Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

Riepilogo

La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

Abstract

Il presente studio combina trasduzione nell'utero, con microscopia elettronica a trasmissione (TEM), che mira ad un'analisi morfometrica precisa dei parametri ultrastrutturali in strutture topografiche inequivocabilmente identificati, colpite da una proteina di interesse che è introdotta nell'organismo tramite trasferimento virale. Questo approccio combinato consente una transizione fluida dal macrostrutturali identificazione ultrastrutturale di seguenti mappe topografiche in un Atlante di tessuto. Microscopia elettronica ad alta risoluzione del tessuto in-utero-trasdotte rivela l'ultrastruttura bene del neuropil e i relativi parametri di plasticità, quali le bouton sinaptico zone, il numero delle vescicole sinaptiche e dei mitocondri all'interno di un Profilo di bouton, la lunghezza dei contatti sinaptici, le aree di axonal, lo spessore di foderi di myelin, il numero delle lamelle di mielina e le zone di profili di mitocondri. L'analisi di questi parametri rivela intuizioni essenziali modifiche ultrastrutturali plasticità nelle aree del sistema nervoso che sono interessati dal trasferimento virale del costrutto genetico. Questo metodo combinato non può essere utilizzato solo per studiare l'effetto diretto di geneticamente biomolecole e/o droghe sulla plasticità neuronale, ma apre anche la possibilità di studiare il salvataggio nell'utero della plasticità neuronale (ad es., nel contesto della malattie neurodegenerative).

Introduzione

Nessun fotone può penetrare un campione di tessuto ultrasottile del grado di profondità di un elettrone. Questo attribuisce vantaggi inestimabili a TEM a catturare immagini a risoluzione nanometrica di strutture fini rispetto alle tecniche di microscopia chiara. Ad esempio, TEM consente la visualizzazione di organelli intracellulari come i mitocondri, i melanosomes e vari tipi di granuli secretori, microtubuli, microfilamenti, ciglia, microvilli e giunzioni intercellulari (superficie cellulare specializzazioni), in particolare le sinapsi nel sistema nervoso^1,2,3,4. L'obiettivo generale del presente studio metodologico è il riconoscimento ultrastrutturale dei cambiamenti nella plasticità neurale durante lo sviluppo su interferenza prenatale combinando le tecniche di state-of-the-art di trasduzione nell'utero e TEM. Viralmente codificato le proteine di interesse sono state trasdotte nell'utero nel sistema nervoso centrale^5,6,7, compreso il midollo spinale⁶. Per esempio, nell'utero trasduzione in combinazione con TEM è stato utilizzato per studiare l'effetto della molecola di adesione cellulare L1 sull'apprendimento plasticità nei topi L1-carenti, in particolare per quanto riguarda l'interazione tra L1 e proteine recettori nucleari motorio in neuroni cerebellari⁷.

L'analisi dei parametri di neuroplasticità richiede informazioni precise circa la localizzazione delle zone più piccole all'interno del sistema nervoso. Pertanto, essa è sufficiente descrivere dettagli ultrastrutturali e il loro orientamento topografico esatta rispetto alle altre strutture. Nello studio presente, è presentato un metodo specifico preparatorio puntando l'indagine dettagliata di aree morfologiche distinte sulla base sia di luce e di microscopia elettronica. Questo approccio combina diverse tecniche di manipolazione dei tessuti, a partire con trasduzione nell'utero del cervello del topo e del midollo spinale e seguita dalla fissazione di aspersione, incorporamento di muffa e il tessuto di elaborazione per TEM. Un passo essenziale incluso tra l'incorporamento e la lavorazione del tessuto per TEM è la documentazione del tessuto, usando la tecnica di riflessione della luce di interferenza che permette la precisa documentazione microfotografici e basso ingrandimento dei tessuto esemplari^8,9,10. Inglobato l'approccio attuale, questa tecnica permette ai ricercatori di esaminare dettagli topografici e strutturali delle superfici di tessuto nervoso e dei profili di fetta di campione prima della loro preparazione per TEM.

Una cornice speciale per il sezionamento intero cervello corrisponde alle coordinate stereotassiche. Questo telaio avvantaggia la ricostruzione (3D) tridimensionale morfologica delle aree nel tessuto nervoso e può essere utilizzato per l'analisi morfometrica. Le grafie delle sezioni visualizzate vengono assegnate coordinate topografiche e le sezioni numerate progressivamente costruire mappe in un Atlante di tessuto.

Dopo resina l'elaborazione, il tessuto incorporato è sezionato in sezioni ultrasottili (< 70 nm) contenenti aree selezionate, secondo le mappe dell'Atlante del tessuto di cui sopra. Le sezioni ultrasottili sono sottoposti a TEM per ottenere immagini ad alta risoluzione di parametri di plasticità (ad es., sezione profilo aree di boutons sinaptici o fibre assonali) del loro contenuto e dei contatti per le strutture vicine all'interno del complesso neuropil.

Con il metodo descritto nel presente documento, la transizione da macrostrutture visualizzati per micro - e nanostrutture consente studi comparativi approfonditi di plasticità neuronale morfologici dopo nell'utero trasduzione dello sviluppo nervoso sistema.

Protocollo

Tutte le procedure su soggetti animali sono state approvate dai comitati di etica animale istituzionale degli Stati federali di Amburgo e Nordrhein-Westfalen, Germania.  Utilizzare strumenti sterili, guanti protettivi e cappotti asettici durante tutta la procedura chirurgica.

1. nella trasduzione del Utero

1. Preparare virus adeno-associato di tipo 1 (AAV1) che codifica per la destinazione desiderata (4 x 10¹¹ virale particelle / µ l di AAV1) in tampone fosfato salino (PBS) a pH 7,4. Aggiungere 0,1 mg / µ l Fast Green e mantenere la miscela di AAV1-Fast-verde a 37 ° C.
2. Preparare una sottile punta capillare con la forma desiderata (8 mm di lunghezza, con un diametro esterno di 80 µm e una parte interna diametro di 50 µm), con l'estrattore micropipetta (impostazioni: pressione = 500, calore = 700, pull = 0, velocità = 80, tempo = 200, vedere il tabella materiali < / c1 >). Rompere la punta del capillare in modo che è 4-5 mm.
3. Montare un tubo aspiratore (44 x 0,7 cm) con la punta capillare e aspirare 15 µ l della miscela AAV1-Fast-verde in vaso capillare.
4. Tenere l'animali soggetti ad una temperatura corporea costante fisiologica di 37 ° C durante tutta la procedura.
5. Posizionare un mouse C57Bl/6 incinto (giorno embrionale 14,5) nella camera di preincubazione e anestetizzare il mouse con gassoso isoflurano 4% (con una portata volumetrica di 0,6-0,8 L/min).
6. Iniettare per via sottocutanea, buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo).
7. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piastra chirurgica preriscaldata (37 ° C).
8. Coprire gli occhi con un lubrificante.
9. Montare il mouse con la maschera di anestesia (gassoso isoflurano 1,5% a un tasso di flusso d'aria volumetrica di 0,6-0,8 L/min) sulla piastra chirurgica e rasatura della regione di pelle addominale. Pulire la regione rasata con 3 X 75% etanolo e poi con soluzione di betadine.
   Nota: Monitorare continuamente il comportamento di respirazione del mouse anestetizzato. Regolare la concentrazione del gas isoflurano secondo il modello di inspirazione-espirazione del mouse.
10. Verificare l'assenza del riflesso plantare comprimendo le falangi di zampa posteriore del mouse.
11. Aprire la cavità addominale afferrando la pelle con il forcipe curvo seghettato iride (10 cm) e tagliando la pelle lungo la linea mediana con forbici dritto in carburo di tungsteno (10 cm) e poi, afferrando la parete peritoneale con dritto pinzette Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) e la parete lungo la linea alba con di dritto Vanna forbici (8 cm).
12. Posizionare un pezzo di paraffina fenestrated film sull'apertura addominale e fissare la pellicola su entrambe le estremità con micro-zanzara pinze emostatiche (12,5 cm curvata).
13. Esporre i corni uterini con un cucchiaio come dispositivo per evitare di danneggiare gli embrioni all'interno i corni uterini. Gocciolare qualche goccia di PBS (37 ° C) sui corni uterini e ispezionare gli embrioni per danni o malformazioni all'interno del sac uterina.
14. Documentare l'ordine e la posizione degli embrioni nei corni uterini. Girare gli embrioni con cura all'interno del sac uterino fino a quando non viene raggiunta la posizione desiderata per l'iniezione.
15. Iniettare 1-2 µ l della miscela AAV1-Fast-verde ispezionando visivamente il sito di iniezione (ad es., i ventricoli del cervello) e la penetrazione del colorante sotto un microscopio stereoscopico.
16. Documentare gli embrioni iniettati e rimettere i corni uterini con embrioni iniettati nella cavità addominale.
17. Gocciolare qualche goccia di PBS (37 ° C) nella cavità addominale. Chiudere la cavità suturando la parete peritoneale (uso poliammide 6-0-dimensioni suture) e la pelle (uso poliammide 3-0-dimensioni suture), utilizzando la pinza emostatica di Halsted mosquito (12,5 cm curvata). In alternativa, utilizzare un semplice schema interrotto o in acciaio inox sutura/staples per chiudere la cavità addominale e la pelle.

2. Telemacrophotography dei tessuti isolati

1. Preparazione di buffer
   1. Preparare tampone di Sörensen (1 L) di dissoluzione 14,95 g di Na₂HPO₄ e 2,18 g di KH₂PO₄ in 1 L di acqua distillata sotto agitazione a 200 giri/min. Per aspersione di ritardo cuccioli di gestazione e/o cuccioli nel post-partum periodi di tempo, utilizzare una dimensione appropriata di aghi per iniezione addominale o intragastrica e assicurarsi che la concentrazione dell'anestesia terminale sodio pentobarbital non superi i 180 mg / kg di peso del corpo.
   2. Preparare la soluzione di fissaggio di Mugnaini (5L) di riscaldamento 500 mL di acqua distillata fino a 75 ° C e aggiungere 50 g di polvere di paraformaldeide sotto agitazione a 200 giri/min, aggiungere 200 µ l di 5 N NaOH, aggiungendo 1.500 mL di tampone di Sörensen, 1.750 mL di acqua distillata e 500 mL di 25% glutaraldeide. Riempire fino a 5.000 mL con acqua distillata. Utilizzare questo buffer finale per aspersione.
      Nota: Preparare la soluzione di fissaggio di Mugnaini sotto il cofano, indossare occhiali protettivi ed evitare fumi. Aggiungere blu di metilene (0,05 g/L) per una migliore visualizzazione della perfusione.
2. Isolamento di aspersione e tessuto di mouse
   1. Via irrorare i topi incinto che trasportano gli embrioni trasdotte (nel caso di studi di embrione) o il pub trasdotte nata all'età desiderata (ad esempio, postnatale giorno 24) secondo le procedure standard^{6,7, 11,12,13,14,15,16,17}, utilizzando intraperitoneale terminale sodio pentobarbital anestesia (200 mg/kg di peso corporeo).
   2. Iniettare la via di topi con soluzione di eparina (500 U) utilizzando un G 26, 1 ago e, prima della fissazione, infondere i topi via con 10 mL di PBS per scovare l'anima dal corpo e li irrorare via con 30 mL di 40 ° C preriscaldato Mugnaini soluzione di fissaggio.
      Nota: Per topi adulti, eseguire un'aspersione retrograda alternativo tramite l' aorta addominale¹⁴.
   3. Isolare il tessuto irrorato di interesse (ad es., intero cervello o midollo spinale) e postfix il tessuto in almeno 10 mL di soluzione di fissaggio di Mugnaini per altre 24 ore a 4 ° C.
   4. Lavare il tessuto in 10 mL di PBS per 3 h a temperatura ambiente.
3. L'incorporamento in agarosio, oltre a documentazione e sezionamento
   1. Regolare il tessuto isolato (ad es., intero cervello) in una cornice speciale con un riproducibile sezionamento angolo^8,9,10. In alternativa, è possibile utilizzare un vibratomo con uno spessore di taglio regolabile.
   2. Posizionare il tessuto nervoso nel telaio, regolare il tessuto per telemacrography e documentare le coordinate.
   3. Preparare 3% basso punto di fusione dell'agarosi-incorporamento medio: aggiungere 3 g di agarosio in 100 mL di tampone di Sörensen e riscaldare la miscela in un bagno di acqua a 90 ° C.
   4. Versare agarosio al 3% (30 ° C) nel frame che contiene il tessuto. Coprire il telaio con un blocco di metallo caldo e attendere che sia avanzata. Durante l'indurimento, utilizzare dispositivi di telemacrographic per il tessuto incorporato e le sue coordinate all'interno della cornice di immagine.
   5. Trasferire il tessuto dell'agarosi-incastonato in una cornice con lacune di taglio corrispondente alle coordinate del primo fotogramma.
   6. Tagliare il tessuto incorporato in sezioni di spessore desiderato (ad esempio 1,5 mm) con un dispositivo con una lama di rasoio sottile e vibra (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Per migliorare lo scorrimento della lama di rasoio, gocciolare qualche goccia di glicerina sul tessuto incorporato.
   7. Immagine di ogni sezione di tessuto in PBS e raccogliere le immagini in una cartella.

3. preparazione del tessuto isolato per microscopia elettronica di trasmissione

Nota: Eseguire gli ulteriori passi di incubazione in piatti di vetro con coperchi ermeticamente chiudibili su una piattaforma d'agitazione sotto il cofano.

1. Lavare le sezioni di tessuto per 2 x 30 min in PBS. Incubare le sezioni in soluzione acquosa tetrossido di osmio al 2% (OsO₄) per 2 h a temperatura ambiente.
   Attenzione: Tetrossido di osmio è tossico e può essere dannoso quando viene a contatto con la pelle.
2. Lavare le sezioni osmicated per 2 x 30 min in PBS.
3. Incubare le sezioni in etanolo 30%, 50% e 70% a temperatura ambiente per 10-15 min (opzionale: Incubare in etanolo al 70% a 4 ° C durante la notte).
4. Immagine di osmicated esemplari in etanolo al 70% sotto LED RGB luce^8,9,10 (2 x 15 W) applicati al campione da sinistra e destra con un angolo di 45 °. Utilizzare piatti neri e sfondo nero opaco per ridurre al minimo la dispersione e la riflessione della luce durante l'illuminazione.
   Attenzione: Non consentire la sezione ad asciugarsi durante la formazione immagine.
5. Creare un Atlante delle immagini sezione con coordinate attraverso la raccolta di immagini in serie in una cartella.
6. Incubare i campioni in etanolo al 100% (2x per 30 min) e 100% ossido di propilene (2x per 30 min) a temperatura ambiente.
   Attenzione: Non consentono le sezioni ad asciugarsi durante la modifica di soluzioni.
7. Mix 260 mL di resina con 240 mL di anidride acetica di dodecenylsuccinic in un recipiente di vetro, mescolando delicatamente con una barra di vetro. Controllare periodicamente per disomogeneità, bolle e sbavature. Mescolare molto delicatamente, a mano per almeno 45 min.
8. Preparare la resina/ossido in un rapporto di 1:2 e 1:1 e aggiungere 3% accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
9. Incubare il tessuto in 1:2 l'incorporamento di soluzione da passo 3.8 per 2 h e poi nella soluzione 1:1 l'incorporamento da passo 3.8 per 2 h a temperatura ambiente su una ruota in movimento.
10. Posizionare il tessuto in piatti piatto in polipropilene, coprire il tessuto con resina fresca contenente 3% acceleratore e curare il tessuto incorporato al 65-85 ° C per 12-24 h.
11. Raffreddare il tessuto incorporato a temperatura ambiente e rimuovere i campioni di resina incorporati dai piatti in polipropilene.

4. scelta dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturale di analisi quantitativa

1. La mappatura dell'area di interesse
   1. Scegliere un'area di interesse (ad es., ippocampo o cervelletto) e localizzare la zona nell'Atlante sezione scegliendo l'immagine dall'Atlante (passo 3.5) che contiene questa zona.
   2. I confini della zona di interesse sull'immagine sezione di schizzo e trovare/sovrapporre questi confini di regione sull'esemplare di resina.
   3. Zero-mark i bordi dell'area di interesse (ad es., ippocampo o cervelletto) il campione di resina, usando un indicatore di fine dell'ago (26 G, 1 in).
   4. Riscaldare il campione di resina a 85 ° C in un forno per ammorbidire la resina per la rifilatura o, in alternativa, utilizzare un dispositivo di taglio, una lama sottile o carta vetrata.
   5. Asportare l'area di interesse dall'esemplare di resina con una lama di rasoio (Vedi Tabella materiali). Montare l'esemplare su barre di vetro acrilico del calibro richiesto ad es., con (un diametro di 8 mm) e una lunghezza di 1 cm con la colla della holding della. Sgrossare il campione montato per semi - e il sezionamento ultrasottile.
   6. Preparare semifini (0,75 µm) e ultrasottile (70 nm) sezioni dell'area di taglio utilizzando un ultramicrotomo: impostarlo a 1,5 mm/s per 0,75 µm spessore e a 0,7 mm/s per spessore di 70 nm.
   7. Raccogliere le sezioni semifini sugli elementi portanti di vetro e macchia le sezioni con 1% toluidina blu in PBS (per 4 min.).
   8. Lavare le sezioni più volte in acqua deionizzata. Esaminare le sezioni macchiate al microscopio luce utilizzando 4 x (NA di ∞ 0,1 /-), 10 x (NA di ∞/0,17 0,22), 40 x (NA di 0,65 ∞/0,17) e 100 x obiettivi (NA di 1,25 ∞/0,17).
   9. Raccogliere sezioni ultrasottili su griglie di nichel. Le griglie con riserva di TEM 180 kV e a 3, 200 x, 6, 000 x e/o 8.000 ingrandimenti.
2. Analisi TEM
   1. Scegliere i parametri ultrastrutturali di interesse per l'analisi quantitativa di TEM (ad es., boutons con vescicole e mitocondri o assoni myelinated e senza) e prendere le immagini TEM di questi parametri sotto i 3, x 500, 6.000 x e/o 8.000 ingrandimenti.

Risultati

Per anestesia affidabile e veloce di topi, sono stati considerati numerosi parametri di sicurezza e un'area di lavoro ottimizzata dell'unità anestesia si è rivelata adeguata (Figura 1A). L'unità è progettata per controllare la miscela di isoflurane liquida e aria ambiente con una precisione richiesta per riuscito ambulatorio su piccoli animali, quali topi e ratti. Aria e isoflurano sono mescolati in vaporizzatore secondo le impostazioni d...

Discussione

Un passo cruciale di trasduzione nell'utero è la procedura di iniezione. L'iniezione precisa nei ventricoli del cervello o in un'altra area di interesse richiede esperienza e abilità pratiche. Più sottile è la punta di microcapillary, può verificarsi il meno danno tessutale; Tuttavia, questo è a costo di aumentare la pressione di iniezione. In contrasto con elettroporazione nell'utero^{19,20,21,2...}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol	Serva	36975
26 G x 1'' needle	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)	UKE (Viral Core Facility)	-	For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	low gelling agarose
Air Pump	Biomedical Instruments (Univentor)	Eheim 100
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium	Biomedical Instruments (Univentor)	-
buprenorphine	Temgesic	ampules	painkiller
capillaries	Science-Products	GB100TF-10	with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride	Fluka	44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)	FST	11203-23
electric shaver	Phillips	-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)	Ethicon	-	polyamide
eye lubricant	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)	FST	13011-12
Heparin-Natrium	Ratiopharm		25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)	FST	14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations	Biomedical Instruments (Univentor)	-
isoflurane (Attane)	JD medical		inhalation anesthesia
LED RGB lights	Cameo	CLQS15RGBW	LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E	Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller	Science-Products	P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)	FST	13010-12
Nickel grids, 200 mesh	Ted Pella	1GC200
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219
Propylene oxide	Fluka	82320
razor blades	Schick	87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)	Merial GmbH	-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Technovit 4004 two components glue	Kulzer
Telemacrodevice	Canon	-	Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97	Sutter Instruments	-
thin vibrating razor blade device	Krup	-	with Szabo thin blades
toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
Transmission electron microscope C20	Phillips	-	up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Ultracut E	Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Univentor Scavenger	Biomedical Instruments (Univentor)	8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)	FST	15009-08