Анализ скорости потребления кислорода в неонатальной кардиомиоцитов культивировали мыши с помощью анализатора внеклеточного потока

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы проиллюстрировать использование мыши неонатальной cardiomyocytes как модель системы для изучения, как различные факторы могут изменить потребление кислорода в самом сердце.

Аннотация

Митохондрии и окислительного метаболизма являются критическими для поддержания функции сердечной мышцы. Исследования показали, что митохондриальной дисфункции является важным фактором для нарушения функции сердца, в сердечной недостаточности. Контрастом восстановление дефектных митохондриальной функции может иметь благоприятные последствия для улучшения сердечной функции, в противном случае сердце. Таким образом изучая механизмы регулирования и выявления роман регуляторы для функции митохондрий может обеспечить понимание, которые могут быть использованы для разработки новых терапевтических целей для лечения болезни сердца. Здесь сердечной myocyte митохондриальное дыхание анализируется с использованием системы культуры уникальный клеток. Во-первых протокол был оптимизирован для быстро изолировать и культура высокой жизнеспособности новорожденного мыши кардиомиоцитов. Затем анализатор внеклеточного поток 96-луночных формат используется для оценки норма расхода кислорода этих кардиомиоцитов. Для этого протокола мы оптимизирована посева условий и продемонстрировал, что темпы потребления кислорода кардиомиоцитов неонатальной мыши можно легко оценивать внеклеточного потока анализатора. Наконец мы отмечаем, что наш протокол может быть применен к большим размером культуры и другие исследования, такие как внутриклеточной сигнализации и сократительной функции анализа.

Введение

Для поддержания непрерывной сократительной функции сердца, кардиомиоцитов должны поддерживать постоянную поставку клеточной энергии в виде АТФ¹. В самом центре около 95% АТФ генерируется митохондрий, главным образом через окислительное фосфорилирование, показаны, что митохондрии играть решающую роль биоэнергетический в сердечной функции^2,3. Поддерживая это понятие, что dysregulation митохондриальной функции может привести к сердечной недостаточности и кардиомиопатия^4,5. И наоборот, восстановление функции митохондрий было показано для улучшения сердечной функции неисправного сердце^6,7. Таким образом изучая механизм митохондриальной биоэнергетики и выявления роман регуляторы митохондриальной функции в cardiomyocytes будет не только выявить механистический идеи производства сердечной энергии, но также может обеспечить понимание того, что приведет для развития новых терапевтических целей для лечения заболеваний сердца^6,8.

По сравнению с всем сердцем, который содержит смесь миоцитов и не миоцитах⁹, cardiomyocyte культур очень чистый, с минимальным загрязнением не миоцитах от сердца, таких как фибробластов и эндотелиальных клеток¹⁰. Кроме того изоляция кардиомиоцитов из новорожденных щенков позволяет культивирование большое количество клеток в небольшом количестве времени, по сравнению с переключательным клетки от взрослых сердец^10,11. Самое главное культивированный взрослых мыши кардиомиоцитов имеют короткие выживания раз (например, 24 ч) и на длительное время точек де продифференцируйте. Cardiomyocytes новорожденных мыши может выжить и манипулировать для свыше 7 дней в культуре, что делает их идеальными для тестирования воздействия наркотиков соединений и генные манипуляции на функцию митохондрий в cardiomyocytes¹⁰. Конечно Существуют значительные биологические различия между клетками взрослых и новорожденных, но дольше продолжительность культуре клеток новорожденных делает их подходящими для различных типов исследований, в том числе митохондриальной функции.

На сегодняшний день основной культурный новорожденных крыс и мышей кардиомиоцитов используются в качестве модели для изучения сердца Биоэнергетика^12,13. В последние годы исследования используется анализатор внеклеточного потока для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и оценки окислительного потенциала в мышь и крыса неонатальной кардиомиоцитов^14,15. Хотя по сравнению с крысами, жизнеспособность клеток новорожденных кардиомиоцитов мыши ниже и имеет большую изменчивость¹⁶. Кроме того возможность изучать клетки генетически модифицированные мыши модели делает ячеечная модель мыши очень важно. Учитывая, что OCR исследования настолько чувствительны к ячейке количество и плотность посева, необходима разработка воспроизводимых, надежной и простой протокол для достижения последовательного клеток урожайность и жизнеспособности.

Здесь мы приводим оптимизированный протокол, который был разработан, который использует культивировали мыши неонатальной кардиомиоцитов наряду с 96-хорошо формат внеклеточного потока анализатор для анализа OCR. Этот протокол значительно увеличивает воспроизводимость анализа. Кроме того протокол не только обеспечивает Роман и воспроизводимый метод для анализа OCR, но также могут быть адаптированы к культуре большего размера для других экспериментальных целей, например, которые могут быть необходимы для изучения миофибрилл функций и внутриклеточной сигнальные пути.

В частности этот протокол описывает один день процедура изоляции и культуры кардиомиоцитов неонатальной мыши в пластине культуры 96-луночных клеток. Кроме того он описывает процедуру для измерения потребления кислорода с помощью анализатора внеклеточного потока. Все решения, используемые в стерильную или стерильной фильтрации. Все инструменты стерилизуются, 75% этанола. Мы предоставляем Таблицу материалов для различных частей процедуры. Для культивирования кардиомиоцитов, все процедуры и шаги выполняются в капюшоне культуры стандартной ячейки. Этот протокол разработан для изоляции сердца новорожденных мыши из одного помета (примерно 8-10 щенков). Однако протокол также может быть адаптирована для изоляции кардиомиоцитов из нескольких пометов.

протокол

Для работы с новорожденных мышей пожалуйста, обратитесь к набору руководящих принципов местного университета/института вперед программами ухода за животными и придерживаться своих институциональных и других соответствующих правил. Все методы, описанные в настоящем протоколе были одобрены UC Сан-Диего институциональных животное уход и использование Комитет (IACUC) и придерживаться правил федеральных и государственных.

1. Подготовка реагентов

1. Подготовка 25 мл раствора предварительно пищеварения: HBSS (без Ca^{2 +} и Mg^{2 +}) дополнены трипсина (0.5 мг/мл). Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. Сделайте предварительный пищеварение решение в день эксперимента.
   Примечание: Очень важно использовать HBSS без Ca^{2 +} и Mg^{2 +}, как Ca^{2 +} и Mg^{2 +} вызовет сокращение myocyte и последующие клеточной гибели во время изоляции.
2. Подготовка 30 мл коллагеназы пищеварениебуфера: коллагеназа (0,8 мг/мл, примерно 350 ед/мл) растворяют в HBSS (без Ca^{2 +} и Mg^{2 +}) буфера. Стерилизовать решения с помощью фильтра 0.22 мкм и держать на льду до использования. Сделайте коллагеназы пищеварение решение в день эксперимента.
3. Подготовка 500 мл cardiomyocyte культуры массовой информации (рост): Mix DMEM 375 мл, 125 мл M-199, 25 мл сыворотки лошади и 12,5 мл FBS. Дополнение с 1% пенициллина и стрептомицина 1% раствор.
4. Подготовка среднего митохондриальной стресс-тест: сделать 200 мл DMEM на основе среднего стресс-тест (DMEM без NaHCO₃, см. Таблицу материалы) дополнены пируват натрия 1 мм, 2 мм L-глютамином и глюкоза 10 мм и 2 мм Hepes.
   Примечание: Сделайте 1 Л с DMEM среды без пируват натрия, L-глютамин, глюкозы и Hepes, фильтром стерильные и хранить в 4 ° C. Подготовка среднего стресс-тест в день assay путем добавления других реагентов. С помощью DMEM среднего без NaHCO₃ имеет решающее значение.
5. Отрегулируйте пэ-аш митохондриальной стресс-тест СМИ до 7,4 в день использования. Теплый СМИ до 37 ° C перед использованием.
6. Подготовка oligomycin: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
7. Подготовка FCCP: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
8. Подготовка antimycin A: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
9. Подготовить ротенон: подготовить 5 мл 5 мм Стоковый раствор в ДМСО, внести 250 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
   Примечание: В таблице 1перечислены все реагенты и решения, используемые в настоящем Протоколе.

2. Заготовка и предварительно пищеварение сердец от новорожденных мышей (1 день)

1. Автоклав ножницы, щипцы и ложкой Мории стерилизовать.
2. Выполните все шаги в капот культуры клеток для бесплодия.
3. Аликвота 5 мл HBSS (без Ca^{2 +}, мг^{2 +}) для каждой скважины 6-ну клетки культуры плиты; место на льду. Аликвота 10 мл HBSS в блюдо культуры клеток 10 см.
4. Подготовка 20 мл раствора предварительно Пищеварение трипсина в 50 мл стерильного Конические трубки. Держите все решения на льду.
5. Быстро окуните новорожденных (день 0) мышах в 70% этанола раствор для стерилизации.
6. Обезглавить щенков, используя стерильные ножницы (прямой) без наркоза, а затем открыть сундук вдоль грудины, чтобы разрешить доступ к грудной полости и сердце. (Рис. 1A)
   Примечание: 1) очень важно использовать P0 новорожденных мышей для достижения жизнеспособности высокой клеток. 2) Этот метод эвтаназия разрешена для новорожденных в соответствии с руководящими принципами низ и американской ветеринарной медицинской ассоциации ¹⁷.
7. Извлечение сердца из тела с тонкой ножницы и передачи непосредственно в стерильных клетки культуры блюдо, содержащие HBSS (без Ca^{2 +}, мг^{2 +}) (рис. 1B).
8. Удалите любые остаточные легочной ткани, более крупных судов и т.д. (и атриумов, при необходимости). Помыть сердца в HBSS решения с помощью нежный агитации.
9. 8 нарезать каждое сердце с тонкой ножницы и передавать все ткани сердца с щипцами в одну скважину 6-ну клетки культуры плиты с HBSS (Рисунок 1 c и 1 D).
10. Помыть сердца путем передачи сердца от скважины в пластину 6-хорошо наполненный HBSS, используя ложку Мории (рис. 1 d).
    Примечание: Передача сердца от скважины является достаточно промыть крови. Поскольку кровь вмешивается ферментативного пищеварения важно помыть сердца с HBSS и удалить кровь.
11. Передача сердца ложкой Мориа в коническую пробирку, содержащую 20 мл трипсина (0.5 мг/мл) и инкубировать с нежным агитации на 4° C для 4 h (Рисунок 1E).

3. Подготовьте тарелку 96-луночных культуры (день 1)

1. Подготовить 5 мл раствора покрытие: PBS, содержащие желатин (автоклав перед использованием) 0,5% и 1% раствор фибронектин. (например, 5 мл раствора желатина плюс 50 мкл раствора фибронектин)
2. Раствор для нанесения покрытия в каждой скважине пластину культуры клеток 96-луночных аликвота 50 мкл (см. Таблицу материалы). Если присутствуют пузырьки, удалите их с помощью пипетки 20 мкл сосать пузыри вне.
   Примечание: Важно охватить все площади поверхности каждой скважины с раствор для нанесения покрытия.
3. Инкубируйте пластину в инкубатор культуры клеток 37 ° C за 1 ч или больше, чтобы позволить сушки покрытия матрицы.
4. Аспирационная любое решение остаточного покрытия перед посевом кардиомиоцитов.

4. ферментативный пищеварения и обшивка клеток (1 день)

1. Предварительно теплой коллагеназы пищеварение раствор в ванну воды 37 ° C.
   Примечание: Этот шаг является важным для достижения эффективной ферментативного пищеварения.
2. Переместите конические трубка, содержащая сердца и предварительно пищеварение решение от 4 ° C капот культуры клеток. (Рисунок 1F)
3. Пусть сердца опускаться на дно трубки и удалить предварительно пищеварение решение с помощью Пипетки серологические 10 мл (1-2 мл среды изоляции может оставаться в трубе).
4. Добавьте 10 мл HBSS в трубу. Вновь приостановить сердца с HBSS 2 - 3 раза промыть трипсина, используя Серологические Пипетки 10 мл. Аспирационная HBSS (1-2 мл может оставаться в трубе).
5. Добавьте 10 мл раствора подогретым коллагеназы пищеварение в пробирку с сердечками. (Рис. 1 g)
6. Инкубировать трубки с сердечками на водяной бане 10 минут без агитации 37 ° C (1 пищеварение).
7. После 1-й пищеварение переместите трубку на капот культуры клеток. Аккуратно нарезанных сердца путем повторного приостановления сердца внутри трубки, нежно 10 раз с помощью Пипетки серологические 10 мл. Это позволит клетки выйдет из ткани сердца и сердца разойтись. (Рис. 1 H)
   Примечание: Так как кардиомиоцитов хрупки, нежный Тритурация имеет важное значение для достижения высокой жизнеспособности.
8. Пусть непереваренных ткани раковина, передачи переваривается раствор обогащенный кардиомиоцитов (примерно 9-10 мл) для новой Конические трубки и сразу же добавить равное количество клеток культуры СМИ прекратить коллагеназы пищеварение.
9. Добавьте 10 мл раствора коллагеназы пищеварение в пробирку, содержащую оставшиеся непереваренных сердечной ткани.
10. Инкубировать трубку с ткани сердца в водяной бане 10 минут 37 ° C (2-й пищеварение).
11. Повторите процедуру 4.7 и 4.8.
    Примечание: Если есть еще много непереваренных ткани, повторите пищеварение еще один раз. Однако в большинстве случаев, две пищеварения являются достаточно, чтобы разогнать большинства клеток из ткани сердца.
12. Место стерильным клеток сито (100 мкм нейлоновая сетка) в новый стерильный 50 мл Конические трубки. Предварительно Влажные клетки ситечко с 2-3 мл клетки культуры средств массовой информации и передайте клетки через клетки ситечко. Промойте клетки ситечко с 2-3 мл клетки культуры средств массовой информации. (Рисунок 1I)
13. Центрифуга конические трубка, содержащая кардиомиоцитов за 5 мин при 180 x g (Рисунок 1J). Аспирационная супернатант (рис. 1 K), который будет содержать клетки ткани мусор и вновь приостановить Пелле клеток в 10 мл СМИ культуры клеток (рис. 1 Л).
14. Нежно ресуспензируйте клетки и клетки пластины на культуры клеток 10 см блюдо (пластик без любой тип покрытия) и инкубировать 1 час в инкубатор культуры клеток (1 предварительного покрытия) (рис. 1 M). Этот шаг перед покрытием позволяет non кардиомиоцитов, например фибробластов и эндотелиальных клеток, придерживаться блюдо немелованной культуры клеток.
    Примечание: На данный момент кардиомиоцитов обычно круглой формы и появляются блестящие под микроскопом. (Рисунок 1N).
15. После инкубации 1 h аккуратно агитировать плиты, мыть не сторонник клетки (обогащенный кардиомиоцитов) от 10 см культуры блюдо и вновь приостановить клетки, неоднократно закупорить клетки культуры среднего за блюдо с помощью Пипетки серологические 10 мл. Затем не сторонник клетки (обогащенный кардиомиоцитов) перехода в новое блюдо культуры клеток 10 см (пластик без каких-либо покрытия) и проинкубируйте еще 1 ч в инкубатор культуры клеток (2 предварительного покрытия).
    Примечание: Клетки, которые придают пластину-покрытием являются преимущественно не кардиомиоцитов: фибробластов и эндотелиальных клеток, которые могут быть визуализированы под микроскопом (Рисунок 1O).
16. После 2 Предварительная обшивка, осторожно агитировать плиты, мыть не сторонник клетки (кардиомиоцитов) от 10 см культуры блюдо, а затем перевести кардиомиоцитов в новой 50 мл Конические трубки.

5. Подсчет клеток и гальванических клеток в культуре плиту 96-луночных клеток (1 день)

1. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
2. Пластина клетки в 96-луночных клетки культуры пластины внеклеточного матрикса покрытием на плотности между 10-30 x 10³ клеток/колодец с помощью многоканальных дозаторов в окончательном объеме 200 мкл (рис. 1 P). Использование скважин А1, A12, H1 и H12 для фона: 200 мкл питательной среды как другие скважины в этих скважинах (без клетки). Инкубируйте пластины в инкубатор культуры клеток 37 ° C.
   Примечание: В этом исследовании потребление кислорода был протестирован с помощью различных клеток плотности или 10 x 10³, 20 x 10³, 30 x 10³ клеток/хорошо. (Рис. 2A). Кроме того, как указано выше кардиомиоцитов сразу после изоляции обычно круглой формы и появляются блестящие под микроскопом. В течение 16-24 ч культуры будет расплющить жизнеспособных клеток.

6. кислорода Assay потребления с помощью анализатора внеклеточного Flux 96-хорошо формат (день 2)

Примечание: Пробирного потребление кислорода может осуществляться через один день после покрытия клетки или более поздней версии. Неонатальный кардиомиоцитов культивированный используя этот протокол может продержаться до 7 дней пост изоляции.

1. Гидрат картридж датчик анализатор потока (см. Таблицу материалы) для по крайней мере 3 часа, но в идеале на полный рабочий день, до assay. Добавить 200 мкл раствора Calibrant (см. Таблицу материалы) в каждой скважины пластину Утилита, поместить датчик картридж обратно на пластину утилита и инкубировать в инкубаторе 37 ° C без CO₂ или O₂ добавок.
2. Изменить ячейки культуры средств массовой информации на митохондрии стресс тест средний один час до assay. Cardiomyocytes являются хрупкими. Таким образом аккуратно извлеките носитель культуры клеток с помощью многоканальных дозаторов и вымыть клетки с 200 мкл подогретым митохондриальной стресс-тест СМИ дважды. После второй мыть 175 мкл подогретым митохондрий стресс тест СМИ и культура клетки в инкубаторе 37 ° C без CO₂ или O₂ добавок.
3. Подготовьте концентрированной испытаний соединений. Для стресс-теста митохондрий Подготовьте 3,0 мл 16 мкм oligomycin, 9 мкм FCCP и смесь из 20 мкм ротенон и 20 мкм antimycin A, все в среде митохондриальной стресс-тест.
   Примечание: Каждое соединение на концентрации, в описанный был протестирован. Однако необходима титрования концентрации каждого соединения в собственной лаборатории.
4. Загрузите 25 мкл каждого соединения в порты инжектор датчик картриджа с помощью многоканальных дозаторов (Рисунок 1 квартал). Объем и конечная концентрация, описаны в таблице 2.
5. Настройте протокол assay внеклеточного потока. Программа описана в Таблица 3.
6. Запустите программу. Во-первых Вставьте картридж датчик в машину для калибровки (Рисунок 1R). Замените calibrant на пластину пробирного после калибровки шаг делается.
   Примечание: С помощью программного обеспечения, предоставленного изготовителем, указывают группы скважин и каждое соединение и порт.
7. При желании, после анализа, тщательно удалить все пробирного среднего с помощью многоканальных дозаторов и хранить микроплиты культуры клеток при-20 ° C для нормализации будущих клеток, используя assay протеина.
8. Измерить содержание белка. Добавьте 50 мкл стандартного раствора лизис клетки RIPA (см. Таблицу материалы). Инкубируйте пластину на льду на 30 минут, чтобы полностью Лизируйте клетки. Передать все материалы нового ясно плоская 96 хорошо пробирного днище.
9. Измерить концентрацию белка BCA пробирного согласно протоколу от производителя.
   Примечание: Покрытие также с внеклеточного матрикса приводит к высоким содержанием белка концентрацию в каждой скважине. Таким образом вычтите количество фон well(s) (без клетки) чтобы получить фактические ячейки концентрацию белка. Концентрация белка, полученные из клеток низка в плиту 96-луночных культуры. Кроме того концентрация белка может варьироваться от скважины из-за покрытия внеклеточного матрикса. Таким образом предлагается использование мобильный номер для нормализации OCR.

Результаты

С помощью протокола описаны, сердца были изолированы от день 0 новорожденных щенков. 5 x 10⁵ клеток/щенка были получены, и кардиомиоцитов были осеменены на плотности 10 x 10³, 20 x 10³или 30 x 10³ клеток/Ну, в 96 хорошо пластины (рис. 2A). После ноч?...

Обсуждение

В этом исследовании мы создали простой протокол для изоляции и культивирования мыши неонатальной кардиомиоцитов. Используя эти кардиомиоцитов, мы также оптимизировали условий для измерения скорости потребления кислорода с помощью системы анализатора внеклеточного потока. Протокол ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	SIGMA	A8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores	FALCON	352360	To capture undigested tissue
Collagenase type II	Worthington	LS004176	To make collagenase digestion solution
D-Glucose	SIGMA	75351	To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose	Life technologies	11965-092	To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	SIGMA	C2920	Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies	26140-079	To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma	SIGMA	F1141-5MG	To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors	Fine Sciences Tools	14060-10	For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin	SIGMA	G-1890	To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum	Life technologies	26050-088	To make cell culture medium
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	To make mitochodnrial stress test medium
M-199	Cellgro	10-060-CV	To make cell culture medium
Moria spoon	Fisher scientific	NC9190356	To wash hearts
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer	Fisher scientific	89900	To lyse the cells for protein assay
Rotenone	SIGMA	R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent		Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors	Fine Sciences Tools	91401-12	For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size			For sterile filtration of digestion medium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	To make pre-digestion solution