הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

Summary

השילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים התמרה חושית ברחם היא גישה חזקה ללמוד שינויים מורפולוגיים במוצא ultrastructure בסדר של מערכת העצבים במהלך הפיתוח. שיטה משולבת זו מאפשרת תובנות שינויים בפרטים מבניים שבבסיס והנוירולוגיה הפלסטית ביחס ייצוגן הטופוגרפי.

Abstract

המחקר הנוכחי משלב התמרה חושית ברחם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מכוון ניתוח morphometrical מדויק של פרמטרים ultrastructural במבנים הטופוגרפי חד משמעית מזוהה, מושפע חלבון עניין זה הוא הציג לתוך האורגניזם באמצעות העברה ויראלי. גישה משולבת זו מאפשר מעבר חלק מ macrostructural כדי ultrastructural זיהוי על ידי מפות ניווט הטופוגרפי הבאים באטלס רקמות. מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של הרקמה בעם רחם-transduced חושף את ultrastructure בסדר של מורכב ואת הפרמטרים שלה פלסטיות, כגון אזורים בוטון סינפטית בחתך רוחב, מספר הסינפטיות, המיטוכונדריה בתוך פרופיל בוטון, האורך של קשרים סינפטיים, אזורים עצב בחתך רוחב, העובי של עטיפות המיאלין, המספר של מיאלין lamellae ואזורי בחתך רוחב של המיטוכונדריה פרופילים. הניתוח של פרמטרים אלה מגלה חיוני תובנות שינויים של ultrastructural פלסטיות באזורים של מערכת העצבים המושפעות על-ידי העברת ויראלי הבונה גנטי. שיטה משולבת זו לא ניתן להשתמש רק ללמוד על השפעה ישירה של מולקולות מהונדס גנטית ו/או סמים על פלסטיות עצביים אבל פותח גם את האפשרות ללמוד חילוץ ברחם פלסטיות עצביים (למשל, בהקשר של מחלות ניווניות).

Introduction

פוטון לא יכולים לחדור של דגימות רקמה ודק במיוחד בכיתה עומק של אלקטרון. זה מייחסת יתרונות שלא יסולא בפז TEM בלכידת ננומטר תמונות ברזולוציה של המבנים המרשימים לעומת טכניקות במיקרוסקופ אור. לדוגמה, TEM מאפשר החזיית תאיים organelles כגון המיטוכונדריה, melanosomes, סוגים שונים של הפרשה בגרגרים, microtubules, שמתרגם, cilia, microvilli, והצמתים המערכת (תא השטח מתמחה), בפרט synapses מערכת העצבים^1,2,3,4. המטרה הכוללת של מתודולוגי במחקר הוא ההכרה ultrastructural של שינויים פלסטיות עצבית במהלך הפיתוח על הפרעה לפני הלידה על-ידי שילוב טכניקות המדינה-of-the-art של התמרה חושית ברחם, TEM. לשווק מקודד חלבונים עניין יש כבר transduced ברחם לתוך מערכת העצבים המרכזית^5,6,7, כולל את חוט השדרה⁶. למשל, נעשה שימוש ברחם התמרה חושית בשילוב עם TEM לימוד ההשפעה של המולקולה אדהזיה תא L1 על למידה פלסטיות בעכברים חשוכת-L1, בפרט לגבי יחסי הגומלין בין L1 חלבונים גרעיניים קולטן מוטורית בנוירונים אסטרוציטומה⁷.

הניתוח של פרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית דורש מידע מדויק על הלוקליזציה של האזורים הקטנים בתוך מערכת העצבים. לכן, זה מספיק כדי לתאר פרטים ultrastructural ונטיותיהם הטופוגרפי המדויק לגבי מבנים אחרים. במחקר הנוכחי, מוצגת שיטת הכנה ספציפיים מכוון החקירה נתונים היסטוריים של תחומים ברורים מורפולוגי המבוסס על אור והן מיקרוסקופ אלקטרונים. גישה זו משלבת מספר טכניקות של רקמות מניפולציה, החל ברחם התמרה חושית של העכבר המוח ואת חוט השדרה ואחריו יציבות זלוף, הטבעה-עובש, עיבוד הרקמה TEM. צעד חיוני כללה בין את ההטמעה, העיבוד של הרקמה עבור TEM הוא התיעוד של הרקמה, בטכניקה הפרעות השתקפות אור המאפשר מדויק microphotographic והגדלה נמוכה תיעוד רקמות דגימות^8,9,10. טכניקה זו שולבו הגישה הנוכחית, מאפשר לחוקרים לבחון פרטים הטופוגרפי ומבניים של רקמות עצבים משטחים ושל הדגימה פרופילים פרוסה לפני שלהם לקראת TEM.

מסגרת מיוחדת עבור חלוקתה המוח כולו מתאים קואורדינטות stereotaxic. מסגרת זו מועילה מורפולוגי תלת מימדי (3D) בבניה מחדש של אזורי ברקמות עצבים, והוא יכול לשמש לניתוח morphometric. Macrographs הסעיפים מטמיעים מוקצים קואורדינטות הטופוגרפי, ולבנות הסעיפים ממוספרים באופן סדרתי מפות אטלס רקמות.

לאחר שרף עיבוד, הרקמה מוטבע הוא למחלקה למקטעים זגוגית (< 70 ננומטר) המכילים אזורים נבחרים, לפי המפות של הרי האטלס הרקמות הנ ל. הסעיפים זגוגית ותוחלת TEM להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פלסטיות פרמטרים (למשל, חתך פרופיל תחומי עם העיתון ons סינפטית או סיבי עצב) של התוכן שלהם ושל אנשי קשר למבנים הסמוכים בתוך המתחם מורכב.

בשיטת המתוארים בזאת, חלקה המעבר macrostructures מטמיעים מיקרו - ו nanostructures היתרי השוואתי מעמיק של פלסטיות מורפולוגית עצביים לאחר בתוך הרחם התמרה חושית לפתח לחוצה מערכת.

Protocol

כל ההליכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדות האתיקה בעלי חיים מוסדיים של הברית הפדרלית של המבורג, Nordrhein-Westfalen, גרמניה.  השתמש בכלים סטריליים, כפפות מגן ומעילים aseptic לאורך כל תהליך כירורגי.

1. ב. פשוט תאכל התמרה חושית

1. להכין וירוס adeno-הקשורים סוג 1 (AAV1) קידוד עבור היעד הרצוי (4 x 10¹¹ ויראלי חלקיקים/µL של AAV1) בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב- pH 7.4. להוסיף 0.1 mg/µL מהר ירוק ולהשאיר את התערובת AAV1-מהיר-ירוק-37 מעלות צלזיוס.
2. להכין טיפ נימי דק לצורה הרצויה (8 מ מ אורך, בקוטר חיצוני מיקרומטר 80 ו מבפנים בקוטר של 50 מיקרומטר), שימוש של פולר micropipette (הגדרות: לחץ = 500, חום = 700, משיכה = 0, מהירות = 80, זמן = 200, לראות את טבלה של חומרים < / c1 >). שבור את הקצה של נים כך שהוא 4-5 מ מ.
3. להרכיב על צינור ליניקת (44 ס מ x 0.7 ס מ) עם קצה נימי, האחות µL 15 של תערובת AAV1-מהיר-ירוק לתוך נימי.
4. לשמור על הנבדקים בעלי חיים בטמפרטורה קבועה הגוף הפיזיולוגיות של 37 מעלות צלזיוס לאורך ההליך כולו.
5. למקם את עכבר C57Bl/6 בהריון (עובריים יום 14.5) אל החדר preincubation, עזים ומתנגד את העכבר עם גזי איזופלוריין 4% (עם קצב זרימת אוויר הנפחי של 0.6-0.8 L/min).
6. . Subcutaneously, להזריק הבופרנורפין (0.1 mg/kg של משקל גוף).
7. הנח את העכבר anesthetized בצלחת כירורגי prewarmed (37 מעלות צלזיוס).
8. מכסים את העיניים עם חומר סיכה.
9. להתאים את העכבר עם המסכה הרדמה (גזי איזופלוריין 1.5% בקצב זרימת אוויר הנפחי של 0.6-0.8 L/min) על צלחת כירורגי, לגלח האזור בעור בטן. יש לנגב את האזור מגולח עם 3 X 75% אתנול ולאחר מכן עם betadine פתרון.
   הערה: לפקח על אופן הפעולה של הנשימה של העכבר anesthetized ללא הרף. התאם את ריכוז הגז איזופלוריין על פי התבנית שאיפה-נשיפה של העכבר.
10. בדוק היעדר רפלקס plantar לוחצת פרקי האצבעות כפת האחוריות של העכבר.
11. פתיחת חלל הבטן לפי כשתפסת את העור עם איריס משונן מעוגל מלקחיים (10 ס מ) וחיתוך העור לאורך mediana לינאה במספריים ישר טונגסטן קרביד (10 ס מ), ולאחר מכן, על-ידי כשתפסת הקיר הצפק עם פינצטה דומונט ישר (12 ס מ, 0.2 מ מ x 0.12 מ"מ), חיתוך חומה לאורך לינאה אלבה עם ואנה ישר מספריים (8 ס"מ).
12. מניחים חתיכת סרט פרפין fenestrated על פתיחת בטן ולתקן את הסרט בשני הקצוות עם מלקחיים hemostatic מיקרו-יתושים (12.5 ס מ, מעוקל).
13. לחשוף את הקרניים הרחם באמצעות מכשיר דמוי כפית כדי למנוע פגיעה העוברים בתוך הרחם קרניים. לטפטף מספר טיפות של PBS (37 ° C) על קרנות הרחם ולבדוק את העוברים על נזקים או מומים בתוך השק. הרחם.
14. תעד את ההזמנה ואת המיקום של העוברים הקרניים הרחם. להפוך את העוברים בזהירות בתוך השק. הרחם עד לתנוחה הרצויה עבור הזרקה.
15. מזריקים µL 1-2 של תערובת AAV1-מהיר-ירוק על-ידי בדיקה חזותית של ההזרקה (למשל, החדרים במוח) וחדירת צבע תחת stereomicroscope.
16. לתעד את העוברים מוזרק ולמקם את הקרניים הרחם עם העוברים מוזרק בחזרה לתוך חלל הבטן.
17. לטפטף מספר טיפות של PBS (37 מעלות צלזיוס) לתוך חלל הבטן. לסגור את החלל על ידי תפירת הקיר הצפק (להשתמש פוליאמיד 6 0-בגודל של התפרים) ועור (להשתמש פוליאמיד 3 0-בגודל של התפרים), שימוש יתוש hemostatic מלקחיים של האלסטד (12.5 ס מ, מעוקל). לחלופין, השתמש דפוס קטע פשוט או תפר מפלדת/סיכות כדי לסגור את חלל הבטן של העור.

2. Telemacrophotography של רקמות מבודד

1. הכנה של מאגרי
   1. להכין מאגר של Sörensen (1 ליטר) מאת g 14.95 הממיס של Na-₂-HPO-₄ ו- g 2.18₂פו ח'₄ ב- 1 ליטר של מים מזוקקים תחת ערבוב במהירות של 200 סל ד. עבור זלוף של המנוח ההיריון הגורים ו/או כלבים. אחרי לידה פרקי זמן, להשתמש בגודל המתאים של מחטים להזרקה הבטן או intragastric ולוודא כי הריכוז של ההרדמה מסוף סודיום פנטוברביטל אינו עולה על 180 מ"ג / שוקלים ק ג של הגוף.
   2. להכין פתרון קיבוע של Mugnaini (5 L) על ידי חימום 500 מ"ל של מים מזוקקים עד 75 ° C, להוסיף 50 גר' אבקת paraformaldehyde תחת ערבוב ב 200 סל"ד, הוספת µL 200 של 5 N NaOH, הוספת מל 1,500 מאגר של Sörensen, 1,750 מ ל מים מזוקקים , ו- 500 מ"ל של 25% גלוטראלדהיד. למלא עד 5,000 מ ל מים מזוקקים. השתמש מאגר הסופי זלוף.
      הערה: להכין פתרון קיבוע של Mugnaini מתחת למכסה המנוע, משקפיים מגן ולהימנע האדים. להוסיף מתילן כחול (0.05 g/L) עבור ויזואליזציה טובה יותר של זלוף.
2. בידוד זלוף ורקמות העכבר
   1. Transcardially perfuse העכברים בהריון שנושאים את העוברים transduced (במקרה של מחקרים העובר) או את הפאבים transduced נולד בגיל הרצוי (למשל, כמחנכת יום 24) על פי נהלי^{6,7, 11,12,13,14,15,16,17}, שימוש בקרום הבטן פנטל מסוף הרדמה (200 mg/kg של משקל גוף).
   2. להזריק את transcardially עכברים עם הפרין פתרון (500 U) באמצעות G 26, 1 המחט ו, לפני קיבוע, להשרות העכברים transcardially עם 10 מ"ל של PBS כדי לשטוף את הדם מן הגוף, perfuse אותם transcardially עם 30 מ של 40 ° C prewarmed Mugnaini קיבוע פתרון.
      הערה: עבור עכברים בוגרים, לבצע זלוף רטרוגרדית חלופית של דרך העורק¹⁴.
   3. לבודד את הרקמה perfused עניין (למשל, כל המוח או חוט השדרה), postfix הרקמה לפחות 10 מ"ל של פתרון קיבוע של Mugnaini עוד 24 שעות-4 מעלות צלזיוס.
   4. לשטוף את הרקמה ב 10 מ"ל של PBS עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר.
3. הטבעה agarose, בתוספת התיעוד ואת חלוקתה
   1. התאם את הרקמה מבודד (למשל, כל המוח) בתוך מסגרת מיוחדת עם לשחזור אופטים זווית^8,9,10. לחלופין, להשתמש vibratome עם עובי חיתוך מתכווננת.
   2. המקום רקמת העצבים במסגרת, להתאים את הרקמה עבור telemacrography, ולתעד את נקודות הציון.
   3. להכין 3% התכה נמוכה הטבעה agarose בינוני: מוסיפים 3 גר' agarose 100 מ של המאגר של Sörensen, מחממים את התערובת בתוך אמבט מים עד 90 מעלות צלזיוס.
   4. יוצקים 3% agarose (30 ° C) בתוך המסגרת הכוללת את הרקמה. מכסה את המסגרת עם גוש מתכת חמה, המתן עד התקשות. במהלך התקשות, להשתמש telemacrographic המכשירים לשיקוף הרקמה מוטבע והקואורדינטות שלה בתוך המסגרת.
   5. העבר את הרקמה agarose-מוטבע לתוך מסגרת חיתוך פערים התואם הקואורדינטות של המסגרת הראשונה.
   6. לחתוך את הרקמה מוטבע למקטעים של עובי הרצוי (למשל, כ- 1.5 מ מ) עם מכשיר עם תער דק וקל רוטטת (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: כדי לשפר את הדאייה. הסכין גילוח, לטפטף כמה טיפות גליצרין אל הרקמה מוטבעים.
   7. תמונה בכל קטע רקמה של PBS ולאסוף את התמונות לתוך תיקיה.

3. הכנה של רקמה מבודדת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

הערה: בצע שלבים נוספים של דגירה במנות זכוכית עם מכסים closable בחוזקה על פלטפורמה חזק מתחת למכסה המנוע.

1. לשטוף את קטעי רקמה 2 x 30 דקות ב- PBS. דגירה הסעיפים בתמיסה מימית אוסמיום ארבע-חמצני 2% (OsO₄) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
   התראה: אוסמיום ארבע-חמצני רעיל, שעשויות להזיק יותר. כשזה מגיע במגע עם העור.
2. לשטוף את הסעיפים osmicated 2 x 30 דקות ב- PBS.
3. דגירה בסעיפים 30%, 50% ו- 70% אתנול בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות (אופציונלי: דגירה 70% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה).
4. תמונת דגימות osmicated 70% אתנול תחת LED RGB אור^8,9,10 (2 x 15 W) חלה על המדגם שמאל, צד ימין בזווית של 45 °. השתמש מנות שחור רקע שחור משעמם כדי למזער את הפיזור ואת את השתקפות האור בזמן תאורה.
   התראה: אל תאפשר את המקטע להתייבש במהלך דימות.
5. צור אטלס של תמונות סעיף עם נקודות הציון על ידי איסוף תמונות בסדרה בתיקיה.
6. דגירה דגימות ב 100% אתנול (2 x במשך 30 דקות) ו 100% פרופילן אוקסיד (2 x במשך 30 דקות) בטמפרטורת החדר.
   התראה: אל תאפשר הסעיפים להתייבש בזמן שינוי פתרונות.
7. מערבבים 260 מ של שרף עם 240 מיליליטר אנהידריד dodecenylsuccinic בתוך כלי זכוכית תוך ערבוב בעדינות עם בר זכוכית. בדוק מעת לעת inhomogeneity, בועות, מריחות. מאוד בעדינות, מערבבים ביד למשך לפחות 45 דקות.
8. להכין שרף/פרופילן אוקסיד על יחס של 1:2 ו- 1:1, הוספת מאיץ 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
9. דגירה הרקמה 1:2 הטמעת הפתרון משלב 3.8 כבר שעתיים ולאחר מכן בפתרון ההטבעה 1:1 מ שלב 3.8 כבר שעתיים בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב.
10. למקם את הרקמה במנות במול פוליפרופילן, לכסות את הרקמה עם שרף טריים המכיל 3% מאיץ, לרפא את הרקמה מוטבעים ב- 65-85 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות.
11. לקרר את הרקמה מוטבע לטמפרטורת החדר דגימות שרף-מוטבע ולהסיר הכלים פוליפרופילן.

4. בחירת והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural פרמטרים עבור ניתוח כמותי

1. מיפוי האזור עניין
   1. לבחור אזור התעניינות (למשל, ההיפוקמפוס או המוח הקטן), בתרגום האזור בהרי האטלס מקטע על-ידי בחירת התמונה של הרי האטלס (שלב 3.5) המכיל את האזור הזה.
   2. לשרטט את גבולות האזור של ריבית על גבי התמונה סעיף ו חפש להרכיב אלה גבולות אזור על גבי הדגימה שרף.
   3. שריטה-מארק לגבולות האזור של ריבית (למשל, ההיפוקמפוס או המוח הקטן) על הדגימה שרף, באמצעות מחט בסדר לאמוד (26 G, מס ' 1).
   4. מחממים את הדגימה שרף עד 85 מעלות צלזיוס בתנור כדי לרכך את השרף עבור חיתוך או, לחלופין, להשתמש מכשיר חיתוך, להב דק או נייר זכוכית.
   5. לסלק את תחום העניין מן הדגימה שרף עם סכין גילוח (ראה טבלה של חומרים). הר הדגימה בהחזקת פסי זכוכית אקרילית של הענק נדרשת, למשל עם (בקוטר של 8 מ מ), באורך של 1 ס מ עם דבק. חתוך את הדגימה הנטען עבור חצי ואת חלוקתה ודק במיוחד.
   6. הכנת semithin (0.75 מיקרומטר) ו ודק במיוחד (70 ננומטר) מקטעים של האזור המקוצץ באמצעות ultramicrotome של: להגדיר אותו ב- 1.5 מ מ/s עבור עובי 0.75 מיקרומטר וב -0.7 מ מ/s עבור 70 עובי ננומטר.
   7. לאסוף את הסעיפים semithin על זכוכית נשאים, כתם הסעיפים עם 1% טולדין כחולה ב- PBS (עבור 4 דקות).
   8. לשטוף את המקטעים מספר פעמים במים יונים. לבחון את החלקים המוכתמים במיקרוסקופ אור באמצעות 4 x (נה של 0.1 ∞ /-), 10 x (NA של 0.22 ∞/0.17), 40 x (NA של 0.65 ∞/0.17), ו- 100 x (NA של 1.25 ∞/0.17) מטרות.
   9. איסוף מקטעים ודק במיוחד על רשתות ניקל. נושא הרשתות TEM ב 180 kV ו- 3, 200 x, 6, 000 x, ו/או 8,000 x הגדלה.
2. ניתוח TEM
   1. לבחור את הפרמטרים ultrastructural עניין לניתוח TEM כמותית (עם העיתון ons, למשל עם שלפוחית, המיטוכונדריה או אקסונים ו ו nonmyelinated), TEM תמונות של פרמטרים אלה מתחת לגיל 3, 500 x, 6,000 x ו/או 8,000 x הגדלה.

תוצאות

הרדמה מהיר ואמין של עכברים, בטיחות פרמטרים רבים נחשבו, סביבת העבודה של אופטימיזציה של יחידת הרדמה התבררה נאותה (איור 1א'). יחידת נועד לשלוט התערובת של איזופלוריין נוזלי, אויר עם דיוק הנדרש לניתוח מוצלח-חיים קטנים, כגון עכברים וחולדות. אוויר, איזופל...

Discussion

צעד מכריע של התמרה חושית ברחם הוא ההליך הזרקה. הזרקה מדויקת לתוך המוח החדרים או תחום התעניינות נוסף דורש ניסיון ומיומנות מעשית. רזה הטיפ microcapillary, הנזק רקמות עלולות להתרחש; עם זאת, זה על חשבון הגדלת הזרקה בלחץ. בניגוד אלקטרופורציה ברחם^19,20,21<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol	Serva	36975
26 G x 1'' needle	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)	UKE (Viral Core Facility)	-	For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	low gelling agarose
Air Pump	Biomedical Instruments (Univentor)	Eheim 100
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium	Biomedical Instruments (Univentor)	-
buprenorphine	Temgesic	ampules	painkiller
capillaries	Science-Products	GB100TF-10	with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride	Fluka	44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)	FST	11203-23
electric shaver	Phillips	-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)	Ethicon	-	polyamide
eye lubricant	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)	FST	13011-12
Heparin-Natrium	Ratiopharm		25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)	FST	14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations	Biomedical Instruments (Univentor)	-
isoflurane (Attane)	JD medical		inhalation anesthesia
LED RGB lights	Cameo	CLQS15RGBW	LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E	Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller	Science-Products	P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)	FST	13010-12
Nickel grids, 200 mesh	Ted Pella	1GC200
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219
Propylene oxide	Fluka	82320
razor blades	Schick	87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)	Merial GmbH	-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Technovit 4004 two components glue	Kulzer
Telemacrodevice	Canon	-	Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97	Sutter Instruments	-
thin vibrating razor blade device	Krup	-	with Szabo thin blades
toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
Transmission electron microscope C20	Phillips	-	up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Ultracut E	Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Univentor Scavenger	Biomedical Instruments (Univentor)	8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)	FST	15009-08