Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

Resumo

A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.

Resumo

O presente estudo combina transdução no útero com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) com o objetivo de uma análise morfométrica precisos dos parâmetros ultra-estruturais em inequivocamente identificadas estruturas topográficas, afetados por uma proteína de interesse que é introduzido no organismo através de transferência viral. Esta abordagem combinada permite uma transição suave de macrostructural para identificação ultraestrutural pelos seguintes mapas topográficos de navegação em um atlas de tecido. Microscopia eletrônica de alta resolução do tecido em-utero-transfectadas revela a ultraestrutura bem o neurópilo e seus parâmetros de plasticidade, como áreas seccionadas bouton sinápticos, o número de vesículas sinápticas e mitocôndrias dentro de um Perfil de Bouton, o comprimento de contatos sinápticos, áreas axonal seccionadas, a espessura das bainhas de mielina, o número de lamelas de mielina e seccionadas áreas de perfis de mitocôndrias. A análise destes parâmetros revela essenciais insights sobre alterações de plasticidade ultra-estruturais nas áreas do sistema nervoso que são afetados pela transferência viral da construção de genética. Este método combinado não só pode ser usado para estudar o efeito directo de biomoléculas geneticamente modificadas e/ou drogas na plasticidade neuronal, mas também abre a possibilidade de estudar o resgate no útero de plasticidade neuronal (por exemplo, no contexto da doenças neurodegenerativas).

Introdução

O fóton não pode penetrar uma amostra de tecido ultrafinos no grau de profundidade de um elétron. Isto atribui vantagens inestimáveis para TEM na captura de imagens de resolução nanômetros de belas estruturas quando comparado às técnicas de microscopia de luz. Por exemplo, TEM permite a visualização de organelas intracelulares, tais como mitocôndrias, melanossomas e vários tipos de grânulos secretórios, microtúbulos, microfilamentos, cílios, microvilli e junções intercelulares (superfície de célula especializações), em particular as sinapses no sistema nervoso^1,2,3,4. O objetivo geral do presente estudo metodológico é o reconhecimento ultra-estrutural do mudanças na plasticidade neural durante o desenvolvimento, após interferência de pré-natal, combinando as técnicas do estado-da-arte de transdução no útero e TEM. Viralmente codificadas proteínas de interesse tem sido transfectadas no útero para o sistema nervoso central^5,6,7, incluindo a medula espinhal⁶. Por exemplo, no útero transdução em combinação com a temperatura tem sido usada por estudando o efeito da molécula de adesão celular L1 na aprendizagem plasticidade em camundongos deficientes em L1, em particular no que se refere a interação entre L1 e proteínas do receptor nuclear de motor em neurônios Cerebelares⁷.

A análise dos parâmetros de neuroplasticidade requer informações precisas sobre a localização das áreas menores dentro do sistema nervoso. Portanto, é adequada descrever detalhes ultraestrutural e sua orientação topográfica exata em relação a outras estruturas. No presente estudo, é apresentado um método específico preparatório visando a investigação detalhada de áreas morfológicas distintas com base em luz e microscopia eletrônica. Esta abordagem combina várias técnicas de manipulação do tecido, começando no útero transdução da medula espinhal e cérebro de rato e seguido por fixação de perfusão, molde-incorporação e processamento de tecido para dez. Um passo essencial incluído entre a incorporação e a transformação do tecido para TEM é a documentação do tecido, usando a técnica de reflexão da luz de interferência que permite a documentação precisa de microphotographic e baixo-ampliação de espécimes do tecido^8,9,10. Incorporada a presente abordagem, esta técnica permite que pesquisadores examinar detalhes topográficos e estruturais das superfícies de tecido nervoso e de perfis de fatia de amostra antes da sua preparação para a temperatura.

Um frame especial para secionar todo cérebro corresponde a coordenadas estereotáxicos. Este quadro beneficia morfológica reconstrução tridimensional (3D) de áreas no tecido nervoso e pode ser usado para Análise morfométrica. Os macrographs das seções visualizadas são atribuídos coordenadas topográficas e as seções numeradas em série construir mapas em um atlas de tecido.

Após processamento de resina, o tecido incorporado é seccionado em seções ultrathin (< 70 nm) que contém áreas selecionadas, de acordo com os mapas do atlas tecido acima mencionados. As seções ultra-finas estão sujeitos a temperatura para obter imagens de alta resolução dos parâmetros de plasticidade (e.g., seção transversal perfil áreas de boutons sinápticas ou fibras axonal) do seu conteúdo e de contatos para estruturas vizinhas, dentro do complexo neurópilo.

Com o método descrito neste documento, a transição suave de macrostructures visualizado para micro e nanoestruturas permite comparativos estudos aprofundados de plasticidade neuronal morfológica depois no utero transdução do desenvolvimento nervosa sistema.

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Protocolo

Todos os procedimentos em assuntos animais foram aprovados pelas comissões institucionais de ética animal dos Estados Federados de Hamburgo e Nordrhein-Westfalen, Alemanha.  Use instrumentos estéreis, luvas e casacos assépticos ao longo de todo o procedimento cirúrgico.

1. no Utero transdução

1. Prepare o tipo de vírus adeno-associado 1 (AAV1) que codifica para o destino desejado (4 x 10¹¹ viral partículas / µ l de AAV1) em tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4. Adicionar 0,1 mg / µ l Fast Green e manter a mistura de AAV1-Fast-verde a 37 ° C.
2. Preparar uma fina ponta capilar com a forma desejada (8 mm de comprimento, com um diâmetro externo de 80 µm e um interior diâmetro de 50 µm), usando um extrator de micropipeta (configurações: pressão = 500, calor = 700, puxar = 0, velocidade = 80, tempo = 200, consulte a tabela de materiais < / c1 >). Quebre a ponta do capilar para que é de 4-5 mm.
3. Montar um tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) com a ponta capilar e Aspire 15 µ l da mistura verde-AAV1-Fast para o capilar.
4. Manter os animais sujeitos a uma temperatura de corpo fisiológico constante de 37 ° C ao longo de todo o procedimento.
5. Coloque um grávida rato C57Bl/6 (dia embrionário 14,5) na câmara de pré-incubação e anestesiar o mouse com isoflurano gasoso de 4% (com uma taxa de fluxo volumétrico de 0,6-0,8 L/min).
6. Injecte por via subcutânea, a buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal).
7. Coloque o mouse anestesiado na placa cirúrgica escaldada (37 ° C).
8. Cubra os olhos com um lubrificante.
9. Ajustar o mouse com a máscara de anestesia (gasosos isoflurano 1,5% a uma taxa de fluxo volumétrico de 0,6-0,8 L/min) na placa cirúrgica e barba na região da pele abdominal. Limpe a região depilada com 3 X 75% de etanol e, em seguida, com solução de betadine.
   Nota: Monitore o comportamento de respiração do rato anestesiado continuamente. Ajuste a concentração do gás de acordo com o padrão de inalação-exalação do mouse isoflurano.
10. Para verificar a ausência do reflexo plantar apertando as falanges da pata traseira do mouse.
11. Abrir a cavidade abdominal, segurando a pele com pinças curvas íris serrilhada (10 cm) e corte a pele ao longo da mediana de linea com tesoura reta carboneto de tungstênio (10 cm) e em seguida, agarrando-se a parede peritoneal com pinça reta de Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 milímetros) e corte da parede ao longo da linea alba com Vanna reta tesouras (8 cm).
12. Um pedaço de filme de parafina fenestrado sobre a abertura abdominal e fixar o filme em ambas as extremidades com pinça hemostática de micro-mosquito (12,5 cm, curvada).
13. Expor os cornos uterinos com um colher-como o dispositivo para não danificar os embriões dentro os cornos uterinos. Pingar algumas gotas de PBS (37 ° C) sobre os cornos uterinos e inspecionar os embriões por danos ou malformações dentro do sac uterina.
14. Documente a ordem e a posição dos embriões nos cornos uterinos. Transformar os embriões cuidadosamente dentro do sac uterino até atingir a posição desejada para a injeção.
15. Injecte 1-2 µ l da mistura verde-AAV1-Fast inspecionando visualmente o local da injeção (por exemplo, ventrículos do cérebro) e a penetração do corante sob um estereomicroscópio.
16. Documentar os embriões injetados e colocar os cornos uterinos com os embriões injetados volta na cavidade abdominal.
17. Pinga algumas gotas de PBS (37 ° C) na cavidade abdominal. Feche a cavidade por sutura da parede peritoneal (uso poliamida 6-0 tamanho suturas) e a pele (uso poliamida 3-0 tamanho suturas), usando a pinça hemostática de Halsted mosquito (12,5 cm, curvada). Como alternativa, use um padrão simples interrompido ou sutura/grampos de aço inoxidável para fechar a cavidade abdominal e a pele.

2. Telemacrophotography de tecidos isolados

1. Preparação de buffers
   1. Prepare o tampão do Sörensen (1 L) por dissolução 14,95 g de Na₂HPO₄ e 2,18 g de KH₂PO₄ em 1 litro de água destilada sob agitação a 200 rpm. Para perfusão de tarde filhotes de gestação e/ou filhotes no pós-parto a períodos de tempo, use um tamanho adequado de agulhas para injeção abdominal ou intragástrico e certifique-se que a concentração da anestesia terminal de sódio pentobarbital não ultrapasse 180 mg / kg de peso do corpo.
   2. Preparar a solução de fixação do Mugnaini (5 L) pelo aquecimento de 500 mL de água destilada para 75 ° C e adicionar 50 g de pó de paraformaldeído sob agitação a 200 rpm, adicionando 200 µ l de 5 N NaOH, adicionando 1.500 mL de tampão de Sörensen, 1.750 mL de água destilada e 500 mL de 25% de glutaraldeído. Encha até 5.000 mL com água destilada. Use este buffer final para perfusão.
      Nota: Preparar a solução de fixação do Mugnaini sob o capô, usar óculos de protecção e evitar emanações. Adicione o azul de metileno (0,05 g/L) para uma melhor visualização da perfusão.
2. Isolamento de perfusão e tecido de mouse
   1. Transcardially perfundir os ratos grávidas que carregam os embriões transduzidos (no caso de estudos de embrião) ou os pubs transduzidos nasceu com a idade desejada (por exemplo, pós-Natal dia 24), de acordo com os procedimentos padrão^{6,7, 11,12,13,14,15,16,17}, utilizando pentobarbital de sódio terminal intraperitoneal anestesia (200 mg/kg de peso corporal).
   2. Injetar o transcardially de ratos com solução de heparina (500 U) usando um 26 G, 1 na agulha e, antes da fixação, infundir os ratos transcardially com 10 mL de PBS para lavar o sangue do corpo e perfundi-los transcardially com 30 mL do 40 ° C pré-aquecido Mugnaini solução de fixação.
      Nota: Para os ratos adultos, execute uma alternativa perfusão retrógrada através da aorta abdominal,¹⁴.
   3. Isolar o tecido perfundido de interesse (por exemplo, todo o cérebro ou medula espinhal) e sufixo o tecido em pelo menos 10 mL da solução de fixação do Mugnaini para outro 24 h a 4 ° C.
   4. Lave o tecido em 10 mL de PBS para 3h em temperatura ambiente.
3. Incorporação em agarose, além de documentação e corte
   1. Ajuste o tecido isolado (por exemplo, cérebro) em um quadro especial com um reprodutíveis corte ângulo^8,9,10. Como alternativa, use um vibratome com uma espessura de corte ajustável.
   2. Coloque o tecido nervoso no quadro, ajustar o tecido para telemacrography e documentar as coordenadas.
   3. Prepare 3% suporte de incorporação de agarose de baixo ponto de fusão: Adicionar 3 g de agarose em 100 mL de tampão de Sörensen e aquecer a mistura em um banho de água a 90 ° C.
   4. Despeje a agarose a 3% (30 ° C) no quadro que contém o tecido. Cobrir a moldura com um bloco de metal quente e esperar até que seja endurecimento. Durante o endurecimento, use dispositivos de telemacrographic para o tecido incorporado e suas coordenadas dentro do quadro da imagem.
   5. Transferi o tecido de agarose-incorporado em um quadro com as lacunas de corte correspondente para as coordenadas do primeiro quadro.
   6. Corte o tecido incorporado em seções de espessura desejada (por exemplo, 1,5 mm) com um dispositivo com uma lâmina fina e vibração (ver Tabela de materiais).
      Nota: Para melhorar o deslizamento da lâmina da navalha, pinga algumas gotas de glicerina para o tecido incorporado.
   7. Imagem de cada seção de tecido em PBS e coletar as imagens em uma pasta.

3. preparação do tecido isolado para microscopia eletrônica de transmissão

Nota: Execute todos os novos passos de incubação em pratos de vidro com tampas firmemente afixadas em uma plataforma de agitação sob o capô.

1. Lave as secções de tecido para 2 x 30 min em PBS. Incube as secções em solução a 2% aquosa tetróxido de ósmio (OsO₄) por 2 h à temperatura ambiente.
   Atenção: Tetróxido de ósmio é tóxico e pode ser prejudicial quando ele entra em contato com a pele.
2. Lave as seções osmicated para 2 x 30 min em PBS.
3. Incubar as secções em 30%, 50% e 70% de etanol à temperatura ambiente por 10-15 min (opcional: incubar em etanol a 70% em 4 ° C durante a noite).
4. Imagem do osmicated espécimes em etanol a 70% sob LED RGB luz^8,9,10 (2 x 15 W) aplicados à amostra da esquerda e da direita num ângulo de 45 °. Use pratos pretos e um fundo preto fosco para minimizar o espalhamento e a reflexão da luz durante a iluminação.
   Atenção: Não permita que a seção secar durante a imagem latente.
5. Crie um atlas das imagens seção com coordenadas através da recolha de imagens em série em uma pasta.
6. Incube as amostras em 100% de etanol (2 x por 30 min) e 100% óxido de propileno (2 x por 30 min) à temperatura ambiente.
   Atenção: Não permita que as seções para secar enquanto alterar soluções.
7. Mix de 260 mL de resina com 240 mL de anidrido dodecenylsuccinic em um recipiente de vidro, agitando-se suavemente com uma barra de vidro. Verifique periodicamente para homogeneidade, bolhas e manchas. Muito suavemente, mexa com a mão pelo menos 45 min.
8. Prepare-se óxido de propileno/resina na proporção de 1:2 e 1:1 e adicionar 3% de accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
9. Incube o tecido no 1:2 incorporação de solução do passo 3.8 para 2 h e depois na solução 1:1 incorporação da etapa 3.8 para 2 h à temperatura ambiente em uma roda giratória.
10. Coloque o tecido em polipropileno liso pratos, cubra o tecido com resina fresca contendo 3% de accelerator e curar o tecido incorporado em 65-85 ° C por 12-24 h.
11. Arrefecer o tecido incorporado à temperatura e retirar as amostras de resina-incorporado os pratos de polipropileno.

4. seleção de neuroplasticidade ultraestrutural parâmetros para análise quantitativa

1. Mapeamento da área de interesse
   1. Escolha uma área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) e localizar a área no atlas de seção, escolhendo a imagem do atlas (passo 3.5) que contém esta área.
   2. Esboçar as fronteiras da área de interesse para a imagem de seção e encontrar/sobrepor estas fronteiras da região para a amostra de resina.
   3. Zero-marca as fronteiras da área de interesse (por exemplo, hipocampo ou cerebelo) sobre a amostra de resina, usando um medidor de agulha fina (26 G, 1 in).
   4. Aquece a amostra de resina a 85 ° C em um forno para amolecer a resina para o aparamento ou, alternativamente, usar um dispositivo de corte, uma lâmina fina ou lixa.
   5. A área de interesse, a amostra de resina com uma lâmina de barbear impostos especiais de consumo (ver Tabela de materiais). Monte o espécime segurando barras de vidro acrílico do calibre necessário por exemplo, com (diâmetro de 8 mm) e um comprimento de 1 cm com cola. Desbaste a amostra montada para semie ultrafinos de seccionamento.
   6. Preparar semithin (0,75 µm) e ultrafinos (70 nm) seções da área aparada usando um ultramicrotome: defini-la a 1,5 mm/s para 0,75 µm de espessura e a 0,7 mm/s para a espessura de 70 nm.
   7. Recolher as seções semithin em suportes de vidro e as seções com toluidina 1% de mancha azul em PBS (para 4 min).
   8. Lave as seções várias vezes em água desionizada. Examinar as seções manchadas ao microscópio de luz usando 4x (nd de 0.1 ∞ /-), 10 x (de 0.22 ∞/0.17), 40 x (de 0.65 ∞/0.17) e 100 x objetivos (de 1.25 ∞/0.17).
   9. Recolha seções ultra-finas nas grades de níquel. Submeter as grades a temperatura em 180 kV e a 3, 200 x, 6, 000 x, e/ou ampliação de x 8.000.
2. Análise de temperatura
   1. Escolha os parâmetros ultraestrutural de interesse para a análise quantitativa da temperatura (por exemplo, boutons com vesículas e mitocôndrias ou axônios mielinizados e nonmyelinated) e tomar TEM imagens desses parâmetros abaixo dos 3, 500 x, x 6.000 e/ou ampliação de x 8.000.

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Resultados

Para anestesia é confiável e rápida de ratos, inúmeros parâmetros de segurança foram considerados, e uma área de trabalho otimizada da unidade de anestesia provou para ser adequado (Figura 1A). A unidade é projetada para controlar a mistura de isoflurano líquido e ar ambiente com uma precisão exigida para a bem sucedida cirurgia em pequenos animais, como camundongos e ratos. Ar e isoflurano são misturados no vaporizador de acordo c...

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Discussão

Um passo crucial de transdução no útero é o procedimento de injeção. A injeção precisa em ventrículos cerebrais ou em outra área de interesse requer experiência e habilidade de hands-on. A mais fina a ponta de conta, o menor dano tecidual pode ocorrer; no entanto, isto é à custa do aumento da pressão de injeção. Em contraste com eletroporação no útero^19,20,21,22, a taxa de so...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol	Serva	36975
26 G x 1'' needle	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pump	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)	UKE (Viral Core Facility)	-	For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	low gelling agarose
Air Pump	Biomedical Instruments (Univentor)	Eheim 100
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	resin for embedding of tissue
aspirator tune assemblies	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium	Biomedical Instruments (Univentor)	-
buprenorphine	Temgesic	ampules	painkiller
capillaries	Science-Products	GB100TF-10	with fillament
Dodecenylsuccinic anhydride	Fluka	44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)	FST	11203-23
electric shaver	Phillips	-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)	Ethicon	-	polyamide
eye lubricant	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectors	Biomedical Instruments (Univentor)	8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)	FST	13011-12
Heparin-Natrium	Ratiopharm		25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)	FST	14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations	Biomedical Instruments (Univentor)	-
isoflurane (Attane)	JD medical		inhalation anesthesia
LED RGB lights	Cameo	CLQS15RGBW	LEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM E	Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette puller	Science-Products	P-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)	FST	13010-12
Nickel grids, 200 mesh	Ted Pella	1GC200
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219
Propylene oxide	Fluka	82320
razor blades	Schick	87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)	Merial GmbH	-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Technovit 4004 two components glue	Kulzer
Telemacrodevice	Canon	-	Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97	Sutter Instruments	-
thin vibrating razor blade device	Krup	-	with Szabo thin blades
toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
Transmission electron microscope C20	Phillips	-	up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Ultracut E	Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Univentor Scavenger	Biomedical Instruments (Univentor)	8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)	FST	15009-08