Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

Resumen

La combinación de microscopía electrónica de transmisión y transducción de señales en el útero es un poderoso enfoque para estudiar los cambios morfológicos en la ultraestructura fina del sistema nervioso durante el desarrollo. Este método combinado permite penetraciones profundas en cambios en los detalles estructurales subyacentes de neuroplasticidad con respecto a su representación topográfica.

Resumen

El presente estudio combina la transducción en el útero con microscopía electrónica de transmisión (TEM) con el objetivo de un análisis preciso morfométricas de parámetros ultraestructurales en estructuras topográficas claramente identificados, afectados por una proteína de interés se introduce en el organismo vía transferencia viral. Este enfoque combinado permite una transición fluida de macroestructurales a identificación ultraestructural por mapas topográficos de la navegación en un atlas de tejido. Alta resolución microscopia electrónica del tejido en el útero-transduced revela la fina ultraestructura el neuropil y sus parámetros de plasticidad, tales como áreas de sección bouton sináptico, el número de vesículas sinápticas y mitocondrias dentro de un Perfil de Bouton, la longitud de los contactos sinápticos, sección áreas axonales, el grosor de las vainas de mielina, el número de laminillas del myelin y áreas de sección de perfiles de las mitocondrias. El análisis de estos parámetros revela conocimientos esenciales en los cambios de plasticidad ultraestructural en las áreas del sistema nervioso que se ven afectados por la transferencia viral de la construcción genética. Este método combinado no sólo se puede utilizar para estudiar el efecto directo de biomoléculas genéticamente o drogas en la plasticidad neuronal pero también abre la posibilidad para estudiar el rescate en el útero de la plasticidad neuronal (por ejemplo, en el contexto de enfermedades neurodegenerativas).

Introducción

Ningún fotón puede penetrar a una muestra de tejido ultrafino en el grado de profundidad de un electrón. Esto atribuye ventajas inestimables a TEM en la captura de imágenes de resolución nanométrica de estructuras finas en comparación con técnicas de microscopía de luz. Por ejemplo, permite la visualización de los organelos intracelulares como mitocondrias, melanosomas y varios tipos de gránulos secretores, microtúbulos, microfilamentos, cilios, microvellosidades y uniones intercelulares (superficie de la célula TEM especializaciones), en particular sinapsis en el sistema nervioso^1,2,3,4. El objetivo general del presente estudio metodológico es el reconocimiento ultraestructural de los cambios en la plasticidad neuronal durante el desarrollo sobre interferencia prenatal mediante la combinación de las técnicas de vanguardia de transducción en el útero y TEM. Virally codificadas proteínas de interés han sido transduced en el útero en el sistema nervioso central^5,6,7, incluyendo la médula espinal⁶. Por ejemplo, en el útero transducción en combinación con TEM se ha utilizado para estudiar el efecto de la molécula de adherencia de célula L1 motor aprendizaje plasticidad en ratones deficientes en L1, en particular con respecto a la interacción entre las proteínas del receptor nuclear y L1 en las neuronas cerebelosas⁷.

El análisis de parámetros de neuroplasticidad requiere información precisa sobre la localización de las zonas más pequeñas dentro del sistema nervioso. Por lo tanto, es adecuada describir detalles ultraestructurales y su orientación topográfica exacta con respecto a otras estructuras. En el presente estudio, se presenta un método preparatorio específico con el objetivo de la investigación detallada de áreas morfológicas distintas basadas en la luz y la microscopia electrónica. Este enfoque combina varias técnicas de manipulación del tejido, a partir de transducción en el útero de ratón cerebro y médula espinal y seguido por la fijación de la perfusión, incrustación de molde y procesamiento del tejido para TEM. Un paso esencial entre la fijación y el procesamiento del tejido para TEM es la documentación de los tejidos, utilizando la técnica de reflexión de la luz de interferencia que permite la documentación precisa microfotográficos y baja magnificación de muestras de tejido^8,9,10. Incorporado en el enfoque actual, esta técnica permite a los investigadores examinar detalles topográficos y estructurales de las superficies de tejido nervioso y de perfiles de segmento de muestra antes de su preparación para TEM.

Un marco especial para seccionar todo cerebro corresponde a las coordenadas estereotáxicas. Este marco de beneficios morfológica reconstrucción tridimensional (3D) de zonas en tejido nervioso y puede ser utilizado para el análisis morfométrico. Las macrographs de las visualizadas secciones se asignan a coordenadas topográficas, y las secciones en serie numeradas crear mapas en un atlas de tejido.

Después de procesamiento de la resina, se secciona el tejido embebido en secciones ultrafinas (< 70 nm) que contiene las áreas seleccionadas, según los mapas del atlas mencionado tejido. Las secciones ultrafinas son sometidas a TEM para obtención de imágenes de alta resolución de los parámetros (por ejemplo, áreas de sección transversal Perfil de botones sinápticos o axonales fibras) de la plasticidad de sus contenidos y de contactos a estructuras vecinas dentro del complejo neuropilo.

Con el método descrito en este documento, la transición de macroestructuras visualizado a micro - y nanoestructuras permite estudios comparativos detallados de la plasticidad neuronal morfológica después en el útero de transducción el desarrollo nervioso sistema.

Protocolo

Todos los procedimientos sobre temas animales han sido aprobados por los comités institucionales de ética animal de los Estados federales de Hamburgo y Nordrhein-Westfalen, Alemania.  Utilizar instrumentos estériles, guantes y abrigos asépticas a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico.

1. en la transducción de útero

1. Preparar virus adeno-asociado tipo 1 (AAV1) codificación para el destino deseado (4 x 10¹¹ viral partículas/μl de AAV1) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4. Añadir 0,1 mg/μl verde Fast Green y mantener la mezcla AAV1-Fast-Green a 37 ° C.
2. Preparar una punta capilar fina con la forma deseada (8 mm de largo, con un diámetro externo de 80 μm y un interior diámetro de 50 μm), usando un extractor de micropipeta (configuración: presión = 500, calor = 700, tire = 0, velocidad = 80, tiempo = 200, vea el tabla de materiales < / c1 >). Romper la punta del tubo capilar para que sea 4-5 mm.
3. Montar un tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) con la punta del capilar y Aspire 15 μl de la mezcla de AAV1-Fast-Green en el capilar.
4. Mantener los animales sujetos a una temperatura corporal fisiológica constante de 37 ° C durante todo el procedimiento.
5. Coloque un embarazada ratón C57Bl/6 (día embrionario 14.5) en la cámara de preincubación y anestesiar el ratón con gaseosa 4% isoflurano (con una tasa de flujo volumétrico de aire de 0.6-0.8 L/min).
6. Inyectar por vía subcutánea, buprenorfina (0.1 mg/kg de peso corporal).
7. Coloque el ratón anestesiado en la placa quirúrgica precalentada (37 ° C).
8. Cubrir los ojos con un lubricante.
9. Ajuste el ratón con la máscara de la anestesia (isoflurano gaseosa de 1,5% a una tasa de flujo volumétrico de aire de 0.6-0.8 L/min) en la placa quirúrgica y afeitado de la región de la piel abdominal. Limpie la región depilada con 3 X 75% etanol y luego con solución de betadine.
   Nota: Controlar continuamente el comportamiento de la respiración del ratón anestesiado. Ajustar la concentración del gas isoflurano según el patrón de inhalación-exhalación del ratón.
10. Comprobar la ausencia del reflejo plantar apretando las falanges traseras de la pata del ratón.
11. Abrir la cavidad abdominal, sujetando la piel con pinza de iris aserrado curvo (10 cm) y cortar la piel a lo largo de la linea mediana con tijeras rectas de carburo de tungsteno (10 cm) y luego, sujetando la pared peritoneal con recta Pinzas Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0.12 mm) y tijeras de corte de la pared a lo largo de la linea alba con recta Vanna (8 cm).
12. Coloque un pedazo de la película de parafina fenestrados en la abertura abdominal y fijar la película en ambos extremos con pinzas hemostáticas mosquito micro (12,5 cm, curvado).
13. Exponga los cuernos uterinos con a cuchara-como el dispositivo para evitar daños a los embriones dentro de los cuernos uterinos. Gotear algunas gotas de PBS (37 ° C) en los cuernos uterinos e inspeccione los embriones por daños o malformaciones en el saco uterino.
14. Documento el orden y la posición de los embriones en los cuernos uterinos. Girar los embriones con cuidado dentro del saco uterino hasta la posición deseada para la inyección.
15. Inyectar 1-2 μl de la mezcla de AAV1-Fast-Green por inspeccionar visualmente el sitio de inyección (por ejemplo, ventrículos cerebrales) y la penetración de tinte bajo un estereomicroscopio.
16. Documentar los embriones inyectados y coloque los cuernos uterinos con los embriones inyectados en la cavidad abdominal.
17. Gotear algunas gotas de PBS (37 ° C) en la cavidad abdominal. Cerrar la cavidad suturando la pared peritoneal (uso poliamida 6-0-tamaño de las suturas) y la piel (uso poliamida 3-0-tamaño de las suturas), uso de pinzas hemostáticas de mosquito de Halsted (12,5 cm, curvado). Como alternativa, utilizar un patrón interrumpido simple o grapas/sutura de acero inoxidable para cerrar la cavidad abdominal y la piel.

2. Telemacrophotography de tejidos aislados

1. Preparación de tampones
   1. Preparar el tampón de Sörensen (1 L) por disolución 14,95 g de Na₂HPO₄ y 2,18 g de KH₂PO₄ en 1 L de agua destilada con agitación a 200 rpm. Para perfusión de cachorros gestación o cachorros en el post-natal periodos de tiempo, use un tamaño apropiado de agujas para inyección intragástrica o abdominal y asegúrese de que la concentración de la anestesia de pentobarbital de sodio terminal no supera los 180 mg / kg de peso corporal.
   2. Preparar solución de fijación de Mugnaini (5 L) al calentar 500 mL de agua destilada a 75 ° C y añadir 50 g de polvo paraformaldehido con agitación a 200 rpm, añadir 200 μL de 5 N NaOH, añadir 1.500 mL de tampón de Sörensen, 1.750 mL de agua destilada y 500 mL de glutaraldehído al 25%. Llene hasta 5.000 mL con agua destilada. Utilice este búfer final para perfusión.
      Nota: Preparar la solución de fijación de Mugnaini bajo el capó, usar gafas de protección y evitar humos. Añadir azul de metileno (0.05 g/L) para una mejor visualización de la perfusión.
2. Aislamiento de perfusión y de tejido de ratón
   1. Transcardially perfusión los ratones embarazados que llevan los embriones transduced (en el caso de estudios de embriones) o los pubs transduced nacidos a la edad deseada (por ejemplo, día postnatal 24) según procedimientos estándar^{6,7, 11,12,13,14,15,16,17}, utilizando pentobarbital sódico intraperitoneal de terminal anestesia (200 mg/kg de peso corporal).
   2. Inyectar a lo ratones transcardially con solución de heparina (500 U) utilizando un 26 G, 1 aguja y, antes de la fijación, infundir los ratones transcardially con 10 mL de PBS para eliminar la sangre del cuerpo y ellos perfusión transcardially con 30 mL de 40 º C precalentado Mugnaini solución de fijación.
      Nota: Para los ratones adultos, realizar una alternativa perfusión retrógrada a través de la aorta abdominal¹⁴.
   3. Aislar el tejido perfundido de interés (por ejemplo, todo el cerebro o la médula espinal) y postfix el tejido en menos de 10 mL de solución de fijación de Mugnaini por otro 24 h a 4 ° C.
   4. Lavar el tejido en 10 mL de PBS durante 3 horas a temperatura ambiente.
3. Incrustación en agarosa, además de documentación y seccionamiento
   1. Ajustar el tejido aislado (por ejemplo, todo el cerebro) en un marco especial con un reproducible seccionamiento ángulo^8,9,10. Como alternativa, utilice un vibratome con un espesor de corte ajustable.
   2. Coloque el tejido nervioso en el marco, ajustar el tejido para telemacrography y documentar las coordenadas.
   3. Preparar el medio de inclusión de agarosa bajo punto de fusión de 3%: agregar 3 g de agarosa en 100 mL de tampón de Sörensen y calentar la mezcla en un baño de agua a 90 ° C.
   4. Verter la agarosa al 3% (30 ° C) en el marco que contiene el tejido. Cubrir el marco con un bloque de metal caliente y esperar hasta que se endurece. Durante el endurecimiento, utilice dispositivos de telemacrographic para el tejido embebido y sus coordenadas en el marco de la imagen.
   5. Transferir el tejido embebido en agarosa en un marco con boquetes de corte correspondientes a las coordenadas del primer fotograma.
   6. Cortar el tejido embebido en secciones de espesor deseado (por ejemplo, 1.5 mm) con un dispositivo con una navaja delgada y vibrante (véase Tabla de materiales).
      Nota: Para mejorar el deslizamiento de la hoja de afeitar, vierta unas gotas de glicerina sobre el tejido embebido.
   7. Imagen de cada sección de tejido en PBS y recoger las imágenes en una carpeta.

3. preparación del tejido aislado para microscopía electrónica de transmisión

Nota: Realizar todos los otros pasos de incubación en platos de vidrio con tapas herméticamente con cierre en una plataforma de agitación bajo el capó.

1. Lávese las secciones de tejido de 2 x 30 min en PBS. Incubar las secciones en solución acuosa el tetróxido de osmio al 2% (OsO₄) por 2 h a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio es tóxico y puede ser dañino cuando entra en contacto con la piel.
2. Lávese las secciones osmicated de 2 x 30 min en PBS.
3. Incubar las secciones en etanol al 30%, 50% y 70% a temperatura ambiente durante 10-15 min (opcional: incubar en etanol al 70% a 4 ° C durante la noche).
4. Imagen de las muestras osmicated en etanol al 70% en RGB LED luz^8,9,10 (2 x 15 W) aplicadas a la muestra de la izquierda y derecha en un ángulo de 45 °. Platos de uso negro y un fondo negro opaco para reducir al mínimo la dispersión y la reflexión de la luz durante la iluminación.
   PRECAUCIÓN: No permita que la sección se sequen durante proyección de imagen.
5. Crear un atlas de la sección con coordenadas por la recogida de imágenes en serie en una carpeta.
6. Incubar a las muestras en etanol al 100% (2 x 30 min) y óxido de propileno 100% (2 x 30 minutos) a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: No permita que las secciones se sequen mientras se cambian las soluciones.
7. Mezclar 260 mL de resina con 240 mL de anhídrido dodecenylsuccinic en un recipiente de vidrio, agitando suavemente con una barra de vidrio. Revise periódicamente la inhomogeneidad, burbujas y manchas. Muy suavemente, agitar a mano durante al menos 45 minutos.
8. Preparar óxido de propileno/resina en una proporción de 1:2 y 1:1 y añadir acelerador de 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
9. Incubar el tejido en el 1:2 incrustación solución de paso 3.8 por 2 h y luego en la solución de empotrar de 1:1 del paso 3.8 por 2 h a temperatura ambiente en un disco giratorio.
10. Coloque el tejido en platos planos de polipropileno, cubrir el tejido con resina fresca que contiene 3% acelerador y curar el tejido embebido en 65-85 ° C durante 12-24 h.
11. Enfriar el tejido embebido a temperatura ambiente y extraer a los especímenes incrustados de resina de los platos de polipropileno.

4. selección de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales para análisis cuantitativo

1. Mapeo del área de interés
   1. Elija un área de interés (por ejemplo, el hipocampo o el cerebelo) y localizar el área en el atlas de sección seleccionando la imagen del atlas (paso 3.5) que contiene esta zona.
   2. Esboce las fronteras del área de interés en la imagen de la sección y encontrar/superponer estas fronteras de la región en la muestra de resina.
   3. Scratch-marca las fronteras de la zona de interés (por ejemplo, el hipocampo o el cerebelo) en la muestra de resina, con un calibre de aguja fina (26 G, 1 in).
   4. Calentar la muestra de resina a 85 ° C en un horno para ablandar la resina para el ajuste o, alternativamente, utilizar un dispositivo de corte, una lámina fina o papel de lija.
   5. Suprimir la zona de interés de la muestra de resina con una cuchilla de afeitar (véase Tabla de materiales). Montar al espécimen sobre la celebración de barras de vidrio acrílico del calibre requerido por ejemplo, con (un diámetro de 8 mm) y una longitud de 1 cm con pegamento. Cortar al espécimen montado para semi y seccionamiento ultrafino.
   6. Preparación Semifinos (0.75 μm) y ultrafino (70 nm) las secciones de la zona recortada utilizando un ultramicrótomo: situado a 1,5 mm/s de 0.75 μm de grosor y a 0,7 mm/s para el grueso de nm 70.
   7. Recoger las secciones SEMIFINOS en soportes de vidrio y las secciones con toluidina 1% de la mancha azul en PBS (de 4 minutos).
   8. Lávese las secciones varias veces en agua desionizada. Examinar las secciones manchadas bajo el microscopio óptico usando 4 x (NA de ∞ 0,1 /-), 10 x (NA de ∞/0.17 0.22), 40 x (NA de 0.65 ∞/0.17) y 100 x (NA de 1.25 ∞/0.17) objetivos.
   9. Recoge secciones ultradelgadas en rejillas de níquel. Utilizadas de las rejillas TEM a 180 kV y a 3, 200 x, 6, 000 x o 8.000 aumentos.
2. Análisis TEM
   1. Elija los parámetros ultraestructurales de interés para el análisis cuantitativo de TEM (p. ej., botones con vesículas y mitocondrias o axones nonmyelinated y mielínicas) y tomar imágenes TEM de estos parámetros menores de 3 x 500, x 6.000 y 8.000 aumentos.

Resultados

Para la anestesia rápida y fiable de los ratones, se consideraron varios parámetros de seguridad, y un espacio de trabajo optimizado de la unidad de anestesia demostró para ser adecuada (figura 1A). La unidad está diseñada para controlar la mezcla de isoflurano líquido y aire ambiente con una precisión necesaria para la exitosa cirugía en pequeños animales, como ratones y ratas. Aire e isoflurano se mezclan en el vaporizador de acuer...

Discusión

Un paso crucial de transducción en el útero es el procedimiento de inyección. La inyección precisa en ventrículos cerebrales o en otra área de interés requiere experiencia y habilidad práctica. La más fina la punta microcapillary, el menor daño tisular puede ocurrir; sin embargo, esto es a costa de aumentar la presión de la inyección. En contraste con electroporación en el útero^19,20,21,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol	Serva	36975
26 G x 1'' needle	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)	UKE (Viral Core Facility)	-	For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	low gelling agarose
Air Pump	Biomedical Instruments (Univentor)	Eheim 100
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium	Biomedical Instruments (Univentor)	-
buprenorphine	Temgesic	ampules	painkiller
capillaries	Science-Products	GB100TF-10	with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride	Fluka	44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)	FST	11203-23
electric shaver	Phillips	-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)	Ethicon	-	polyamide
eye lubricant	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)	FST	13011-12
Heparin-Natrium	Ratiopharm		25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)	FST	14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations	Biomedical Instruments (Univentor)	-
isoflurane (Attane)	JD medical		inhalation anesthesia
LED RGB lights	Cameo	CLQS15RGBW	LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E	Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller	Science-Products	P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)	FST	13010-12
Nickel grids, 200 mesh	Ted Pella	1GC200
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219
Propylene oxide	Fluka	82320
razor blades	Schick	87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)	Merial GmbH	-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Technovit 4004 two components glue	Kulzer
Telemacrodevice	Canon	-	Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97	Sutter Instruments	-
thin vibrating razor blade device	Krup	-	with Szabo thin blades
toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
Transmission electron microscope C20	Phillips	-	up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Ultracut E	Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Univentor Scavenger	Biomedical Instruments (Univentor)	8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)	FST	15009-08