Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Zusammenfassung

Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.

Zusammenfassung

Mitochondrien und oxidativen Stoffwechsel sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Funktion des Herzmuskels. Forschung hat gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion ein wichtiger Faktor für beeinträchtigte Herzfunktion bei Herzinsuffizienz gefunden. Im Gegensatz dazu möglicherweise Wiederherstellung defekter mitochondriale Funktion wohltuende Wirkung auf die Verbesserung der Herzfunktion bei Herzinsuffizienz. Daher könnte die regulatorischen Mechanismen und Identifizierung neuer Regler für mitochondriale Funktion Einblicke die genutzt werden könnten, um neue therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Hier ist kardialen Myozyten mitochondriale Atmung mit einer einzigartigen Zellkultursystem analysiert. Zunächst wurde ein Protokoll optimiert, um schnell zu isolieren und hohe Rentabilität Neugeborenen Maus Herzzellen Kultur. Dann ist eine 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer verwendet, um den Sauerstoff-Verbrauch von diesen Kardiomyozyten zu beurteilen. Für dieses Protokoll wir säen Bedingungen optimiert und demonstrierte, dass Neugeborenen Maus Herzzellen Sauerstoff-Verbrauch leicht in eine extrazelluläre Flux-Analysator beurteilt werden kann. Wir beachten, dass unser Protokoll auf eine größere Größe der Kultur auch kann und andere Studien, wie z. B. die intrazelluläre Signal- und kontraktile Analyse Funktion.

Einleitung

Um eine stetige kardiale kontraktile Funktion aufrecht zu erhalten, müssen die Herzzellen eine konstante Versorgung mit zellulären Energie hauptsächlich in Form von ATP¹pflegen. Im Herzen entsteht etwa 95 % der ATP durch Mitochondrien, vor allem durch Oxidative Phosphorylierung, zeigt, dass Mitochondrien Herzfunktion^2,3bioenergetische maßgeblich beteiligt. Unterstützen diese Vorstellung ist, dass Dysregulation der mitochondrialen Funktion zu Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz^4,5führen kann. Umgekehrt, Wiederherstellung der Funktion der Mitochondrien hat gezeigt, dass das Versagen der Herzfunktion verbessern Herz-^6,7. Daher konnte studieren des Mechanismus der mitochondrialen Bioenergetik und Identifizierung neuartige Regulatoren der mitochondrialen Funktion in Kardiomyozyten verraten nicht nur mechanistische Einblicke der kardialen Energieerzeugung aber auch Einblick, der führt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ziele zur Behandlung von Herz-Kreislauferkrankungen^6,8.

Im Vergleich zu das ganze Herz, die enthält einer Mischungaus von Myozyten und nicht Myozyten⁹, Cardiomyocyte Kulturen sind hochrein, mit minimalen Kontamination von nicht-Myozyten aus dem Herzen, wie z. B. Fibroblasten und Endothelzellen¹⁰. Darüber hinaus ermöglicht isolieren Herzzellen von neugeborenen Welpen züchten eine große Anzahl von Zellen in einer kleinen Menge der Zeit, im Vergleich zu isolierenden Zellen von Erwachsenen Herzen^10,11. Vor allem primäre kultivierten erwachsenen Maus Herzzellen haben kurze überleben Zeiten (z.B. 24 h) und auf längere Zeit de-Punkte unterscheiden. Neugeborenen Maus Herzzellen können überleben und für mehr als 7 Tage in der Kultur, wodurch sie ideal für die Prüfung der Auswirkungen der Wirkstoffe und Genmanipulation auf die Funktion der Mitochondrien in Kardiomyozyten¹⁰manipuliert werden. Natürlich gibt es biologische Unterschiede zwischen den Erwachsenen und Neugeborenen Zellen, aber die längere Dauer, die für Kultur neonatale Zellen macht sie geeignet für viele verschiedene Arten von Studien, einschließlich der Funktion der Mitochondrien.

Bisher wurden primäre kultivierte Neugeborene Maus und Ratte Kardiomyozyten als Modelle zur kardialen Bioenergetik^12,13zu studieren. In den letzten Jahren verwendet Studien einen extrazelluläre Flux-Analysator Sauerstoff-Verbrauch (OCR) messen und auswerten oxidative Kapazität bei Maus und Ratte neonatale Kardiomyozyten^14,15. Während mit Ratten verglichen, die Zellviabilität des Neugeborenen Maus Herzzellen ist niedriger und hat größere Variabilität¹⁶. Außerdem macht die Fähigkeit, Zellen aus gentechnisch veränderter Mausmodelle im Mausmodell Zelle sehr wichtig. Da die OCR-Studien so empfindlich auf Zell-Zahl und Dichte Aussaat sind, braucht man Entwicklung eines reproduzierbaren, zuverlässig und einfach Protokolls, konsequente Zellausbeute und Rentabilität zu erzielen.

Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das entwickelt worden ist die kultivierte Maus neonatale Herzzellen zusammen mit einem 96-Well-Format extrazelluläre Flux-Analysator für OCR-Analyse verwendet. Dieses Protokoll wird die Reproduzierbarkeit des Assays stark erhöht. Darüber hinaus das Protokoll nicht nur bietet eine neuartige und reproduzierbare Methode für OCR-Analyse, sondern könnte auch zu einer größeren Größe Kultur für andere experimentelle Zwecke, wie die möglicherweise notwendigen myofibrillären Funktionen zu studieren und intrazellulären angepasst werden Signalwege.

Dieses Protokoll beschreibt insbesondere eine eintägige Verfahren zur Isolierung und Kultur des Neugeborenen Maus Herzzellen in eine 96-Well Zellplatte Kultur. Darüber hinaus beschreibt es die Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Verbrauch mit einem extrazellulären Flux-Analyzer. Alle Lösungen sind steril oder steril filtriert. Alle Werkzeuge werden mit 75 % igem Ethanol sterilisiert. Wir bieten eine Tabelle von Materialien für verschiedene Teile des Verfahrens. Für die Kultivierung von Kardiomyozyten, erfolgen alle Abläufe und Schritte in eine Standardzelle Kultur Kapuze. Dieses Protokoll ist für die Isolierung von Neugeborenen Mäuseherzen aus einem Wurf (ca. 8-10 Welpen) entwickelt. Das Protokoll kann jedoch auch zur Isolierung von Herzzellen aus mehreren Würfen angepasst.

Protokoll

Für die Arbeit mit Neugeborenen Mäusen Bitte verweisen auf lokale Hochschulinstitut Leitlinien Satz her durch die Pflege der Tiere-Programme und die institutionellen und anderen einschlägigen Bestimmungen einhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von der UC San Diego institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften einhalten.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. 25 mL Pre Aufschlusslösungvorbereiten: HBSS (ohne Ca^{2 +} und Mg^{2 +}) ergänzt mit Trypsin (0,5 mg/mL). Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Stellen Sie vor Aufschlusslösung am Tag des Experiments.
   Hinweis: Es ist wichtig, HBSS ohne Ca^{2 +} zu verwenden und Mg^{2 +}, als Ca^{2 +} und Mg^{2 +} bewirkt Myozyten Kontraktion und anschließende Zelltod während der Isolation.
2. 30 mL Kollagenase Verdauung Puffervorzubereiten: Kollagenase (0,8 mg/mL, ca. 350 U/mL) in HBSS (ohne Ca^{2 +} und Mg^{2 +}) Puffer gelöst. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Kollagenase Aufschlusslösung am Tag des Experiments zu machen.
3. 500 mL Cardiomyocyte Nährmedien (Wachstumsmedien)vorbereiten: 375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL Pferd Serum und 12,5 mL FBS vermischen. Ergänzen Sie mit 1 % Penicillin und Streptomycin 1 % ige Lösung.
4. Mitochondriale Stresstest Mediumvorbereiten: machen 200 mL DMEM basierte Stresstest Medium (DMEM ohne Nahco3₃, siehe Tabelle der Materialien) mit 1 mM Natrium Pyruvat, L-Glutamin, 2 mM und 10 mM Glukose und 2 mM Hepes ergänzt.
   Hinweis: 1 L des Mediums mit DMEM ohne Natrium Pyruvat, L-Glutamin, Glukose und Hepes, Filer steril, erstellen und speichern bei 4 ° C. Bereiten Sie das Stresstest-Medium am Tag des Tests durch das Hinzufügen von anderen Reagenzien. Mit DMEM ist Medium ohne Nahco3₃ kritisch.
5. PH-Wert des mitochondrialen Stresstest Medien auf 7,4 am Tag der Nutzung anpassen. Warmen Medien auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
6. Oligomycinvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
7. FCCPvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
8. Antimycin Avorzubereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
9. Rotenonvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
   Hinweis: Alle Reagenzien und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendeten sind in Tabelle 1aufgeführt.

(2) Ernte- und Pre-Verdauung von Herzen von neugeborenen Mäusen (Tag 1)

1. Autoklaven-Schere, Pinzette und Moria Löffel zu sterilisieren.
2. Führen Sie alle Schritte in der Zelle-Kultur-Haube für Sterilität.
3. Aliquoten 5 mL HBSS (ohne Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) in jede Vertiefung eine 6-Well Zellplatte Kultur; auf Eis legen. Aliquoten 10 mL HBSS in einer Kulturschale 10 cm Zelle.
4. 20 mL Trypsin Pre Aufschlusslösung in einem 50 mL sterile konische Rohr vorzubereiten. Halten Sie alle Lösungen auf Eis.
5. Tauchen Sie schnell Neugeborenen (Tag 0) Mäuse in 70 % Ethanol-Lösung für die Sterilisation.
6. Welpen mit steriler Schere (gerade) ohne Narkose zu enthaupten, und Brust entlang dem Brustbein Zugriff auf der Brusthöhle und das Herz öffnen. (Abbildung 1A)
   Hinweis: 1) ist es wichtig, P0 neugeborene Mäusen zu verwenden, um hohe Zellenentwicklungsfähigkeit zu erreichen. (2) dieses Euthanasie-Verfahren ist für Neugeborene nach NIH und der American Veterinary Medical Association Leitlinien ¹⁷zulässig.
7. Herz aus dem Körper zu extrahieren, mit einer feinen Schere und Transfer sofort in der sterilen Zelle Kulturschale mit HBSS (ohne Ca^{2 +}, Mg^{2 +}) (Abbildung 1 b).
8. Entfernen Sie alle verbleibenden Lungengewebe, größere Schiffe, etc. (und Atrien, falls gewünscht). Waschen Sie Herzen in die HBSS-Lösung mit sanfter Bewegung.
9. Schneiden Sie jedes Herz mit einer feinen Schere in 8 Stücke und übertragen Sie alle Herzgewebe mit der Pinzette in einen Brunnen von einer 6-Well Kultur Zellplatte mit HBSS (Abbildung 1 und 1 D).
10. Waschen Sie die Herzen durch die Übertragung der Herzen von Brunnen zu Brunnen in der 6-Well-Platte voller HBSS, mit einem Löffel Moria (Abbildung 1).
    Hinweis: Übertragen die Herzen von Brunnen zu Brunnen, ist genug, um das Blut zu waschen. Da Blut enzymatische Verdauung stört ist es wichtig, die Herzen mit HBSS waschen und Blut zu entfernen.
11. Übertragen Sie die Herzen mit einem Löffel Moria in einer konischen Röhrchen mit 20 mL Trypsin (0,5 mg/mL) und inkubieren Sie mit sanften Agitation bei 4° C für 4 h (Abbildung 1E).

3. bereiten Sie eine Kultur 96-Well-Platte (Tag 1)

1. 5 mL der Beschichtungslösung vorbereiten: PBS mit 0,5 % Gelatine (Autoklav vor Gebrauch) und 1 % Fibronektin Lösung. (z.B. 5 mL Gelatine-Lösung plus 50 µL Fibronektin-Lösung)
2. Aliquoten 50 µL der Beschichtungslösung in jede Vertiefung der 96-Well Zellplatte Kultur (siehe Tabelle der Materialien). Wenn Bläschen vorhanden sind, entfernen Sie sie mithilfe einer Pipette 20 µL Luftblasen heraus zu saugen.
   Hinweis: Es ist wichtig, die Oberfläche von jedem Bohrloch mit Beschichtungslösung decken.
3. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für 1 h oder mehr, um die Matrix-Beschichtung trocknen lassen.
4. Aspirieren Sie jede verbleibende Beschichtungslösung vor der Aussaat Kardiomyozyten.

(4) enzymatische Verdauung und Beschichtung von Zellen (Tag 1)

1. Wärmen Sie Kollagenase Aufschlusslösung im Wasserbad 37 ° C vor.
   Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig für effiziente enzymatische Verdauung zu erreichen ist.
2. Das konische Rohr mit Herzen und Pre Aufschlusslösung von 4 ° C zu einer Zelle Kultur Haube zu bewegen. (Abb. 1F)
3. Lassen Sie die Herzen auf den Boden des Rohres sinken und entfernen Sie die Pre-Verdauung-Lösung mithilfe einer serologischen 10 mL-Pipette (1 bis 2 mL des Mediums Isolierung verbleiben in der Röhre).
4. Fügen Sie 10 mL HBSS in die Röhre. Wieder aussetzen die Herzen mit HBSS 2-3 Mal mit einer serologischen Pipette 10 mL Trypsin zu waschen. Aspirieren HBSS (1 bis 2 mL verbleiben in der Röhre).
5. Fügen Sie 10 mL vorgewärmten Kollagenase Aufschlusslösung in das Rohr mit Herzen. (Abbildung 1)
6. Inkubieren Sie das Rohr mit Herzen im Wasserbad 37 ° C für 10 min ohne Agitation (1. Verdauung).
7. Verschieben Sie nach 1. Verdauung das Rohr in der Zelle-Kultur-Haube. Sanft genannte Herzen wieder aussetzen die Herzen in das Rohr sanft 10 Mal mit einer serologischen 10 mL-Pipette. Dadurch werden Herzen zu zerstreuen und Zellen von Herzgewebe freigegeben werden. (Abbildung 1 H)
   Hinweis: Da Kardiomyozyten sehr empfindlich sind, ist sanft Verreibung wichtig, hohe Rentabilität zu erreichen.
8. Lassen Sie das unverdaute Gewebe sinken, verdaute Lösung angereichert in Herzmuskelzellen (ca. 9-10 mL), eine neue konische Rohr übertragen und sofort hinzufügen einer gleichen Menge von Zellkulturmedien, Kollagenase Verdauung zu stoppen.
9. Hinzugeben Sie 10 mL Kollagenase Aufschlusslösung in das Rohr mit den restlichen unverdauten Herzgewebe.
10. Das Rohr mit Herzgewebe im Wasserbad 37 ° C für 10 min inkubieren (2. Verdauung).
11. Wiederholen Sie die Prozedur 4.7 und 4.8.
    Hinweis: Wiederholen Sie es gibt noch viel unverdautes Gewebe, Verdauung noch einmal. In den meisten Fällen sind jedoch zwei Verdauung genug, um die meisten Zellen von Herzgewebe zu zerstreuen.
12. Legen Sie eine sterile Zelle-Sieb (100 µm-Nylon-Mesh) in eine neue sterile 50 mL konische Rohr. Vornässen der Zelle Sieb mit ca. 2-3 mL Zellkulturmedien und Zellen durch die Zelle-Sieb passieren. Spülen Sie die Zelle-Sieb mit ca. 2-3 mL Zellkulturmedien. (Abbildung 1I)
13. Zentrifugieren Sie konischem Rohr mit Kardiomyozyten für 5 min bei 180 X g (Abbildung 1J). Abzusaugen Sie den überstand (Abbildung 1 K), die Zelle Gewebe Ablagerungen enthalten und wieder aussetzen der Zelle Pellet in 10 mL von Zellkulturmedien (Abbildung 1 L).
14. Sanft Aufschwemmen der Zellen und Platte auf einer 10 cm Zelle Kulturschale (Kunststoff ohne jede Art von Beschichtung) und inkubieren Sie für 1 Stunde in eine Zelle Kultur Inkubator (1. Pre-Plating) (Abbildung 1 M). Pre-Beschichtung können nicht-Kardiomyozyten, wie Fibroblasten und Endothelzellen, zur Einhaltung der unbeschichteten Zellkultur-Schale.
    Hinweis: An dieser Stelle Kardiomyozyten sind in der Regel eine Runde Form und glänzend unter dem Mikroskop erscheinen. (Abbildung 1N).
15. Nach 1 h Inkubation sanft schütteln Sie die Platte, waschen Sie nicht anhaftende Zellen (angereichert in Herzmuskelzellen) aus der Kulturschale 10 cm und wieder auszusetzen Sie Zellen durch wiederholt das Zellkulturmedium über das Gericht mit einer serologischen 10 mL-Pipette pipettieren. Dann übertragen Sie nicht anhaftende Zellen (angereichert in Herzmuskelzellen) in eine neue Zelle Kulturschale 10 cm (Kunststoff ohne jede Beschichtung) und inkubieren Sie für weitere 1 h in einer Zelle Kultur Inkubator (2. Pre-Beschichtung).
    Hinweis: Zellen, mit denen die nicht beschichteten Platte befestigt sind überwiegend nicht Kardiomyozyten: Fibroblasten und Endothelzellen, die unter dem Mikroskop (Abbildung 1O) visualisiert werden können.
16. Nach 2. Pre-Beschichtung, sanft schütteln Sie die Platte, waschen Sie nicht anhaftende Zellen (Herzmuskelzellen) von 10 cm-Kulturschale, dann übertragen Sie die Herzzellen in ein neues 50 mL konische Röhrchen.

5. zählen Zellen und Beschichtung in einer 96-Well Zellplatte Kultur (Tag 1)

1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
2. Die Zellen in einer extrazellulären Matrix beschichtet 96-Well Kultur Zellplatte bei einer Dichte zwischen 10-30 x 10³ Zellen/Brunnen mit einer Multi-Kanal-Pipette in einem Endvolumen von 200 µL (Abbildung 1 P) Platte. Verwenden Sie Brunnen A1, A12, H1 und H12 für Hintergrund: 200 µL Kulturmedium als andere Brunnen in diese Vertiefungen (keine Zellen) hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator.
   Hinweis: In dieser Studie wurde Sauerstoffverbrauch mittels unterschiedlichen Zelldichten z. B. 10 x 10³, 20 x 10³oder 30 x 10³ Zellen/gut getestet. (Abbildung 2A). Auch, wie oben beschrieben, Herzmuskelzellen sofort nach Isolierung sind in der Regel eine Runde Form und glänzend unter dem Mikroskop erscheinen. Entwicklungsfähigen Zellen werden innerhalb von 16-24 h Kultur abflachen.

6. Sauerstoff-Verbrauch-Assay mit einer 96-Well-Format extrazelluläre Flux Analyzer (Tag2)

Hinweis: Sauerstoff-Verbrauch-Assay kann einen Tag nach der galvanischen Zellen durchgeführt werden oder später. Neonatale Kardiomyozyten kultiviert unter Verwendung dieses Protokolls bis zu 7 Tage überleben kann, post isoliert.

1. Ein Flussmittel Analyzer Sensorkassette-Hydrat (siehe Tabelle der Materialien) für mindestens 3 Stunden, aber ideal für einen ganzen Tag vor dem Test. Fügen Sie 200 µL der Kalibrator Lösung (siehe Tabelle der Materialien) in den einzelnen Brunnen der Dienstprogramm-Platte wieder auf den Teller Dienstprogramm der Sensorkassette und brüten in einem 37 ° C Inkubator ohne CO₂ oder O₂ Ergänzung.
2. Ändern Sie Zellkulturmedien in Mitochondrien Stresstest Medium eine Stunde vor dem Test. Herzmuskelzellen sind zerbrechlich. Daher vorsichtig entfernen Sie den Zellkulturmedien mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette und waschen Sie die Zellen mit 200 µL vorgewärmten mitochondriale Stresstest Medien zweimal. Nach dem zweiten waschen fügen 175 µL vorgewärmten Mitochondrien Stresstest Medien und Kultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator ohne CO₂ oder O₂ Ergänzung.
3. Konzentrierte Testverbindungen vorzubereiten. Mitochondrien-Stress-Test Vorbereitung 3,0 mL 16 µM Oligomycin, 9 µM FCCP und einer Mischung aus 20 µM Rotenon und 20 µM Antimycin A, alle im mitochondrialen Stresstest Medium.
   Hinweis: Jede Verbindung in der Konzentration beschrieben wurde getestet. Allerdings ist es notwendig, die Konzentration von jeder Verbindung im eigenen Labor titrieren.
4. Laden Sie 25 µL jeder Verbindung in den Injektor Häfen der Sensorkassette mit einer Mehrkanal-Pipette (Abbildung 1Q). Das Volumen und die Endkonzentration sind in Tabelle 2beschrieben.
5. Extrazelluläre Flux-Assay-Protokoll eingerichtet. Das Programm wird in beschrieben Tabelle 3.
6. Starten Sie das Programm. Legen Sie zuerst die Sensorkassette in die Maschine für die Kalibrierung (Abbildung 1R). Der Kalibrator für die Test-Platte zu ersetzen, sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist.
   Hinweis: Mit der vom Hersteller mitgelieferten Software, geben Sie Gruppen von Brunnen und jede Verbindung und Port.
7. Falls gewünscht, nach der Probe verwerfen Sie sorgfältig alle Assay Medium mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette und speichern Sie die Zelle Kultur Mikrotestplatte bei-20 ° C für zukünftige Zelle Normalisierung mit Protein Assay.
8. Protein-Inhalt zu messen. Fügen Sie 50 µL RIPA Zelle Lysis Standardlösung (siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie die Platte auf dem Eis für 30 min, voll Zellen lysiert. Übertragen Sie sämtliches Material auf eine neue klare Flachboden 96 gut Assay Platte.
9. Messen Sie Proteinkonzentration von BCA-Test nach Hersteller Protokoll.
   Hinweis: Beschichtung des Brunnens mit extrazellulären Matrix führt zu einer hohen Proteinkonzentration in jede Vertiefung. Daher den Betrag der Hintergrund betreffendes (keine Zellen) tatsächliche Zelle Proteinkonzentration zu subtrahieren. Die Konzentration des Proteins abgeleitet von Zellen ist gering, in einer Kultur der 96-Well-Platte. Darüber hinaus variiert Proteinkonzentration von Brunnen zu Brunnen durch extrazelluläre Matrix Beschichtung. Daher empfiehlt sich mit Handynummer, um die OCR zu normalisieren.

Ergebnisse

Mithilfe des Protokolls beschrieben, waren die Herzen von Tag 0 neugeborenen Welpen isoliert. 5 x 10⁵ Zellen/Pup stammen, und Herzmuskelzellen bei dichten von 10 x 10³, 20 x 10³oder 30 x 10³ Zellen/Brunnen, in 96-well-Platten (Abbildung 2A) ausgesät wurden. Nach Übernachtung Kultur fanden sich Kardiomyozyten Kunststoff beschichteten Oberfläche gut an und es gab sehr wenige ungebundene Zellen (ungebunden Zellen we...

Diskussion

In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Kultivierung Maus neonatale Kardiomyozyten etabliert. Durch die Verwendung dieser Kardiomyozyten, haben wir auch die Voraussetzungen für die Sauerstoff-Verbrauch messen mit einem extrazellulären Flussmittel Analyzer System optimiert. Das Protokoll erlaubt verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch in den wichtigsten arbeitenden Zellen des Herzens, vergleichbar mit, wa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antimycin A	SIGMA	A8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores	FALCON	352360	To capture undigested tissue
Collagenase type II	Worthington	LS004176	To make collagenase digestion solution
D-Glucose	SIGMA	75351	To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose	Life technologies	11965-092	To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes	SIGMA	D5030-10X1L	To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	SIGMA	C2920	Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies	26140-079	To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma	SIGMA	F1141-5MG	To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors	Fine Sciences Tools	14060-10	For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin	SIGMA	G-1890	To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+)	Cellgro	21-022-CV	To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum	Life technologies	26050-088	To make cell culture medium
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	To make mitochodnrial stress test medium
M-199	Cellgro	10-060-CV	To make cell culture medium
Moria spoon	Fisher scientific	NC9190356	To wash hearts
Oligomycin	SIGMA	75351-5MG	Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer	Fisher scientific	89900	To lyse the cells for protein assay
Rotenone	SIGMA	R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Agilent		Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors	Fine Sciences Tools	91401-12	For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size			For sterile filtration of digestion medium
Trypsin	USB Corporation	22715 25GM	To make pre-digestion solution