 管に 10 mL を追加します。再の中断心 HBSS を 2-3 回 10 mL の血清ピペットを使用してトリプシンを洗浄します。HBSS を吸引 (1 ~ 2 mL チューブに残る場合があります)。
5. 心としたチューブに予め温めておいたコラゲナーゼ消化溶液 10 mL を追加します。(図 1)
6. 心撹拌せず 10 分の 37 ° C の水浴中でチューブを孵化させなさい (1 日消化)。
7. 第 1 消化後細胞文化フードにチューブを移動します。ゆっくりゆっくり 10 回 10 mL の血清ピペットを使用してチューブ内の心を再停止することによって心をカップ刻んだ。これは、分散する心と心臓組織から放出される細胞が許可されます。(図 1 H)
   注:心筋細胞がもろくなっているので穏やかな製粉は高い生存率を達成するために重要です。
8. シンク、心筋 (約 9-10 mL) 新しい円錐管に濃縮消化ソリューションを転送およびコラゲナーゼの消化力を停止する細胞培養媒体の等しい量を追加すぐに未消化の組織ができます。
9. 残りの未消化の心臓組織を含むチューブにコラゲナーゼ消化溶液 10 mL を追加します。
10. 10 分の 37 ° C の水浴の心臓組織と管を孵化させなさい (第 2 消化)。
11. 4.7 ・ 4.8 の手順を繰り返します。
    注:まだまだ未消化の組織がある場合は、消化 1 つより多くの時間を繰り返します。しかし、ほとんどのケースで 2 つ消化力は心臓組織から細胞の大部分を分散するのに十分です。
12. 新しい滅菌 50 mL のコニカル チューブに無菌細胞ストレーナー (100 μ m ナイロン メッシュ) を配置します。中古ウェットは 2-3 ml の細胞培養媒体のセル ストレーナーとセル ストレーナーを介して細胞を通過します。2-3 ml の細胞培養媒体のセル ストレーナーをすすいでください。(図 1I)
13. (図 1 j) 180 x gで 5 分間心筋細胞を含む円錐管を遠心します。細胞組織の残骸が含まれてし、10 ml の細胞培養媒体 (図 1 L) 細胞ペレットを再中断上清 (図 1 K) を吸引します。
14. 優しく細胞と 10 cm の細胞培養ディッシュ (プラスチック コーティングの任意の種類なし) に板細胞を再懸濁します、携帯文化のインキュベーター (1 プレめっき) で 1 時間インキュベート (図 1 M)。このプレめっきステップにより、非心筋細胞、線維芽細胞と血管内皮細胞、コーティングされていない細胞培養シャーレに付着するなどです。
    注:この時点では、心筋細胞は丸い形は、通常、顕微鏡下で光沢のある表示。(図 1 n)。
15. 1 時間培養した後に、優しくプレートを扇動、10 cm の培養皿から非付着細胞 (心筋細胞の濃縮) を洗浄し、再細胞培養液を 10 mL の血清ピペットを使用して料理を繰り返しピペッティングにより細胞を中断します。新しい 10 cm 細胞培養ディッシュ (プラスチック、コーティングなし) に非付着細胞 (心筋細胞の濃縮) を転送し、携帯文化のインキュベーター (2 プレめっき) でさらに 1 時間インキュベートします。
    注:非コーティング プレートに細胞が支配的非心筋細胞: 線維芽細胞と血管内皮細胞、(図 1O) 顕微鏡の下で視覚化できます。
16. 第 2 回プレめっき後に、ゆっくりプレートを扇動、10 cm の培養皿から非付着細胞 (心筋細胞) を洗って、新しい 50 mL の円錐管に心筋細胞を移します。

5. 96 ウェルの細胞培養プレート (1 日目) にセルとめっきセルをカウントします。

1. 診断を使用してセルをカウントします。
2. 200 μ L (図 1 P) の最終巻でマルチ チャンネル ピペットを使用して 10 の³細胞/ウェル x 10-30 の間密度の細胞外マトリックス コート 96 ウェルの細胞培養プレートに細胞をプレートします。背景の井戸 A1、A12、H1、H12 を使用: これらの井戸 (セルの) で他の井戸として培養液 200 μ L を追加。37 ° C 細胞文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。
   注:本研究では、酸素消費量は 10 x 10³20 × 10 の³、または 30 x 10³細胞/ウェルなどの異なるセル密度を使用してによってテストされました。(図 2 a)。また、上記のように、分離の直後に心筋は丸い形は、通常、顕微鏡下で光沢のある表示。16-24 時間文化の内で実行可能なセルが平らになります。

6 96 ウェル フォーマット細胞フラックス アナライザー (日 2) を使用して酸素消費量測定

注:酸素消費量試金はセルをめっき後 1 日実施またはそれ以降。このプロトコルは、7 日間を生き残ることができる新生児心筋細胞培養を用いた分離をポストします。

1. フラックス アナライザー センサー カートリッジを水和物 (材料の表を参照してください)、少なくとも 3 時間、しかし、理想的に試金の前に、丸一日のため。Calibrant 溶液 200 μ L を追加ユーティリティ プレートのウェルにユーティリティのプレートの上にバック センサー カートリッジを置くし、CO₂や O₂補充なし 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい (材料の表を参照してください)。
2. 細胞培養媒体 [ミトコンドリア ストレス テスト中] に変更すると、アッセイの前に 1 時間。心筋細胞が壊れやすいです。したがって、慎重にマルチ チャンネル ピペットを使用して細胞の培養基を削除、予め温めておいたミトコンドリア ストレス テスト メディアの 200 μ L でセルを洗浄して 2 回。第 2 洗浄後に予め温めておいたミトコンドリア ストレス テスト メディアの 175 μ l 添加し CO₂や O₂補充なし 37 ° C の定温器の細胞の培養します。
3. 集中テスト混合物を準備します。ミトコンドリア ストレス テストの 16 μ M のオリゴマイシン、FCCP、9 μ M、20 μ M ロテノンと 20 μ M アンチマイシン A、すべてミトコンドリア ストレス テスト中の混合物の各 3.0 mL を準備します。
   注:記載されている濃度各化合物をテストされています。しかし、自分の研究室の各化合物の濃度を滴定は必要です。
4. マルチ チャンネル ピペット (図第 1 四半期) を使用してセンサー カートリッジのインジェクターのポートに各化合物の 25 μ L をロードします。ボリュームと最終的な濃度は表 2のとおりです。
5. 細胞外のフラックスの試金のプロトコルを設定します。プログラムに記載されてテーブル 3.
6. プログラムを起動します。まず、校正 (図 1 r) 機にセンサー カートリッジを入れます。校正手順が完了したらは、アッセイ プレートの calibrant を交換します。
   注:製造元から提供されたソフトウェアを使用して、ポートと井戸と各化合物のグループを示します。
7. 必要に応じて、アッセイ後、慎重にマルチ チャンネル ピペットを使用して、すべてのアッセイ中を破棄し、蛋白質の試金を使用して未来のセル正規化の-20 ° C で細胞培養プレートを格納します。
8. タンパク質含有量を測定します。標準リッパ細胞溶解液を 50 μ l 添加 (材料の表を参照してください)。完全に細胞を溶解する 30 分間氷の上プレートを孵化させなさい。すべての材料を新しい明確なフラットボトム 96 よくアッセイ プレートに転送します。
9. 製造元のプロトコルに従って BCA アッセイによってタンパク質の濃度を測定します。
   注:各ウェルの高蛋白質の集中の結果細胞外マトリックスで井戸をコーティングします。したがって、実際のセルの蛋白質の集中を取得するバック グラウンド well(s) (電池なし) の量を減算します。細胞由来タンパク質濃度は低い 96 ウェル培養プレートです。さらに、タンパク質濃度は、細胞外マトリックス コーティングにより井戸-井戸から変更できます。そのため、OCR を正常化するセル番号を使用することをお勧めします。

結果

説明されたプロトコルを使用して、心は 0 日目の新生児の子犬から分離されました。5 x 10 の⁵セル/子犬を入手し、心筋細胞が 10 x 10³20 × 10 の³、または 30 x 10³細胞/ウェル、96 ウェル プレート (図 2 a) の密度で播種しました。一晩培養後心筋細胞が発見されたコーティング プラスチック表面によく付着 (未接続の細...

ディスカッション

本研究では、分離すること、マウス新生児心筋細胞を培養するための単純なプロトコルを設けています。これらの心筋細胞を用いて、細胞フラックス アナライザー システムを用いた酸素消費量を測定するための条件も最適化されています。プロトコルでは、そのままの臓器で測定されるものに似ている、心の主作業セルの酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	SIGMA	A8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores	FALCON	352360	To capture undigested tissue
Collagenase type II	Worthington	LS004176	To make collagenase digestion solution
D-Glucose	SIGMA	75351	To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose	Life technologies	11965-092	To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	SIGMA	C2920	Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies	26140-079	To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma	SIGMA	F1141-5MG	To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors	Fine Sciences Tools	14060-10	For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin	SIGMA	G-1890	To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum	Life technologies	26050-088	To make cell culture medium
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	To make mitochodnrial stress test medium
M-199	Cellgro	10-060-CV	To make cell culture medium
Moria spoon	Fisher scientific	NC9190356	To wash hearts
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer	Fisher scientific	89900	To lyse the cells for protein assay
Rotenone	SIGMA	R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent		Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors	Fine Sciences Tools	91401-12	For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size			For sterile filtration of digestion medium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	To make pre-digestion solution