JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Сочетание просвечивающей электронной микроскопии и внутриутробно трансдукции представляет собой мощный подход для изучения морфологических изменений в тонкой Ультраструктура нервной системы во время разработки. Этот комбинированный метод позволяет глубокое понимание изменений в структурные детали лежащие в основе нейропластичности отношении их топографические представительства.

Аннотация

Настоящее исследование объединяет внутриутробно трансдукция с просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) направленных на точное морфометрических анализ ультраструктурных параметров однозначно определены топографических структур, пострадавших от протеин интереса что вводится в организм через вирусный передачи. Этот комбинированный подход позволяет для плавного перехода от макроструктурных ультраструктурных идентификации следующих топографических навигационных карт в атласе ткани. Высоким разрешением электронной микроскопии в utero преобразованы ткани раскрывает прекрасные Ультраструктура Нейропиль и его пластичности параметров, таких как районы поперечном синаптических бутона, количество синаптических пузырьков и митохондрий в течение Бутон профиль, длину синаптических контактов, поперечном аксональное районов, толщина миелиновой оболочки, количество ламели миелина и поперечном областях митохондрий профилей. Анализ этих параметров показывает основные понимание изменений ультраструктурных пластичности в районах нервной системы, которые страдают от вирусных передачи генетической конструкции. Этот комбинированный метод может использоваться не только для изучения прямое воздействие генетически биомолекул или наркотики на пластичность нейронов, но также открывает возможность для изучения в утробе спасения пластичности нейрональных (например, в контексте нейродегенеративные заболевания).

Введение

Не фотон может проникать ультратонких ткани образца в глубине класса электрона. Это атрибуты бесценный преимущества ТЕА в захват нанометра резолюции изображений тонких структур по сравнению с методами световой микроскопии. К примеру ТЕА позволяет для визуализации внутриклеточных органелл например митохондрий, меланосомы и различные виды секреторных гранул, микротрубочки, микрофиламенты, реснички, микроворсинки и межклеточные соединения (клеточной поверхности специализации), в частности синапсов в нервной системы,12,3,4. Общая цель настоящего методологические исследования признается ультраструктурные изменения пластичности нейронных во время разработки после пренатальной вмешательства путем объединения последнему слову техники внутриутробно трансдукция и ТЕА. Вирусно закодированные протеинов интереса были преобразованы в утробе матери в центральной нервной системе5,6,7, включая спинного6. Например в утробе трансдукции в сочетании с ТЕА был использован для изучения воздействия молекулы адгезии клеток L1 на Мотор обучения пластичности в L1-недостаточным мышей, в частности в том, что касается взаимосвязи между L1 и ядерных рецепторов белки в7нейронов мозжечка.

Анализ параметров нейропластичности требует точной информации о локализации маленьких областей внутри нервной системы. Таким образом это достаточно для описания ультраструктурных деталей и их точные топографические ориентации в отношении других структур. В настоящем исследовании представлен конкретные подготовительные метод, направленный на подробное расследование различных морфологических областей на основе света и электронной микроскопии. Этот подход сочетает в себе несколько методов манипуляции ткани, начиная с внутриутробно трансдукции мыши головного и спинного мозга и следуют перфузии фиксации, встраивание плесень и обработка ткани для ТЕА. Важным шагом, включенных между внедрением и обработки ткани для ТЕА является документация ткани, используя метод отражения света вмешательства, который позволяет для точного microphotographic и низким увеличение документации ткани образцов8,9,10. Включены в нынешний подход, эта техника позволяет исследователям изучить топографические и структурные детали нервной ткани поверхностей и профилей фрагмент образца до их подготовки к ТЕА.

Особый кадр для разрезания весь мозг соответствует стереотаксического координат. Эта рамка выгоды морфологических трехмерные (3D) реконструкции районов в нервной ткани и может быть использован для анализа морфометрических. Macrographs визуализация Секции назначаются топографических координат, и последовательно пронумерованными разделами построения карт в атласе ткани.

После обработки смолы, встроенных ткани секционного ультратонких разделов (< 70 нм) содержащий отдельных областях, согласно карты выше ткани атласа. Ультратонких секций подвергаются ТЕА для получения изображения с высоким разрешением пластичности параметров (например, сечение профиля области синаптической boutons или аксональное волокон), их содержание и контактов в соседние структуры внутри комплекса Нейропиль.

С методом, описанным в настоящем документе плавный переход от визуализированных макростроение микро - и наноструктур позволяет сравнительных углубленные исследования морфологическая пластичность нейронов после в утробе матери трансдукции развивающихся нервной системы.

протокол

Все процедуры на животных темы были одобрены комитетами институциональных животных этики федеральных штатов Гамбурга и Северный Рейн-Вестфалия, Германия.  Используйте стерильные инструменты, защитные перчатки и асептических пальто на протяжении всего хирургическая процедура.

1. в утробе матери трансдукция

  1. Подготовьте аденоассоциированный вирус типа 1 (AAV1) кодирования для нужного целевого (4 х 1011 вирусных частиц/мкл AAV1) фосфат амортизированное saline (PBS) при рН 7,4. Добавить 0,1 мг/мкл быстро зеленый и сохранить AAV1-быстро-зеленый смесь при 37 ° C.
  2. Подготовить кончик тонкий капилляров с желаемой формы (8 мм в длину, с внешним диаметром 80 мкм и внутренний диаметр 50 мкм), с помощью съемника микропипеткой (параметры: давление = 500, тепло = 700, тянуть = 0, скорость = 80, время = 200, см таблица материалов < / c1 >). Разбейте кончик капилляра, так что это 4-5 мм.
  3. Соберите Аспиратор трубки (44 cm х 0,7 см) с капиллярной кончиком и аспирационная 15 мкл AAV1-быстро-зеленый смеси в капилляр.
  4. Держите животных подданных постоянной физиологической тела при температуре 37 ° C на протяжении всей процедуры.
  5. Место беременной C57Bl/6 мышь (эмбриональных день 14,5) в preincubation камеру и анестезировать мыши с газообразным изофлюрановая 4% (с коэффициентом объемного потока воздуха 0,6-0,8 Л/мин).
  6. Подкожно придать бупренорфин (0,1 мг/кг веса тела).
  7. Место наркотизированных мыши на пластину подогретую хирургические (37 ° C).
  8. Покрытия глаза с смазки.
  9. Подходят мышь с маской анестезии (газообразных изофлюрановая 1,5% в размере объемный расход воздуха 0,6-0,8 Л/мин) на хирургические пластины и брить область брюшной кожи. Протрите бритая региона с 3 X 75% этанола и затем Бетадин-раствор.
    Примечание: Непрерывно контролировать дыхание поведение наркотизированных мыши. Регулировка концентрации газа изофлюрановая по схеме ингаляции выдох мыши.
  10. Проверьте отсутствие подошвенный рефлекс, сжимая задние лапы фаланг мыши.
  11. Откройте брюшной полости, сжимая кожи пинцетом (10 см) изогнутых зубчатые Ирис и резки кожи вдоль linea медиана ножницами прямо из карбида вольфрама (10 см), а затем путем захвата брюшной стенки с прямыми Дюмон пинцетом (12 см, 0,2 мм x 0,12 мм) и резки стены вдоль linea alba с прямыми Vanna ножницы (8 см).
  12. Поместите кусок пленки перфорированную парафина на брюшной открытия и исправить фильм на обоих концах с микро комаров гемостатический пинцет (12,5 см, изогнутая).
  13. Разоблачить маточные рожки с устройством ложка как во избежание повреждения эмбрионов внутри маточные рожки. Капать несколько капель PBS (37 ° C) на маточные рожки и осмотрите эмбрионов за ущерб или пороков развития внутри матки sac.
  14. Документ, порядок и положение эмбрионы в рога матки. Поверните эмбрионов тщательно внутри матки sac, пока не будет достигнуто нужное положение для инъекций.
  15. Придать 1-2 мкл смеси AAV1-быстро-зеленый, визуально изучив инъекции (например, желудочков мозга) и проникновения красителя под стереомикроскопом.
  16. Документ вводится эмбрионов и место маточные рожки с эмбрионы вводят обратно в брюшной полости.
  17. Капать несколько капель PBS (37 ° C) в брюшную полость. Закройте полость, ушивания брюшной стены (Использование полиамида 6-0-размера шва) и кожи (Использование полиамида швы размером 3-0), используя Хальстед комаров гемостатический пинцет (12,5 см, изогнутая). Кроме того используйте шаблон простой прерван или из нержавеющей стали шовный материал/скобы для закрытия брюшной полости и кожу.

2. Telemacrophotography отдельных тканей

  1. Подготовка буферов
    1. Подготовка Sörensen в буфер (1 Л) путем растворения 14.95 г Na2HPO4 и 2.18 г х2PO4 в 1 Л дистиллированной воды при помешивании в 200 об/мин. Для перфузии в конце беременности щенков и щенков в послеродовой периоды времени, использовать соответствующий размер игл для инъекций брюшной или внутрижелудочного и убедитесь, что концентрация терминала Натрий Пентобарбитал анестезии не превышает 180 мг / кг веса тела.
    2. Готовят раствор Mugnaini в фиксации (5 Л) путем нагрева 500 мл дистиллированной воды до 75 ° C и добавление 50 г порошка параформальдегида под перемешивания на 200 об/мин, добавив 200 мкл 5 N NaOH, добавив 1500 мл Sörensen буфера, 1750 мл дистиллированной воды и 500 мл 25%-го раствора. Заполните до 5000 мл дистиллированной водой. Используйте этот последний буфер для перфузии.
      Примечание: Приготовляют раствор фиксации Mugnaini под капотом, носить защитные очки и избегать дыма. Добавьте Метиленовый синий (0,05 г/Л) для лучшей визуализации перфузии.
  2. Изоляция перфузии и ткани мыши
    1. Transcardially perfuse беременных мышей, которые несут transduced эмбрионов (в случае исследования эмбриона) или род transduced пабов на желаемый возраст (например, послеродовой день 24) в соответствии со стандартными процедурами6,7, 11,12,13,14,,1516,17, используя внутрибрюшинного терминала Натрий Пентобарбитал анестезия (200 мг/кг веса тела).
    2. Придать transcardially мышей с раствором гепарина (500 U) с помощью 26 G, 1 игла и, до фиксации, влить мышей transcardially с 10 мл PBS вымывать крови из организма, и perfuse их transcardially с 30 мл 40 ° C подогретую Mugnaini Фиксация решение.
      Примечание: Для взрослых мышей выполните альтернативные Ретроградная перфузии через брюшной аорты14.
    3. Изолировать перфузии тканей интерес (например, весь головного или спинного мозга) и постфиксная ткани в по крайней мере 10 мл раствора Mugnaini в фиксации для другой 24 ч при 4 ° C.
    4. Вымойте ткань в 10 мл PBS для 3 ч при комнатной температуре.
  3. Встраивание в агарозы, плюс документации и секционирование
    1. Настройка изолированных ткани (например, весь мозг) в специальной рамке с воспроизводимые секущей угол8,9,10. Кроме того используйте vibratome с регулируемым резки толщиной.
    2. Разместите нервной ткани в кадре, отрегулировать ткани для telemacrography и документировать координаты.
    3. Подготовка 3% легкоплавких агарозы встраивание среднего: добавить 3 g агарозы в 100 мл Sörensen буфера и тепло смесь на водяной бане до 90 ° C.
    4. Залейте 3% агарозном (30 ° C) в кадр, содержащий ткань. Обложка кадр с теплой металлические блок и подождать до тех пор, пока это закалка. При закалке, используйте telemacrographic устройства для изображения встроенных ткани и его координаты в пределах фрейма.
    5. Передача агарозы врезанных тканей в рамку с резки пробелы, соответствующие координаты первого кадра.
    6. Нарезать разделы требуемой толщины (например, 1,5 мм) встроенных ткани с устройством тонкой и вибрационные лезвие бритвы (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Чтобы улучшить скольжение лезвия бритвы, капать несколько капель глицерина на встроенных ткани.
    7. Образ каждого раздела ткани в PBS и собирать изображения в папку.

3. Подготовка изолированной ткани просвечивающей электронной микроскопии

Примечание: Выполните все дальнейшие инкубации в стеклянных блюдах крышками плотно замыкаем на тряску платформе под капотом.

  1. Вымойте разделов ткани для 2 x 30 мин в PBS. Инкубируйте разделы в 2% раствор водный осмия тетраоксид (4OsO) за 2 ч при комнатной температуре.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Осмия тетраоксид является токсичным и может быть вредным, когда он приходит в контакт с кожей.
  2. Мыть osmicated секции для 2 x 30 мин в PBS.
  3. Инкубировать разделы в 30%, 50% и 70% этанола при комнатной температуре за 10-15 мин (необязательно: инкубировать в 70% этанол на 4 ° C на ночь).
  4. Изображение osmicated образцов в 70% этанол под LED RGB света8,9,10 (2 x 15 Вт) применяется к выборке из левой и правой стороны под углом 45 °. Используйте черный блюда и тупой черный фон, чтобы минимизировать рассеяния и отражение света во время освещения.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не позволяют секции высохнуть во время визуализации.
  5. Создайте Атлас изображений раздел с координатами, собирая изображения в серии в папке.
  6. Проинкубируйте образцы в 100% этанола (2 x 30 минут) и 100% пропилена оксида (2 x 30 минут) при комнатной температуре.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не позволяйте разделы высохнуть при смене решений.
  7. Смешайте 260 мл смолы с 240 мл dodecenylsuccinic ангидрида в стеклянный сосуд помешивая осторожно с стеклянный бар. Периодически проверяйте наличие неоднородности, пузыри и мазки. Очень аккуратно перемешайте вручную, по крайней мере 45 мин.
  8. Подготовка смолы/пропилена оксида в соотношении 1:2 и 1:1 и добавить 3% ускоритель (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
  9. Инкубируйте ткани в 1:2, внедрение решения от шаг 3,8 за 2 ч, а затем в растворе 1:1 внедрения от шаг 3,8 втечение 2 ч при комнатной температуре на вращающееся колесо.
  10. Место ткани в плоской полипропиленовые блюда, крышка ткани с свежей смолы, содержащие 3% ускоритель и вылечить встроенных ткани на 65-85 ° C для 12-24 ч.
  11. Охладить встроенных ткани до комнатной температуры и удалить образцы смолы встроенный из полипропилена блюда.

4. Выбор параметров ультраструктурных нейропластичности для количественного анализа

  1. Отображение области интереса
    1. Выберите область интересов (например, гиппокамп или мозжечка) и локализовать область в разделе Атлас, выбрав изображение из атласа (шаг 3.5), содержащий эту область.
    2. Эскиз границы области интересов раздел образ и найти/наложить эти границы региона на образец смолы.
    3. Скретч Марк границы области интересов (например, гиппокамп или мозжечка) смолы образца, с помощью тонкой иглы датчика (26 G, 1 в).
    4. Тепла смолы образца до 85 ° C в духовке смягчить смолы для обрезки или, альтернативно, использовать устройство обрезки, тонкие лезвия или наждачной бумагой.
    5. Акцизный области интересов от смолы образца с лезвием бритвы (см. Таблицу материалы). Смонтируйте образца на проведении баров из акрилового стекла требуется калибра, например, с (диаметром 8 мм) и длиной 1 см с клеем. Трим подключенные образца для полу - и ультратонких секционирование.
    6. Подготовить полутонкая (0,75 мкм) и ультратонких (70 нм) секции обрезанные области с использованием ultramicrotome: установить его на 1,5 мм/сек для 0,75 микрон толщины и при 70 нм толщиной 0,7 мм/с.
    7. Собирать полутонкая разделы на стекло перевозчиков и выведение секции с 1% толуидиновый синий в PBS (за 4 мин).
    8. Вымойте разделы несколько раз в деионизированной воде. Изучить окрашенных участков под световой микроскоп, используя 4 x (NA 0.1 ∞ /-), 10 x (NA 0.22 ∞/0.17), 40 x (NA 0,65 ∞/0.17) и 100 x (NA 1,25 ∞/0.17) целей.
    9. Соберите ультратонких разделы на никель сетках. Учетом сетки ТЕА на 180 кв и на 3, 200 x, 6, 000 x, и/или 8000 x увеличение.
  2. Анализ ТЕА
    1. Выберите ультраструктурных параметры интерес для количественного анализа ТЕА (например, boutons с везикулы и митохондрии или циклопоид и безмиелиновые аксонов) и ТЕА изображения этих параметров под 3, 500 x, 6000 x и/или 8000 x увеличение.

Результаты

Для надежной и быстрой анестезии мышей были рассмотрены многочисленные параметры безопасности, и оптимизированный Рабочей группы анестезия оказалась адекватных (рис. 1A). Прибор предназначен для управления смесь жидких изофлюрановая и окруж?...

Обсуждение

Решающий шаг в утробе трансдукции является процедура инъекции. Точное инъекции в желудочки мозга или в другую область интересов требует опыта и практических навыков. Чем тоньше кончик микрокапиллярной, может произойти меньше повреждение тканей; Однако это за счет увеличения давления ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят коллег животных фонда на медицинском факультете, Рурского университета Бохума, за их поддержку и животных ухода.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenolServa36975
26 G x 1'' needleHenke-Sass, Wolf GmbH
410 Anaesthesia Unit for air pumpBiomedical Instruments (Univentor)8323102
Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1)UKE (Viral Core Facility)-For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54.
AgaroseSigma-AldrichA9414low gelling agarose
Air PumpBiomedical Instruments (Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9resin for embedding of tissue
aspirator tune assembliesSigma-AldrichA5177-5EA
Breathing Mask Mouse Anodized AluminiumBiomedical Instruments (Univentor)-
buprenorphineTemgesicampulespainkiller
capillariesScience-ProductsGB100TF-10with fillament
Dodecenylsuccinic anhydrideFluka44160
Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm)FST11203-23
electric shaverPhillips-
Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0)Ethicon-polyamide
eye lubricantBepanthene-
Fast GreenSigma-AldrichF7252for visualization of injected liquids
Gas Routing Switch 4/2 connectorsBiomedical Instruments (Univentor)8433020
halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight)FST13011-12
Heparin-NatriumRatiopharm25 000 I.E./5 mL
Induction box for mice
with horizontally moving lid.
Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Wall thickness: 6 mm		Biomedical Instruments (Univentor)-
iris forceps (10 cm, curved, serrated)FST14007-14
iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide)FST14501-14
Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm
Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm.
Heating area: 190 mm x 90 mm
The removal of the isoflurane escaping
the breathing mask is downwards in compliance with the
regulations		Biomedical Instruments (Univentor)-
isoflurane (Attane)JD medicalinhalation anesthesia
LED RGB lightsCameoCLQS15RGBWLEDs 2 x 15 W
Light microscope Basic DM ELeica-4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
micropipette pullerScience-ProductsP-97
Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved)FST13010-12
Nickel grids, 200 meshTed Pella1GC200
Osmium (VIII)-oxidDegussa73219
Propylene oxideFluka82320
razor bladesSchick87-10489
Sodium pentobarbital (Narcoren)Merial GmbH-
TC01mR 1-Channal temperature controller with feedbackBiomedical Instruments (Univentor)-
Technovit 4004 two components glueKulzer
TelemacrodeviceCanon-Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand.
Thermopuller P-97Sutter Instruments-
thin vibrating razor blade deviceKrup-with Szabo thin blades
toluidine blueSigma-Aldrich89640
Transmission electron microscope C20Phillips-up to 200 kV
Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts
Outer diameter: 6 mm
Inner diameter: 4 mm
Wa
ll thickness: 1 mm		Biomedical Instruments (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramicrotome
Univentor ScavengerBiomedical Instruments (Univentor)8338001
Vannas scissors (8 cm, straight)FST15009-08

Ссылки

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены