Bewertung der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter nach In Utero Transduktion von Entwicklungsländern Mausgehirn und Rückenmark

Zusammenfassung

Die Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie und in der Gebärmutter Transduktion ist ein leistungsfähiger Ansatz für das Studium der morphologischer Veränderungen in den feinen Ultrastruktur des Nervensystems während der Entwicklung. Diese kombinierte Methode ermöglicht tiefe Einblicke in Änderungen in Strukturdetails Neuroplastizität in Bezug auf ihre topographische Darstellung zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie verbindet im Mutterleib Transduktion mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) mit dem Ziel einer präzise morphometrischen Analysis der Ultrastrukturforschung Parameter eindeutig identifizierten topographische Strukturen, ein Protein des Interesses betroffen Das wird in den Organismus über virale Übertragung eingeführt. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht einen reibungslosen Übergang vom Macrostructural zum Ultrastrukturforschung Identifikation durch folgende topographische Navigationskarten in einem Gewebe-Atlas. Hochauflösende Elektronenmikroskopie des Gewebes in-Utero-ausgestrahlt verrät das feine Ultrastruktur der Neuropil und dessen Plastizität Parameter, wie z. B. Modellbaugruppe synaptische Bouton Bereiche, die Anzahl der synaptischen Vesikel und Mitochondrien innerhalb einer Bouton Profil, die Länge der synaptischen Kontakte, geschnittenen axonale Bereiche, die Dicke der Myelinscheiden, die Anzahl der Myelin-Lamellen und geschnittenen Flächen der Mitochondrien Profile. Die Analyse dieser Parameter zeigt wesentliche Einblicke in die Veränderungen der Ultrastrukturforschung Plastizität in den Bereichen des Nervensystems, die durch die viralen Übertragung von genetischen Konstrukt betroffen sind. Diese kombinierte Methode kann nicht nur zur Untersuchung der direkten Wirkung von gentechnisch Biomoleküle und/oder Drogen auf neuronale Plastizität, sondern eröffnet auch die Möglichkeit, die im Mutterleib Rettung neuronale Plastizität (z. B. im Rahmen der Studie Neurodegenerative Erkrankungen).

Einleitung

Kein Photon kann eine ultradünne Gewebeprobe in die Tiefe Note eines Elektrons eindringen. TEM schreibt das unschätzbare Vorteile bei der Erfassung von Nanometer Auflösung feiner Strukturen im Vergleich zu lichtmikroskopische Techniken. Beispielsweise kann TEM für die Visualisierung von intrazellulären Organellen wie Mitochondrien, Melanosomen und verschiedene Arten von sekretorischen Granulat, Mikrotubuli, Microfili, Cilien, Mikrovilli und interzellulären Verzweigungen (Zelloberfläche Spezialisierungen), insbesondere die Synapsen im Nervensystem^1,2,3,4. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Studie methodische ist die Ultrastrukturforschung Anerkennung der Änderungen in neuronale Plastizität während der Entwicklung auf pränatale Störungen durch die Kombination der State-of-the-Art-Techniken in der Gebärmutter Transduktion und TEM. Viral kodierten Proteine des Interesses haben in der Gebärmutter in das zentrale Nervensystem^5,6,7, einschließlich Rückenmark⁶ausgestrahlt wurde. Zum Beispiel wurde in der Gebärmutter Transduktion in Kombination mit TEM verwendet für die Untersuchung der Wirkung von der Zelle Adhäsionsmolekül L1 auf motorischen Lernens Plastizität bei L1-defizienten Mäusen, insbesondere im Hinblick auf das Zusammenspiel zwischen L1 und nukleare Rezeptorproteine zerebelläre Neuronen⁷.

Die Analyse der Neuroplastizität Parameter erfordert genaue Informationen über die Lokalisation der kleinste Bereiche innerhalb des Nervensystems. Daher ist es angemessen, Ultrastrukturforschung Details und die genaue topographische Orientierung in Bezug auf andere Strukturen zu beschreiben. In der vorliegenden Studie wird eine bestimmte vorbereitende Methode mit dem Ziel der detaillierten Untersuchung von unterschiedlichen morphologischen Bereichen basierend auf Licht- und Elektronenmikroskopie vorgestellt. Dieser Ansatz kombiniert mehrere Techniken der Gewebe Manipulation, beginnend mit der Mausgehirn und Rückenmark im Mutterleib Transduktion und gefolgt von Perfusion Fixierung, Schimmel-einbetten und die Verarbeitung des Gewebes für TEM. Ein wesentlicher Schritt zwischen die Einbettung und die Verarbeitung des Gewebes für TEM ist die Dokumentation des Gewebes, mit Hilfe der Interferenz Lichtreflexion Technik, die für die präzise lichtmikroskopischen und niedrig-Vergrößerung Dokumentation erlaubt Gewebe Proben^8,9,10. Das derzeitige Konzept integriert, ermöglicht diese Technik Forscher um topografische und strukturelle Details von Nervengewebe Oberflächen und der Probe Slice Profile vor ihrer Zubereitung für TEM zu untersuchen.

Ein spezieller Rahmen für die ganze Gehirne-Schnitt entspricht stereotaktischen Koordinaten. Dieser Rahmen profitiert die morphologische dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Bereiche im Nervengewebe und morphometrische Analyse einsetzbar. Die Aufnahmen der visualisierten Abschnitte topographische Koordinaten zugewiesen sind, und die seriell nummerierte Abschnitte bauen Karten in einem Gewebe-Atlas.

Nach Harz verarbeitet, wird das eingebettete Gewebe in ultradünnen Abschnitte geschnitten (< 70 nm) mit ausgewählten Bereichen nach den Karten des Atlas genannten Gewebe. Die ultradünnen Abschnitte unterliegen TEM, hochauflösende Bilder der Plastizität Parameter (z. B. Querschnitt Profilbereiche der synaptischen Boutons oder axonalen Fasern) ihres Inhalts und der Kontakte zu benachbarten Strukturen innerhalb des Komplexes zu erhalten Neuropil.

Mit der hier beschriebenen Methode ermöglicht der reibungslose Übergang vom visualisierten Performance, Mikro- und Nanostrukturen detaillierte Vergleichsstudien der morphologischen neuronale Plastizität nach in Utero Transduktion des sich entwickelnden nervös System.

Protokoll

Alle Vorgänge an tierische Themen wurden von den institutionellen Tier Ethik-Kommissionen der Bundesländer Hamburg und Nordrhein-Westfalen, Deutschland genehmigt.  Sterile Instrumente, Schutzhandschuhe und aseptische Mäntel während des gesamten chirurgischen Verfahrens zu verwenden.

1. in Utero Transduktion

1. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7.4 bereiten Sie Adeno-assoziierten Virustyp 1 (AAV1) Codierung für das gewünschte Ziel (4 x 10¹¹ virale Partikel/µL AAV1 vor). Hinzufügen von 0,1 mg/µL schnell grün und halten Sie die AAV1-schnell-grün-Mischung bei 37 ° C.
2. Bereiten Sie eine dünne Kapillare Spitze mit der gewünschten Form (8 mm lang, mit einem Außendurchmesser von 80 µm und einer inneren Durchmesser von 50 µm), mit einer Mikropipette Puller (Einstellungen: Druck = 500, Wärme = 700, ziehen = 0, Geschwindigkeit = 80, Zeit = 200, sehen die Tabelle der Materialien < / c1 >). Die Spitze der Kapillare zu brechen, so dass es 4-5 mm.
3. Montieren Sie eine Absauganlage Rohr (44 x 0,7 cm) mit der Kapillare Spitze und aspirieren Sie 15 µL AAV1-schnell-grün-Mischung in die Kapillare.
4. Halten Sie die Tieren Themen physiologische Körpertemperatur konstant 37 ° c während des gesamten Verfahrens.
5. Legen Sie eine schwangere C57Bl/6-Maus (embryonale Tag 14,5) in der Vorinkubationsmethode Kammer und die Maus mit gasförmigen 4 % Isofluran zu betäuben (mit einem volumetrischen Luftmenge von 0,6-0,8 L/min).
6. Subkutan, injizieren Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg Körpergewicht).
7. Ort der narkotisierten Maus auf die vorgewärmte chirurgische Platte (37 ° C).
8. Decken Sie die Augen mit einem Gleitmittel.
9. Passen Sie die Maus mit der Anästhesie-Maske (gasförmige 1,5 % Isofluran auf eine volumetrische Luftmenge von 0,6-0,8 L/min) auf dem chirurgischen Teller und Rasur der Bauchhaut-Region. Wischen Sie die rasierte Region mit 3 X 75 % Ethanol und dann mit Betadine Lösung.
   Hinweis: Überwachen Sie kontinuierlich die Atmung Verhalten der narkotisierten Maus. Die Konzentration des Gases Isofluran nach dem Einatmen-Ausatmen-Muster der Maus anpassen.
10. Überprüfen Sie für das Fehlen der plantar Reflex durch Zusammendrücken der Hinterpfote Phalangen der Maus.
11. Öffnen der Bauchhöhle durch greifen die Haut mit gebogenen gezackten Iris Zangen (10 cm) und schneiden die Haut entlang der Linea Mediana mit gerader Hartmetall Schere (10 cm), und dann, durch Festhalten der peritonealen Wand mit geraden Dumont Pinzetten (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) und Schere schneiden die Wand entlang der Linea Alba mit geraden Vanna (8 cm).
12. Ein Stück gefenstert Paraffin-Film über die abdominale Eröffnung und befestigen des Films an beiden Enden mit Mikro-Moskito blutstillende Zangen (12,5 cm, gebogen).
13. Setzen Sie die uterine Hörner mit einem Löffel-ähnliches Gerät Beschädigungen der Embryonen in die Gebärmutter Hörner zu vermeiden. Ein paar Tropfen von PBS (37 ° C) auf die Gebärmutter Hörner und die Embryonen für Schäden oder Fehlbildungen im Inneren der Gebärmutter Sac zu inspizieren.
14. Die Reihenfolge und Position der Embryonen in die Gebärmutter Hörner zu dokumentieren. Drehen Sie die Embryonen vorsichtig in die Gebärmutter Sac, bis die gewünschte Position für die Injektion erreicht ist.
15. Injizieren Sie 1-2 µL AAV1-schnell-grün-Mischung durch die visuell Inspektion der Einstichstelle (z. B. Hirnkammern) und das Eindringen der Farbstoff unter einem Stereomikroskop.
16. Dokumentieren Sie die injizierten Embryonen zu und platzieren Sie die uterine Hörner mit den injizierten Embryonen zurück in die Bauchhöhle.
17. Ein paar Tropfen von PBS (37 ° C) in die Bauchhöhle. Schließen Sie den Hohlraum durch Vernähen der peritonealen Wand (Verwendung Polyamid 6-0-Größe Nähte) und der Haut (Verwendung Polyamid 3-0-Größe Nähte), mit Halsted Mosquito blutstillende Pinzette (12,5 cm, gebogen). Alternativ verwenden Sie ein einfaches unterbrochene Muster oder Edelstahl-Naht/Klammern, um die Bauchhöhle und die Haut zu schließen.

2. Telemacrophotography der isolierten Gewebe

1. Vorbereitung der Puffer
   1. Sörensen Puffer (1 L) durch auflösende 14,95 g Na₂HPO₄ und 2,18 g KH₂PO₄ in 1 L destilliertem Wasser unter Rühren bei 200 u/min vorbereiten. Durchblutung der späten Schwangerschaft Welpen bzw. Jungtiere in der postnatalen Zeiträume, verwenden Sie eine geeignete Größe der Nadeln für Bauch- oder eines-Injektion und stellen Sie sicher, dass die Konzentration der terminal Natrium Pentobarbital Narkose nicht mehr 180 mg als / Gewicht kg des Körpers.
   2. Bereiten Sie Mugnainis Fixierung Lösung (5 L) 500 mL destilliertem Wasser auf 75 ° C erhitzt und Zugabe von 50 g Paraformaldehyd Pulver unter Rühren bei 200 u/min, Hinzufügen von 200 µL 5 N NaOH, Hinzufügen von 1.500 mL Sörensen Puffer, 1.750 mL destilliertem Wasser , und 500 mL 25 % Glutaraldehyd. Füllen Sie bis zu 5.000 mL mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie diesen letzten Puffer für Perfusion.
      Hinweis: Bereiten Sie Mugnainis Fixierung Lösung unter der Haube, tragen Sie Schutzbrille und vermeiden Sie Dämpfe zu. Methylenblau (0,05 g/L) für eine bessere Visualisierung der Durchblutung hinzufügen.
2. Maus-Perfusion und Gewebe-isolation
   1. Transcardially durchspülen der schwangeren Mäusen, die tragen die transduced Embryonen (im Falle von Embryo Studien) oder die geborene transduced Pubs im gewünschten Alter (z. B. postnatale Tag 24) nach Standardverfahren^{6,7, 11,12,13,14,15,16,17}, über intraperitoneale terminal Natrium-Pentobarbital Anästhesie (200 mg/kg Körpergewicht).
   2. Die Mäuse Transcardially injizieren mit Heparin-Lösung (500 U) mit einem 26 G, 1 Nadel und vor Fixierung, ziehen die Mäuse Transcardially mit 10 mL PBS, das Blut aus dem Körper spülen, und Durchspülen sie Transcardially mit 30 mL 40 ° C vorgewärmt Mugnaini Fixierung-Lösung.
      Hinweis: Führen Sie für Erwachsenen Mäusen eine alternative retrograde Perfusion über die Bauchaorta¹⁴.
   3. Das perfundierten Gewebe von Interesse (z. B. ganze Gehirn oder Rückenmark) zu isolieren und postfix das Gewebe in mindestens 10 mL Mugnaini Fixierung Lösung für ein weiteres 24 h bei 4 ° C.
   4. Waschen Sie das Gewebe in 10 mL PBS für 3 h bei Raumtemperatur.
3. Einbettung in Agarose sowie Dokumentationen und schneiden
   1. Passen Sie das isolierte Gewebe (z. B. Gesamt-Hirn) in einen speziellen Rahmen mit einer reproduzierbaren Stationspunkte Winkel^8,9,10. Alternativ können Sie eine Vibratome mit eine einstellbare Schnittstärke.
   2. Platzieren Sie das Nervengewebe im Rahmen, stellen Sie das Gewebe für Telemacrography und dokumentieren Sie die Koordinaten.
   3. Bereiten Sie 3 % niedrig schmelzende Agarose-Einbettung Medium: 3 g Agarose in 100 mL Sörensen Puffer und erhitzen Sie die Mischung in einem Wasserbad bis 90 ° C.
   4. Gießen Sie 3 % Agarose (30 ° C) in den Rahmen, der das Gewebe enthält. Abdeckrahmen mit einem warmen Metallblock und warten, bis es Härten ist. Während der Aushärtung, verwenden Sie Telemacrographic Geräte, um das eingebettete Gewebe und seine Koordinaten innerhalb des Rahmens-Bild.
   5. Transfer des Gewebes Agarose eingebettet in einen Rahmen mit Schneidspalten entspricht die Koordinaten des ersten Frames.
   6. Das eingebettete Gewebe in Abschnitte der gewünschten Stärke (z. B. 1,5 mm) mit einem Gerät mit einer dünnen und vibrierenden Rasierklinge geschnitten (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Um das Gleiten der Rasierklinge zu verbessern, Tropfen Sie ein paar Glycerin auf das eingebettete Gewebe.
   7. Bild jedes Gewebe-Abschnitt mit PBS-Puffer und die Bilder in einem Ordner zu sammeln.

3. Vorbereitung des isolierten Gewebes Transmissions-Elektronenmikroskopie

Hinweis: Führen Sie alle weiteren Schritte der Inkubation in Glasschalen mit fest verschließbaren Deckel auf einer schütteln Plattform unter der Haube.

1. Waschen Sie die Gewebeschnitte für 2 x 30 min in PBS. Inkubieren Sie in den Abschnitten 2 % igen wässrigen Osmium ausgefällt Lösung (OsO₄) für 2 h bei Raumtemperatur.
   Vorsicht: Osmium ausgefällt ist giftig und kann schädlich sein, wenn es mit Haut in Berührung kommt.
2. Waschen Sie die osmicated Abschnitte für 2 x 30 min in PBS.
3. Die Abschnitte in 30 %, 50 % und 70 % Ethanol bei Raumtemperatur für 10-15 min inkubieren (optional: Übernachtung in 70 % igem Ethanol bei 4 ° C inkubieren).
4. Bild osmicated Exemplare in 70 % igem Ethanol unter LED RGB Licht^8,9,10 (2 x 15 W) von der linken und rechten Seite in einem Winkel von 45° zur Probe angewendet. Verwenden Sie schwarze Gerichte und einen langweiligen schwarzen Hintergrund, um Streuung und die Reflexion des Lichtes während Beleuchtung zu minimieren.
   Vorsicht: Lassen Sie nicht den Abschnitt während der Bildgebung austrocknen.
5. Erstellen Sie einen Atlas der Sektion Bilder mit Koordinaten, indem Bilder in Serie in einem Ordner sammeln.
6. Inkubieren Sie die Proben in 100 % Ethanol (2 X 30 min) und 100 % Propylenoxid (2 X 30 min) bei Raumtemperatur.
   Vorsicht: Lassen Sie sich nicht in den Abschnitten zu trocknen, beim Ändern der Lösungen.
7. Mischen Sie 260 mL Harz mit 240 mL Dodecenylsuccinic-Anhydrid in ein Glasgefäß, sanft unter Rühren mit einem Glasstab. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen auf Inhomogenität, Bläschen und Schlieren. Rühren Sie sehr leicht von hand für mindestens 45 Minuten.
8. Bereiten Sie Harz/Propylenoxid in einem Verhältnis von 1:2 und 1:1 zu und 3 % Beschleuniger (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
9. Inkubieren Sie das Gewebe in der 1:2 Einbettung Lösung aus Schritt 3,8 für 2 h und dann in der 1:1-Einbettungs-Lösung von 3,8 Schritt für 2 h bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad.
10. Legen Sie das Gewebe in flachen Polypropylen Geschirr, decken Sie das Gewebe mit frischen Harz enthält 3 % Beschleuniger und heilen Sie die eingebetteten Gewebe bei 65-85 ° C für 12-24 h.
11. Das eingebettete Gewebe auf Raumtemperatur kühlen Sie ab und entfernen Sie die Harz eingebettete Proben aus Polypropylen Gerichte.

4. Auswahl der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter für die Quantitative Analyse

1. Zuordnung den Bereich von Interesse
   1. Wählen Sie einen Ort von Interesse (z.B. Hippocampus oder Kleinhirn) und lokalisieren Sie Bereich im Abschnitt Atlas zu, indem Sie das Bild aus der Atlas (Schritt 3.5), der in diesem Bereich befinden.
   2. Skizzieren Sie die Ränder des Bereichs des Interesses auf dem Abschnitt und überlagern Sie finden/diese Region grenzt an die Harz-Probe.
   3. Kratzer die Grenzen des Bereichs des Interesses (z.B. Hippocampus oder Kleinhirn) auf das Harz-Präparat, mit einer feinen Nadel-Lehre (26 G, 1 In).
   4. Erhitzen Sie das Harz Exemplar auf 85 ° C in einem Ofen zu erweichen das Harz zum Trimmen oder alternativ ein trimmen Gerät, eine dünne Klinge oder Sandpapier.
   5. Den gewünschten Bereich aus der Harz-Probe mit einer Rasierklinge Verbrauchssteuern (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die Probe auf halten Bars aus Acrylglas der erforderlichen Kaliber z.B. mit (Durchmesser 8 mm) und einer Länge von 1 cm mit Kleber. Schneiden Sie die montierte Probe für halb- und ultradünnen schneiden.
   6. Bereiten Sie Ansät (0,75 µm) und ultradünnen (70 nm) Abschnitte des Löschbereichs mit einem regungsloses: setzen Sie ihn auf 1,5 mm/s für 0,75 µm Dicke und 0,7 mm/s für 70 nm Dicke.
   7. Sammeln Sie die Ansät Abschnitte auf Glas-Trägern und färben Sie die Abschnitte mit 1 % Toluidin blau mit PBS-Puffer (für 4 min).
   8. Waschen Sie die Abschnitte mehrmals in entionisiertem Wasser. Untersuchen Sie die gefärbten Abschnitte unter dem Lichtmikroskop mit 4 X (NA 0,1 ∞ /-), 10 x (NA von 0,22 ∞/0,17), 40 x (NA von 0,65 ∞/0,17) und 100 x (NA 1.25 ∞/0,17) Ziele.
   9. Sammeln Sie ultradünnen Abschnitte auf Nickel-Gitter. Vorbehaltlich der Netze TEM bei 180 kV und bei 3, 200 X, 6, 000 X und/oder 8.000 X Vergrößerung.
2. TEM Analyse
   1. Wählen Sie die Ultrastrukturforschung Parameter von Interesse für die quantitative Analyse der TEM (z. B. Boutons mit Bläschen und Mitochondrien oder nonmyelinated und Markhaltige Axone) und nehmen Sie TEM Bilder dieser Parameter unter 3, 500 X, 6.000 x und/oder 8.000 X Vergrößerung.

Ergebnisse

Für die zuverlässige und schnelle Anästhesie von Mäusen zahlreiche sicherheitstechnischen Kenngrößen galten, und ein optimierten Arbeitsbereich des Referats Anästhesie erwies sich als ausreichend (Abb. 1A). Das Gerät soll die Mischung aus flüssigen Isoflurane und Umgebungsluft mit einer Genauigkeit erforderlich für eine erfolgreiche Operation auf kleine Tiere wie Mäuse und Ratten zu kontrollieren. Luft und Isofluran im Verdampfer e...

Diskussion

Ein entscheidender Schritt in der Gebärmutter Transduktion ist das Injektionsverfahren. Die präzise Injektion in die Hirnkammern oder in einen anderen Bereich des Interesses erfordert Erfahrung und praktische Fähigkeiten. Je dünner der Microcapillary Spitze, kann weniger Gewebeschäden auftreten; Dies ist jedoch auf Kosten der Einspritzdruck erhöht. Im Gegensatz zu den in der Gebärmutter Elektroporation^19,20,21,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol	Serva	36975
26 G x 1'' needle	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)	UKE (Viral Core Facility)	-	For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	low gelling agarose
Air Pump	Biomedical Instruments (Univentor)	Eheim 100
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium	Biomedical Instruments (Univentor)	-
buprenorphine	Temgesic	ampules	painkiller
capillaries	Science-Products	GB100TF-10	with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride	Fluka	44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)	FST	11203-23
electric shaver	Phillips	-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)	Ethicon	-	polyamide
eye lubricant	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)	FST	13011-12
Heparin-Natrium	Ratiopharm		25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)	FST	14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations	Biomedical Instruments (Univentor)	-
isoflurane (Attane)	JD medical		inhalation anesthesia
LED RGB lights	Cameo	CLQS15RGBW	LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E	Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller	Science-Products	P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)	FST	13010-12
Nickel grids, 200 mesh	Ted Pella	1GC200
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219
Propylene oxide	Fluka	82320
razor blades	Schick	87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)	Merial GmbH	-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Technovit 4004 two components glue	Kulzer
Telemacrodevice	Canon	-	Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97	Sutter Instruments	-
thin vibrating razor blade device	Krup	-	with Szabo thin blades
toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
Transmission electron microscope C20	Phillips	-	up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Ultracut E	Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Univentor Scavenger	Biomedical Instruments (Univentor)	8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)	FST	15009-08