小鼠脑脊髓子宫转导后超微结构神经可塑性参数的评价

摘要

透射电子显微镜和子宫转导的结合是研究神经系统发育过程中精细超微结构形态变化的有力方法。这种组合方法可以深入了解神经可塑性相对于其地形表现的结构细节的变化。

摘要

本研究结合子宫转导和透射电子显微镜 (tem), 旨在精确地对地形结构中的超微结构参数进行形态测量分析, 这是受感兴趣的蛋白质影响的通过病毒转移引入生物体。这种组合方法允许从宏观结构到超微结构识别的顺利过渡, 通过遵循组织地图集中的地形导航地图。子宫内转染组织的高分辨率电子显微镜揭示了神经 pil 的精细超微结构及其可塑性参数, 如横截面突触 bouton 区、内突触囊和线粒体的数量。bouton 剖面、突触线长度、横截面轴突区、髓鞘厚度、髓鞘层数和线粒体剖面横截面区。对这些参数的分析揭示了对神经系统区域超微结构可塑性变化的重要洞察, 这些变化受到基因结构病毒转移的影响。这种组合方法不仅可以用来研究基因工程生物分子和药物对神经元可塑性的直接影响, 而且还为研究子宫内神经元可塑性的抢救提供了可能性 (例如, 在神经退行性疾病)。

引言

任何光子都不能穿透电子深度等级的超薄组织标本。与光学显微镜技术相比, 这在捕获精细结构的纳米分辨率图像方面具有宝贵的优势。例如, tem 允许细胞内细胞器的可视化, 如线粒体、黑色素体和各种类型的分泌颗粒、微管、微丝、纤毛、微绒毛和细胞间连接 (细胞表面)(专业), 特别是突触在神经系统^1,2,3,4。本方法研究的总体目标是结合子宫内的最先进技术, 对产前干预后发育过程中神经可塑性变化的超微结构识别。病毒编码的感兴趣的蛋白质在子宫中被转化为中枢神经系统^{5,6,7, 包括}脊髓⁶。例如, 在子宫转导联合 tem 已被用来研究细胞粘附分子 l1 对 l1 缺乏小鼠运动学习可塑性的影响, 特别是在 l1 和核受体蛋白之间的相互作用在小脑神经元⁷。

神经可塑性参数的分析需要关于神经系统中最小区域定位的精确信息。因此, 它是足够的描述超微结构细节和他们的确切地形方向相对于其他结构。在本研究中, 提出了一种基于光镜和电子显微镜的具体准备方法, 旨在对不同的形态区域进行详细的研究。这种方法结合了组织操作的几种技术, 从小鼠大脑和脊髓的子宫转导开始, 然后是灌注固定, 霉菌包埋, 并处理组织的 tem。在透射电镜组织的嵌入和处理之间的一个重要步骤是组织的记录, 使用干涉光反射技术, 允许精确的微照片和低放大倍率的记录组织标本^8,9,10。在目前的方法中, 这项技术使研究人员能够在准备 tem 之前检查神经组织表面和标本切片剖面的地形和结构细节。

一个特殊的框架, 用于分割整个大脑对应于立体定向坐标。该框架有利于神经组织中区域的形态三维重建, 可用于形态分析。可视化剖面的宏观图被指定为地形坐标, 按顺序编号的部分在组织地图集中生成地图。

根据上述组织地图集的地图, 在树脂处理后, 将嵌入组织切割成含有选定区域的超薄切片 (& lt;70 nm)。超薄切片采用透射电镜, 以获得其内容物的可塑性参数 (例如突触波或轴突纤维的横截面剖面区域) 的高分辨率图像, 以及与复合物内相邻结构的接触的图像神经皮。

通过本文所述的方法, 从可视化宏观结构到微观和纳米结构的平稳过渡, 使发育中神经的子宫传导后的形态神经元可塑性进行比较深入的研究系统。

研究方案

关于动物问题的所有程序都得到了德国联邦各州汉堡和北莱茵-韦斯特法伦的动物伦理机构委员会的批准。 在整个外科过程中使用无菌仪器、防护手套和无菌外套。

1. 子宫传导

1. 在 ph 值7.4 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中, 为所需的靶标 (4 x^{10 11 病毒}凝集物μμμl) 准备与腺病毒相关的 1 (aav1) 编码。加入 0.1 mgμμl 快速绿色, 并将 aav1-fast-绿色混合物保持在37°c。
2. 使用微移液器拉拔器 (设置: 压力 = 500, 加热 = 700, 拉 = 0, 速度 = 80, 时间 = 200, 见材料表 < >).打破毛细管的尖端, 使其4-5 毫米。
3. 将吸气管 (44 厘米 x 0.7 厘米) 与毛细管尖端组装, 并将 aav1-fast-green 混合物的15μl 抽入毛细管。
4. 在整个过程中, 将动物主体保持在37°c 的恒定生理体温下。
5. 将怀孕的 C57Bl/6 小鼠 (胚胎日 14.5) 放入预培养室, 用气态4% 异氟醚麻醉小鼠 (体积气流率为 0.6-0.8 lmmin)。
6. 皮下, 注射丁丙诺非 (体重 0.1 mg kg)。
7. 将麻醉鼠标放在预热的手术板 (37°c) 上。
8. 用润滑剂捂住眼睛。
9. 将小鼠安装在手术板上的麻醉面罩 (气态1.5% 异氟醚, 体积气流速率为 0.6-0.8 lmmin), 并剃须腹部皮肤区域。用 3x 75% 乙醇擦拭剃须区域, 然后用 betadine 溶液擦拭。
   请注意:持续监测麻醉小鼠的呼吸行为。根据小鼠的吸入-呼气模式, 调整异氟烷气体的浓度。
10. 通过挤压鼠标后爪指骨, 检查是否没有足底反射。
11. 用弯曲的锯齿虹膜钳 (10 厘米) 抓住皮肤, 用直的硬质合金剪刀 (10 厘米) 沿着内侧切割皮肤, 然后用直的 dumont 夹住腹膜壁 (12 厘米, 0.2 mm), 打开腹腔x 0.12 毫米), 用直接的万纳剪刀 (8 厘米) 沿着 linea alba 切割墙。
12. 将一块被弄碎的石蜡膜放在腹部开口上, 并用微蚊止血钳 (12.5 厘米, 弯曲) 将膜固定在两端。
13. 用类似勺子的装置暴露子宫角, 以避免对子宫角内的胚胎造成损害。在子宫角上滴几滴 pbs (37°c), 检查胚胎是否在子宫囊内受损或畸形。
14. 记录子宫角中胚胎的顺序和位置。小心地将胚胎在子宫囊内, 直到达到注射所需的位置。
15. 通过目视检查注射部位 (如脑室) 和立体显微镜下的染料渗透, 注入 aav1-fast-绿色混合物1-2 μl。
16. 记录注入的胚胎, 并将子宫角与注入的胚胎放回腹腔。
17. 滴几滴 pbs (37°c) 进入腹腔。使用 halsted 的蚊虫止血钳 (12.5 厘米, 弯曲), 通过缝合腹膜壁 (使用6-0 大小的聚酰胺缝线) 和皮肤 (使用3至0大小的聚酰胺缝线) 来关闭腔。或者, 使用一个简单的中断模式或不锈钢钉关闭腹腔和皮肤。

2. 孤立组织的远程摄影

1. 缓冲区的准备
   1. 在 200 rpm 搅拌下, 将 14.95 g 的 na 2 hpo 4 和 kh 2 po 4 的 kh₂po 4 溶解在 1升的蒸馏水中, 制备sörensen的缓冲液 (1 l).对于晚期妊娠幼崽和/或幼崽在产后期间的灌注, 使用适当大小的针头进行腹部或胃内注射, 并确保晚期戊巴比妥钠麻醉的浓度不超过 180 mg/2公斤的体重。
   2. 通过将500 毫升的蒸馏水加热到 75°c, 并在 200 rpm 下搅拌添加50克的对甲醛粉末, 加入200μl 的 5 n naoh, 添加 1, 500 毫升 sörensen 的缓冲液, 1, 750 毫升的蒸馏水, 制备 mmgnaini 的固定溶液, 和500毫升的25% 戊二醛。用蒸馏水填充高达 5, 000 毫升。使用此最终缓冲区进行灌注。
      注: 准备 m发奈尼的固定解决方案下的引擎盖, 戴防护眼镜, 并避免烟雾。加入亚甲蓝 (0.05 g/l), 以更好地显示灌注。
2. 小鼠灌注和组织隔离
   1. 根据标准程序 6, 7, 对携带经体胚胎的怀孕小鼠 (在胚胎研究的情况下) 或在所需年龄 (如产后第24^天) 出生的经体的酒吧^进行心血管完美的护理, ^{11,12,13,14, 15,16},^{17, 使用}腹腔内端翼性戊巴比妥钠麻醉 (200 mg/公斤体重)。
   2. 用 26 g, 1 针将肝素溶液 (500 u) 注入小鼠经心脏, 在固定前, 将小鼠经心脏注射10毫升的 pbs, 以冲洗体内的血液, 并在心脏上使用30ml 的40°c 预热 mL mugaini 的 pbs, 然后将它们与心脏混合在一起, 用30摄氏度预热的 mL nmagnini。固定的解决方案。
      请注意:对于成年小鼠, 通过腹主动脉14进行另一种逆行灌注.
   3. 在4°c 下, 将感兴趣的灌注组织 (如整个大脑或脊髓) 分离, 并将其固定在至少10毫升的 mmgl mmgl 的 mmgnaini 固定溶液中, 再延长24小时。
   4. 在室温下将组织在 pbs 的10毫升中清洗3小时。
3. 嵌入琼脂糖, 加上文档和切片
   1. 在具有可重现的切片角度 8^、9、10的特殊框架中调整隔离组织 (例如, 整个大脑)。或者, 使用可调节切割厚度的振动体。
   2. 将神经组织放置在框架中, 调整组织进行远程成像, 并记录坐标。
   3. 制备3% 低熔融琼脂包埋介质: 在 sörensen 缓冲液100毫升中加入3克琼脂糖, 并将混合物加热到90°c。
   4. 将3% 琼脂糖 (30°c) 倒在含有组织的框架中。用一个温暖的金属块覆盖框架, 并等待, 直到它被硬化。在硬化过程中, 使用遥测设备对嵌入的组织及其在框架内的坐标进行成像。
   5. 将琼脂嵌入的组织转移到与第一帧坐标相对应的切割间隙的框架中。
   6. 使用带有薄而振动剃须刀片的装置将嵌入的组织切割成所需厚度的部分 (例如 1.5 mm) (见材料表)。
      请注意:为了改善剃须刀片的滑翔, 在嵌入的组织上滴下几滴甘油。
   7. 将 pbs 中的每个组织部分映像, 并将图像收集到一个文件夹中。

3. 透射电子显微镜分离组织的制备

请注意:在引擎盖下的晃动平台上, 用紧闭的盖子在玻璃盘子里进行所有进一步的孵化步骤。

1. 在 pbs 中清洗组织切片2x30 分钟。在室温下将其培养在2% 的四氧化铬水溶液 (osmium₄) 中2小时。
   注意事项:四氧化二酸是有毒的, 在接触皮肤时可能是有害的。
2. 在 pbs 中清洗渗透段2x30 分钟。
3. 在室温下将切片孵育30%、50% 和70% 乙醇 10-15 (可选: 在4°c 下隔夜孵育70% 乙醇)。
4. 在 led rgb 灯^8、9、10 (2x 15 w) 下, 将渗透样品以70% 乙醇成像, 从左侧和右侧以45°的角度应用于样品。使用黑色菜肴和沉闷的黑色背景, 以最大限度地减少散射和照明过程中光线的反射。
   注意事项:在成像过程中, 不要让部分干涸。
5. 通过在文件夹中收集系列图像, 创建带有坐标的截面图像的地图集。
6. 在室温下用100% 乙醇 (2倍 30分钟) 和100% 环氧丙烷 (2倍 30分钟) 对样品进行培养。
   注意事项:在改变解决方案的同时, 不要让部分干涸。
7. 将260毫升的树脂与240毫升的十二烷基琥珀酸酐混合在玻璃容器中, 同时用玻璃棒轻轻搅拌。定期检查不均匀性、气泡和涂片。轻轻搅拌, 用手搅拌至少45分钟。
8. 以1:2 和1:2 的比例制备环氧丙烷, 并添加3% 的促进剂 (2, 4, 6-tris (二甲基氨基甲基) 苯酚)。
9. 在旋转轮的室温下, 从步骤3.8 开始, 将1:2 嵌入溶液中的组织从步骤3.8 中培养 2小时, 然后在1:1 嵌入溶液中, 在室温下培养2小时。
10. 将组织放置在扁平聚丙烯盘子中, 用含有3% 加速器的新鲜树脂覆盖组织, 并在65-85°c 下固化12至24小时的嵌入组织。
11. 将嵌入的组织冷却至室温, 并从聚丙烯盘中取出树脂嵌入的标本。

4. 用于定量分析的超微结构神经可塑性参数的选择

1. 绘制感兴趣的区域
   1. 选择感兴趣的区域 (例如, 海马或小脑), 并通过从包含该区域的地图集 (步骤 3.5) 中选择图像来定位剖面图集中的区域。
   2. 将感兴趣区域的边界绘制到截面图像上, 并将这些区域边界叠加到树脂样品上。
   3. 用细针表 (26 g, 1 英寸) 在树脂标本上标记感兴趣区域的边框 (例如海马或小脑)。
   4. 将树脂试样在烤箱中加热至 85°c, 以软化树脂进行修剪, 或者使用修剪装置、薄刀片或砂纸。
   5. 用剃须刀片处理树脂样品感兴趣的区域 (见材料表)。用胶水将试样安装在所需口径的丙烯酸玻璃的固定杆上 (例如, 直径为8毫米, 长度为1厘米)。修剪安装的样品进行半和超薄切片。
   6. 使用超微体准备修剪区域的半薄 (0.75μm) 和超薄 (70 nm) 部分: 将其设置为 1.5 mm; 厚度为 0.75μm, 以 0.7 mm 为 70 nm 厚度。
   7. 收集玻璃载体上的半薄部分, 并在 pbs 中染色1% 甲苯胺蓝色的部分 (4分钟)。
   8. 用去离子水清洗几次。使用 4倍 (na 为 0.1-)、10倍 (na 为 0.22/0.22)、40x (na 为 0.22/0.22) 和 100x (1.25/0.22 的 na) 目标检查光显微镜下的染色部分。
   9. 收集镍网的超薄切片。将栅格以 180 kv 和 3, 200x、6, 000 x 或 8, 000 x 放大倍率进行 tem。
2. 透射电镜分析
   1. 选择用于定量 tem 分析的超微结构参数 (例如, 带囊泡和线粒体或髓鞘和非髓鞘轴突的 boutons), 并在 3, 500x、6, 000 x 和 8, 000x 放大倍率下拍摄这些参数的 tem 图像。

结果

为了对小鼠进行可靠、快速的麻醉, 考虑了许多安全参数, 并且麻醉单元的优化工作空间被证明是足够的 (图 1a)。该装置旨在精确控制液体异氟烷和环境空气的混合物, 并对小动物 (如小鼠和大鼠) 进行成功的手术。空气和异氟醚根据所需的设置混合在蒸发器中, 并通过面罩或通过面罩传送到动物体内 (图 1a

讨论

在子宫转导的一个关键的步骤是注射程序。精确注射到脑室或其他感兴趣的领域需要经验和动手技巧。微毛细管尖端越薄, 可能发生的组织损伤越少;然而, 这是以增加注射压力为代价的。与子宫电穿孔^{19、20、21、22 相比}, 在子宫转导后注射胚胎的存活率非常高。所有子宫角的胚胎都可以注射, 即使胚胎?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol	Serva	36975
26 G x 1'' needle	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)	UKE (Viral Core Facility)	-	For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	low gelling agarose
Air Pump	Biomedical Instruments (Univentor)	Eheim 100
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium	Biomedical Instruments (Univentor)	-
buprenorphine	Temgesic	ampules	painkiller
capillaries	Science-Products	GB100TF-10	with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride	Fluka	44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)	FST	11203-23
electric shaver	Phillips	-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)	Ethicon	-	polyamide
eye lubricant	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)	FST	13011-12
Heparin-Natrium	Ratiopharm		25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)	FST	14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations	Biomedical Instruments (Univentor)	-
isoflurane (Attane)	JD medical		inhalation anesthesia
LED RGB lights	Cameo	CLQS15RGBW	LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E	Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller	Science-Products	P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)	FST	13010-12
Nickel grids, 200 mesh	Ted Pella	1GC200
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219
Propylene oxide	Fluka	82320
razor blades	Schick	87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)	Merial GmbH	-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Technovit 4004 two components glue	Kulzer
Telemacrodevice	Canon	-	Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97	Sutter Instruments	-
thin vibrating razor blade device	Krup	-	with Szabo thin blades
toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
Transmission electron microscope C20	Phillips	-	up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Ultracut E	Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Univentor Scavenger	Biomedical Instruments (Univentor)	8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)	FST	15009-08