利用 niper-cas9 在不损失目标活动的情况下通过定向进化, 最大限度地减少 crispr-cas9 的非目标效应

摘要

在这里, 我们提出了一个优化 crispr-cas9 的协议, 以实现更高的特异性, 而不会丢失目标活动。我们使用一种称为狙击手屏幕的定向进化方法来查找具有所需特征的突变 cas9。sanicper-cas9 与截断的单导轨 rna 兼容, 并以核糖核酸蛋白格式交付, 这是实现更高特性的著名策略。

摘要

将聚集在规则间隔的短回文重复 (crispr) 相关蛋白 9 (cas9) 发展成治疗方式, 需要避免其潜在的有害的离目标影响。已经制定了几种方法来减少这种影响。在这里, 我们提出了一个基于大肠杆菌定向进化方法, 称为狙击手屏幕, 以获得一个 cas9 变种与优化的特异性和保留目标上的活性, 称为狙击手-cas9。使用狙击手屏幕, 可以同时执行正面和负面选择。屏幕也可以与其他单引导 rna (sgrna) 序列重复, 以丰富真正的正面命中。通过使用 cmv-plteto1 双启动子来表示 cas9 变种, 可以在哺乳动物细胞中快速检查集合库的性能。还介绍了提高狙击手-cas9 特异性的方法。首先, 使用截断的 sgrna 以前已被证明可以增加 cas9 的特异性。与其他工程 cas9 不同, ─ cas9 与截断的 sgrna 结合使用时, 保留了野生类型 (wt) 水平的目标上活动。其次, 在不影响其目标上活动的情况下, 可以以核糖核酸蛋白 (rnp) 格式 (rnp) 形式 (而不是质粒形式) 交付 saniper-cas9。

引言

本文旨在结合不同的策略, 提高 cas9 的特异性。已经制定了各种方法来避免 crispr-cas9 的非目标影响。例如, 截断的 sgrna 可用于实现更高的特异性¹。此外, cas9 传递的方法可以从质粒格式转变为 rnp 格式, 以获得更高的特异性²。根据前面描述的合理设计,对化脓性链球菌 cas9 (spcas9) 蛋白的特定氨基酸残基进行了改性.或者 , 氨基酸残基被随机改变, 并使用酵母⁶或大肠杆菌^7,8 筛选系统确定了特异性最高的 cas9 变种。

然而, 许多小组报告说, cas9 变种工程使用的设计, 以削弱非特异性相互作用之间的 cas9 和基板表现出低目标^{上的活性 7,8,9,10,11,12}. 我们开发了一个基于大肠杆菌的定向进化系统--狙击手屏幕, 以随机筛选出突变的 cas9 变种。与酵母系统相比,大肠杆菌筛选系统具有优势, 因为大肠杆菌的翻倍时间较快, 转化效率较高。

在狙击手屏幕中使用了基于三种不同质粒和一个整合到大肠杆菌基因组中的感兴趣基因的负选择和阳性选择。cas9 变种是在 cmv-plteto1 双启动子系统下表达的, 这个系统的低拷贝数质粒 , 因此在大肠杆菌中识别的候选体可以在哺乳动物细胞中进行测试, 而无需亚克隆。利用 tn7 转座子系统将 goi 引入大肠杆菌基因组. sgrna 质粒, 其中包含对温度敏感的复制来源, 表达了针对goi的 sgrna;然而, sgrna 和goi序列并不完全匹配。一个完全匹配的 sgrna 靶点存在于含有 ccdb基因的第三个质粒上, 该质粒编码一种毒害旋转酶的致命产物。在该系统中, 表达具有高离目标活动的 cas9 变种的细胞被移除, 因为双链断裂 (dsb) 被引入位于基因组 dna 中的不匹配位点。另一方面, 表达 cas9 变异的细胞也被删除, 低靶向活性的ccdB基因表达。通过改变环水四环素 (atc) 的浓度, 可以改变 cas9 变种的表达水平, 从而调整选择力。

我们推断, 在基因组 dna 而不是质粒中定位不匹配的 sgrna 靶点将增加系统的灵敏度。这种方法的优点是只有一个基因组位点, 而在单个大肠杆菌细胞内会有许多质粒, 每个质粒都包含一个目标位点。

利用这个系统, 我们确定了一个 cas9 变种, sanper-cas9, 它显示了 wt 级的目标活动, 并减少了与 wt cas9 相比的非目标活动。通过使用截断的 sgrna 或基于 rnp 的交付而不是基于等离子体的交付, niper-cas9 可以实现更高的特异性比。

研究方案

1. 将人的 goi整合到 bw25141大肠杆菌菌株中

1. 政府的克隆
   1. 聚合酶链反应 (pcr) 通过含有不同候选靶点的标准 pcr 方法扩增含有不同候选靶点的人类goi的 500 bp 长度, 引物中含有 noi 和 xhoi 限制性酶位点。
      注: 在这个实验中, goi是人类emx1基因。
   2. 用 noi 和 xhoi 限制性酶消化 pcr^产物和 pgrgg13 载体。
   3. 凝胶净化所需的碎片 (500 bp 和 12 kb)。
   4. 使用 t4 连接酶将碎片连接在一起。为此, 请将50纳克消化的 pgrg36 和 6 ng pcr 插入物混合在含有1x 连接酶缓冲液和 0.5 u 连接酶的20μl 的反应体积中。在室温下过夜。
   5. 将结扎质粒转化为 dh5-α主管细胞。在32°c 时在含有氨匹西林 (100μgsml) 的鲁里亚肉汤 (lb) 琼脂板上生长所产生的转化物, 并孵育一夜。拿起一个菌落, 在含有氨匹西林的 lb 介质中生长。使用市售的微精制备试剂盒, 从大肠杆菌中分离质粒 dna。通过对从微型质粒制剂 (微型制备) 13 中获得的质粒进行排序, 确认 goi 片段的插入 .
2. bw25141-goi的准备
   1. 将得到的 pgrg36-goi 质粒转化为 bw25141大肠杆菌菌株.必须使用 bw25141 菌株, 以最大限度地减少假阳性菌落的数量。
   2. 在32°c 的情况下, 在 lb 缓冲液中生长转化后的细胞。goi入到 bw25141 菌株 ( bw25141 - goi ) 的基因组dna 中。使用标准的 pgrg36协议13从 bw25141-goi应变中取出 pgrg36-goi 质粒.简单地说, 稀释一个群体 (约 10^7倍), 并在42°c 的 lb 板上种植一夜。将菌落流在 lb 板上, 并在42°c 下过夜生长。
   3. 使用 pgrg36 协议中建议的引物, 用菌落 pcr 确认正确的goi插入: 5 '-gggggggggggt-3 ' 和 5 '-gggggggtcatga-3 '。底漆放大基因组 dna 插入点, 生成的 pcr 产品的大小将为 904 bp 加上插入的大小 (在这种情况下为 500 bp)。
   4. 准备具有电能力的 bw25141-goi 电池 (详细的协议在3.2.6 步骤中描述– 3.2.10).

2. cas9 变型库的编制

1. 图书馆准备
   1. 将 cas9 向量⁷转换为商业大肠杆菌突变体应变 (材料表), 并按照制造商的说明获取变体库 (突变体库)。
   2. 使用容易出错的 pcr 试剂盒 (材料表), 在 cas9 载体中对整个 wt cas9 序列执行容易出错的 pcr。
      注: 在 sanper-cas9 病例中采用了低错误率协议, 以避免干扰蛋白质的原始功能。
   3. 用适当的限制性酶消化 cas9 载体。凝胶净化 pcr 产物 (从步骤 2.1.2) 和消化的主干。
      注: spcas9 基因的大小约为 4.3 kb。选择 xhoi 和 kpni 来消化在 sanper-cas9 病例中使用的 pblc-spcas9 载体。
   4. 通过等温体外重组, 将主干片段 (从步骤 2.1.3) 和插入物扩增, 使用容易出错的 pcr (从步骤 2.1.3) 进行重组。
      注: 需要500纳克以上的主干才能获得高浓度的库 (容易出错的 pcr [ep] 库)。在 saners-cas9 病例 (ep 库 i 和 ii) 中, 使用了两个不同的容易出错的 pcr 试剂盒来准备 ep 库。
   5. 使用 dna 净化试剂盒 (材料表) 从组件中纯化产品 (从步骤 2.1.4)。用6μl 的无核水 (nfw) 测定 dna 浓度。
   6. 将 cas9 库向量的 500多个 ng (用于三个库) 转化为 50μl的电子主管大肠杆菌细胞 (材料表)。请参阅 3.2.1 3.2.4 步骤中的电穿孔协议。对于此库的准备, 请使用 1 ml 的 soc 介质, 而不是每50μl 的主管细胞250μl。
   7. 使含有回收细胞的混合物与 soc 介质一起稀释 1: 100、1:1000 和1:10000。将稀释后的细胞贴在100毫米 lb 琼脂板上, 辅以氯霉素 (12.5 μg/ml)。将剩余的细胞放在245毫米^{的 2}板上。在37°c 下隔夜孵化。
2. 库复杂性的计算
   1. 通过凝胶文档系统或普通数码相机拍摄稀释板。运行 opencfu 软件¹⁴并上传稀释板的照片。在盘子内设置计数区域, 并去除假菌落。
   2. 手动乘以菌落数的稀释因子, 以获得变压器的原始数量。将这些数字转换为对数形式 (基数 10)。计算平均值以确定库的复杂性。
   3. 当获得所需的复杂度值时, 使用摊铺机和20毫升的 lb 补充, 将所有菌落收集在245毫米方板上 (从步骤 2.1.7)。不要种植聚集的菌落, 并使用商业的 midiprep 试剂盒净化质粒库。
      注: 库的复杂性越高, 效果越好。当 nniper-cas9 被确定时, 每个图书馆的多样性达到了 3 x 10^6.

3. 对不断发展的 cas9 进行积极和消极的筛查9

1. 目标选择与质粒构建
   1. 在goi中选择目标 sgrna 间隔序列。在随机核苷酸中替换一个或两个残基, 以产生不匹配的序列。
      注: 在 saniper-cas9 病例中使用了人类emx1目标地点 3 (gagggaggagagagagaa 与 ggg pam)。以下是所使用的不匹配序列: gaggaggaggagagagaa、gagggagagagagagaa 和 gagccaggagagagagaa。
   2. 使用标准寡核苷酸 (寡核苷酸) 克隆程序将不匹配的序列 (参见步骤 3.1.1) 插入 sgrna 质粒 7.
   3. 将 3 ' 端的 p11 不匹配序列插入 p11-lacy-wtx1 (材料表), 使用标准寡核苷酸克隆程序¹⁵构建ccdb质粒。
2. 狙击手筛选大肠杆菌主管细胞的制备
   1. 解冻 bw25141-goi 在冰上的电功能细胞.
   2. 加入 1 ng 每个ccdb质粒和 sgrna 质粒, 双错配成50μl 的解冻 w25141-goi 细胞.通过移液轻轻混合细胞, 并将其移动到一个预冷的0.1 厘米的电穿孔立方。
   3. 通过电穿孔用两个质粒转化大肠杆菌。电穿孔后立即加入250μl 的 soc 介质。轻轻移液溶液将细胞和培养基混合。将混合物转移到 1.5 ml 微离心管中。
      注: 为了获得最大效率, 请将电压设置为 1.80 kv, 运行时应在4.8 毫秒和5.0 毫秒之间。
   4. 恢复转化后的细胞, 并在32°c 孵育 1小时, 轻轻晃动。
   5. 在氨基青霉素 (50μg/ml)/卡那霉素 (25μg/ml) lb 琼脂板上的片125μl。将剩余的细胞贴在环甘霉素 (1.5 mg/arabinose) lb 琼脂板 (ccdb表达条件) 上。在32°c 下隔夜孵化。
   6. 检查ccdb表达条件板上是否没有幸存的菌落。使用摊铺机从培养条件板中采集菌落 , 并在 250 毫升的超最佳肉汤 ( ) 培养基中培养菌种 , 辅以50μgl的氨基青霉素和25μgl的卡那霉素 , 在32°c时 , 轻轻晃动。
   7. 当光学密度达到600纳米 (od₆₀₀) 时, 将烧瓶冷却在冰上。准备预冷的脱离子水和预冷的10% 甘油溶液 (使用前消毒)。
   8. 离心 (4, 000 x克, 4°c 下 5分钟) 的细胞, 并丢弃上清液。加入200毫升的预冷脱离子水。使用10毫升血清学移液器重新移植细胞。重复此步骤3x。
   9. 用预冷的10% 甘油溶液清洗细胞。像以前一样离心它们 (在4°c 下以 4, 000 x g 的速度进行 5分钟)。
   10. 丢弃上清液, 并在300μl 的10% 甘油溶液中重新悬浮颗粒。制作50μl 的脂肪, 并将其冷冻在液氮中。将细胞 (狙击手筛选细胞) 存放在-80°c。
3. 狙击手筛选
   1. 用每个库中100纳克的 cas9 变异质粒 (从步骤2.2.3.See 步骤2.1.1 和 2.1.4) 转换狙击手筛选细胞 (从步骤 3.2.10)。按照3.2.1 步骤中描述的电穿孔步骤–3.2.3。
   2. 将250μl 的细胞转移到一个新的 1.5 ml 微离心管中。添加 250 pg 的 atc, 使最终浓度为 10 ngml。恢复包含 atc 的单元和不含 atc 的单元 (请参阅恢复步骤的步骤 3.2.4)。
   3. 在氯霉素 lb 琼脂板上切片25μl 的无 atc 细胞 (非选择性条件)。在回收的含有 atc 的细胞中添加 atc, 使245毫米 lb 板的最终浓度为 100 ng\ ml。立即将细胞片在氯霉素/阿霉素 lb 琼脂板上 (选择性条件)。在32°c 下过夜。
      注: lb 板的大小和数量取决于筛板的多样性大小。在100毫米培养皿的情况下, 加入2μg 的 atc, 使其具有20毫升的 lb。
   4. 给盘子拍照。使用 opencfu 软件¹⁴计算可行菌落的数量。(请参阅步骤 2.2.1)确保非选择性板上的菌落数量至少比库的多样性大 10倍, 以覆盖所有变体。
   5. 计算生存频率, 如下所示。
      生存频率 = 选择性板上的菌落数/(非选择性板块上的菌落数 x 10)
   6. 在所有三个图书馆的选择性板块上建立存活下来的殖民地。在42°c 条件下, 在 lb 介质250毫升的条件下, 以12.5 μgml 氯霉素为补充, 将存活的菌落体在42°c 内培育。使用 midiprep 试剂盒分离筛选出的 cas9 文库 dna。
      注: 此步骤清除 sgrna 质粒。
   7. 从步骤3.3.1 重复筛选过程–3.3.6 直到生存频率达到一个高原。在回收过程中使用选定的 cas9 质粒中的 10 ng 进行转化, 使用 10 ng 的 atc。在选择条件下, 将 atc 浓度保持在 100 ng/ml。
4. 洗牌和第二次放映
   1. 使用以下 dna 洗牌协议洗牌选定的池变量。pcr 利用从插入边界进入的150个核苷酸--侧翼引物放大 cas9 质粒中的 cas9 插入物。在37°c 下, 用 dnase i 消化2μg 的扩增 pcr 产物1分钟。
   2. 使用2% 琼脂糖凝胶电泳纯化长度为 70-200 bp 的碎片。pcr 扩增纯化的碎片。使用该产品作为模板, 用适当的引物在 cas9 侧面扩增 cas9 插入物。使用最终 pcr 产品构建 cas9 库, 如步骤2.1.4 中所述。
   3. 用另一个不匹配的 sgrna 质粒 (见步骤 3.1.1) 准备新的狙击手筛选细胞 (见第3.2 节)。重做筛选过程 (第3.2-3.3 节), 直到存活率达到一个高原。在回收过程中使用选定的 cas9 质粒中的 10 ng 进行转化, 使用 10 ng atc 进行转化。在选择条件下, 将 atc 浓度保持在 10 ngml。
5. 进化的 cas9 突变质粒的选择
   1. 在最后一个筛选步骤后, 从选择性板中随机抽取100个菌落, 在42°c 的情况下在含氯霉素的 lb 培养基中进行隔夜培养。
   2. 使用微型制备程序分离质粒, 并使用 cas9 中的测序引物对插入物进行 ssd 序列。
   3. 选择前三个最常见的变体, 在人类细胞系中测试它们。

4. 用截断的 sgrna 将 cas9 作为 rnp 交付

1. 利用 cas-offinder 进行目标基因选择
   1. 使用 cas-offinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) 选择目标站点。选择适合特定类型的 cas9 和目标基因组 (人、小鼠、斑马鱼等) 的 pam 类型。填写"查询序列" 选项卡, 选择 "不匹配编号",然后单击 "提交"按钮。
   2. 几秒钟后, 将显示目标上的站点 (不匹配的 "0" 号) 和目标外站点。通常, 选择具有一到三个不匹配的非目标站点。
2. sgrna 模板的制备
   1. 订购 crrna 和 tracrrna 寡核苷酸, 具有以下模板序列, 即 crrna 序列: 5 '-taatactactactactactacnnnnnnnnnnnnnnnnnnntgatagtaga-3 ';tracrRNA 序列: 5 '-agccacccactcacttagaggtagttattttttttttttactttagtagtaacttaacttaacttaactactactactactacta-3 '。用步骤4.1.2 中获得的目标序列在 crrna 序列中填充 n20。要设计截断的 sgrna, 请从 5 ' 端移除碱基, 以获得 n19、n18 或 n17 sgrna 序列。
   2. 准备 pcr 混合物, 用于扩增 sgrna 编码序列, 如下所示: 将5μl 的5倍缓冲液、0.5μl 的 crrna 寡核苷酸 (100pmolμl)、0.5μl 的 tracrnna 寡核苷酸 (100pmolμl)、2.5μl 的 dntp (每 mm)、0.5μl 的 dna 聚合酶和36μl 的 nfw (材料表)。
   3. 使用以下条件放大模板, 即初始变性: 98°c 时 1分钟;变性、退火和延伸: 98°c 时 10秒, 54°c 时 15秒, 72°c 时 20秒, 25次循环;最后一次延期: 72°c 下5分钟。
   4. 在2% 琼脂糖凝胶上分析扩增模板 dna 的 2μl (从步骤 4.2.3)。使用 pcr 纯化试剂盒纯化模板。
      注: 模板 dna 的大小为 125 bp。
3. sgrna 的合成
   1. 准备用于 sgrna 合成的反应混合物, 如下所示: 结合8.5μl 模板 dna (从步骤 4.2.3)、1μl utp (25 mm)、1μl ctp (25mm)、1μl gtp (25 mm)、1μl atp (25 mm)、4.2μl mgcl 2 (100 mm), 4.5μl t7 rna 聚合酶 (50 ueμl), 3μl 的 10x t7 rna 聚合酶缓冲液, 1.2 μl 的热像磷酸酶 (0.5 ueμl), 0.75μl 的 rnase 抑制剂 (40 uμμl), 和4.2 μl 的 nfw。
   2. 在37°c 下隔夜 (至少 10小时) 将反应混合物生也就是最低的。在反应混合物中加入0.5μl 的 dnase (2uμl), 在37°c 孵育15–30分钟. 使用 rna 纯化试剂盒纯化 sgrna。
   3. 为减少由 sgrna¹⁶上的 5 '-三磷酸引发的先天免疫反应所引起的毒性, 用小腿去除 5 '-三磷酸, 用肠碱性磷酸酶 (cip) 从引导 rna 中取出, 具体如下:在体外治疗10微克-在存在 100 u rnase 抑制剂的情况下, 在37°c 下将具有 250 u cip 的 rna 转录3小时。使用 rna 纯化试剂盒纯化 cip 处理的 sgrna。

5. wt-和 sanper-cas9 蛋白的表达和纯化

1. 大肠杆菌中的蛋白质表达
   1. 将 pet 质粒 18编码为 lbl21 (de3) 大肠杆菌菌株.
   2. 在含有50μgml 卡那霉素的 lb 培养基中, 用一个新的菌落保存着 pet-cas9 表达质粒, 并在 37°c (预培养) 下摇一摇, 然后在夜间 (200 转/分) 摇一摇。
   3. 将隔夜培养的10毫升转移到含有50μgml 卡那霉素的新鲜 lb 培养基的500毫升。在37°c 条件下用晃动 (200 转/分) 培养培养培养2小时。
   4. 监视 od₆₀₀ , 直到培养达到生长的中间阶段 (od₆₀₀约 0.6–0.7)。
   5. 诱导 wt-或 sanper-cas9 蛋白与异丙基β-d-1-硫代卡拉糖苷 (iptg, 最终浓度为 0.25 nm) 的表达。在18°c 下隔夜培育培养。
2. 蛋白质纯化
   1. 在4°c 条件下, 以 5, 000 x 克离心10分钟的速度收集细胞。
   2. 在裂解缓冲液中重新填充颗粒 (50 mm nah2 po 4, 300毫升氯化钠, 10 毫升咪唑, 4 mm 二硫基三醇 [dtt], 5 m 苯并胺, 100 mm 苯基甲基磺酰氟 [pmsf], ph 值 8), 每克湿重20毫升。
   3. 加入 pmsf、dtt 和溶菌酶, 最终浓度为 1 mgl, 并在冰上孵育混合物30分钟。
   4. 把细胞放在冰上在 200–300 w 处反复脉冲 10秒, 每个脉冲之间的冷却时间为 10秒, 总时间为20分钟。
   5. 在4°c 条件下, 以 6, 000 x克离心溶液30分钟。
   6. 将上清液取出到新鲜的管子中。将 his-bind 琼脂糖树脂加入5毫升的清除裂解液中, 在4°c 下轻轻晃动1小时。
   7. 将 lisate:bind agarose 树脂混合物装入具有盖底出口的柱上。
   8. 取下底部盖并收集柱的流动。
   9. 用洗涤缓冲液清洗 2 x 柱 (50 mm nah2po 4, 300 mm nscl, 20 mm 咪唑, ph 8);采用十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 对洗涤分数进行分析。
   10. 用1毫升洗脱缓冲液 (50 mL nah 2 po 4, 300 mLncl, 250 mL 咪唑, ph 8) 清除蛋白质 10倍, 采集 sds-page 样品.
   11. 使用 100 kda 柱过滤器浓缩洗脱的 wt 或 sanper-cas9 蛋白。样品存放在溶液中的 10 mm Tris-HCl, 150 mm 氯化碳, 50% 甘油在-80°c。

6. rnp 交付

1. rnp 传递细胞的转染和制备
   1. 在 37°c, 在37°c 中, 用5% 的 co2 维持 dulbecco 改性鹰培养基 (dmem) 中的 hek293t 细胞, 辅以10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和1% 的抗生素.
   2. 将 wt-或 sanep-cas9 蛋白 (2μg) 与 sgrna (2 微克) 混合, 在 rt 孵育 10分钟, 形成 rnp 复合物。
   3. 胰蛋白酶化并计数细胞。每个反应准备 2 x^{10 4个}细胞。用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 和离心机清洗细胞。吸起上清液, 用电穿孔缓冲液重新悬浮颗粒。
   4. 电孔 rnp 复合物到细胞使用以下设置, 即 1, 300 v, 30 毫秒, 和一个脉冲。将细胞贴在一个48英寸的板上, 在电穿孔后, 用 fbs 和抗生素 (如步骤6.1.1 中所述) 补充500微米的 dmem。在37°c 下与5% 的 co2 进行培养。
   5. 在转染48小时后, 用 gdna 制备试剂盒分离基因组 dna。

7. 编码狙击手和 sgrna 的质粒的转染

1. sgrna 质粒的构建
   1. 使用以下模板序列订购正向和反向寡头, 即正向: 5 '-cacccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn3 ';反向: 5 '-aaannnnnnnnnnnnnnnc-3 '。将 n20 替换为步骤4.1.2 中获得的目标序列。将目标序列缩短到 n19、n18 或 n17 的长度, 以合成截断的 sgrna。
   2. 在 1x t4 dna 连接酶缓冲液中退火这两个寡核苷酸。
   3. 用 bsai 限制性酶消化 prg2 载体。
   4. 凝胶使用0.8% 琼脂糖凝胶净化消化载体 (3300 bp)。
   5. 在37°c 条件下, 用 t4 连接酶将退火寡核苷酸和纯化片段结合在一起: 将50纳克消化的 prg2 和1纳克退火寡核苷酸混合在20μl 的反应量中。在 rt 孵化15分钟。
   6. 将结扎混合物转化为 dh5 α菌株, 并在37°c 时在含有氨匹西林 (100μg/ml) 的 lb 琼脂板上生长转化剂。通过标准测序确认在矢量中插入寡核苷酸。
2. 编码狙击手和 sgrna 的质粒的转染
   1. 在37°c 与 5% co 2 的情况下, 在 dmem 中保持 hek293t 细胞, 辅以10% 的fbs 和1% 的抗生素。转染前一天, 胰蛋白酶化并计数细胞。在48井规模下工作时, 在250μl 的完整生长介质中, 每口井 1 x^{10 5}个细胞。转染当天细胞应为 50%-80% 的融合。
   2. 在48井范围内, 使用基于脂质的转染试剂制备250纳克的 p3s 质粒和250纳克的 sgrna 质粒进行转染。将质粒混合在25μl 的血清自由 mem 中。
   3. 用25μl 的血清游离 mem 稀释转染试剂1μl。在 rt 孵育混合物 5分钟, 将两种混合物混合, 在 rt 孵育产生的溶液 20分钟, 形成血浆中脂质脂蛋白复合物。
   4. 孵育20分钟后, 将含有等离子体中转染试剂复合物的溶液直接添加到每个含井细胞中, 然后依次摇晃板, 轻轻搅拌。在检测转基因表达之前, 将细胞在37°c 时在 co2 孵化器中孵育48-72小时。

8. 计算缩进频率, 以确定目标和非目标活动

1. 有针对性的深度测序, 用于分析目标上和潜在的目标外地点
   1. 用 gdna 制备试剂盒从步骤6.1.5 或7.2.4 中分离基因组 dna。利用针对目标和目标外的引物对 gdna 进行 pcr 扩增, 生成深度测序库。
   2. 使用索引引物为每个示例添加标签。使用下一代测序机将集合库用于对高端测序。
2. 利用 Cas-Analyzer 仪进行深度测序分析
   1. 使用 cas-ancer 评估工具¹⁷分析深层测序数据。
   2. 选择 "读取 1 " 和"读取 2 " 选项卡下的 fastq 文件 (读取 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, 读取 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq)。
   3. 填写 "基本信息" 选项卡和 "分析参数" 选项卡. 单击 "提交" 按钮。

结果

在执行狙击手屏幕后, 生存菌落的百分比可以通过将 lb 板上含有氯霉素、卡那霉素、阿拉伯糖和 atc (ckaa) 的菌落数量除以含有氯霉酚、卡那霉素、阿拉伯糖和 atc (ckaa) 的菌落数量来计算仅限氯霉素和卡那霉素 (ck)。当使用 spcas9 的库执行狙击手屏幕时, 这个百分比通常很低。通过使用幸存池重复屏幕, 可以丰富真正的正命中。例如, 在这个具有代表性的狙击手屏幕中, 在第三个屏幕之后获得了100% 的存活率 (图 1)。使用 rnps 或等离子体中编码的减号-cas9 的转移可以针对各种目标以及通过有针对性的大幅测序测量的目标上和目标外活动来完成 (图 2)。在大多数目标中, sanicper-cas9 显示出与 wt 相同水平的目标上活动和更高的特异性比率, 截断的 sgrna 也可用于进一步提高特异性 (图 3)。然而, 它们的使用仅限于几个目标, 因为在大多数情况下, 它们导致目标上的活动低于全长 sgrna。因此, 必须对长度不同 (从17到20轴) 的 sgrna 进行测试, 必须测量目标和非目标活动, 以优化特异性。

图 1: 使用不同库的随机 cas9 变体执行的代表性狙击手屏幕.突变体库、ep 库 i 和 ep 库 ii 表示使用不同的商业工具包创建的库。首先, 第二, 最后表示浓缩屏幕执行的次数⁷。这一数字已从 lee 等人7人的数字中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: wt-cas9 或 sanper-cas9 的目标和非目标活动与通过质粒或 rnp 传递的 20 mer 引导序列配对.特异性比率是通过将目标上的活动除以目标外活动来确定的。错误条表示 sem (n = 3)⁷。这一数字已从 lee 等人7人的数字中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 包括使用可变长度的 sgrna 获得的用于 fandcf01 和 aavs 站点的 sanper-cas9 的目标和非目标活动.特异性比率是通过将目标站点上的度频率除以各自目标外站点的缩进频率来确定的。sgrna 与匹配的鸟嘌呤在 5 ' 终端 (gx18 或 gx19) 和那些与不匹配的鸟嘌呤 (gx17, gx18, gx19, 或 gx20) 表示。当归一化的目标上活动 & lt;70 7 时, 没有计算特异性比率。这一数字已从 lee 等人7人的数字中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

对于那些谁想要避免繁琐的筛选程序, 以获得 sanper-cas9, sanper-cas9 蛋白和编码质粒是可用的。利用这些材料, 应确定 sgrna 的最佳长度, 即提供最高特异性比。此外, 建议以 rnp 格式交付 niper-cas9 和 sgrna, 因为它通常比质粒格式的传递产生更高的特异性比。与 sanper-cas9 不同的是, 其他工程 cas9 变种与截断的 sgrna 6^、7或 rnp 表格⁸的交付不兼容 (hifi-cas9 除外)。

对于狙击手屏幕, 选择不匹配的序列是最重要的一步。应避免选择与goi序列的低裂解活性相关的不匹配的 sgrna。如果没有, cas9 变种的特异性水平不会将大肠杆菌基因组 dna 与不匹配的目标位点分离。这种效应将导致大量的背景菌落, 危及整个筛选过程。

由于与酵母相比, 大肠杆菌具有较快的翻倍时间和较高的转化效率, 因此与酵母筛选方法相比, 狙击手筛网具有优势。此外, 狙击手屏幕应该比其他基于大肠杆菌的系统更敏感, 在这些系统中, 不匹配的位点被带到质粒上: 在我们的系统中有一个基因组 dna 的副本, 因此只有一个不匹配站点的副本, 但有大量的单个大肠杆菌细胞内的质粒。

其他诱导 dsb 的 dna 内切酶的特性, 如 sacas9 或 cpf1, 也可以通过使用狙击手屏幕来改善。不幸的是, 狙击手屏幕不能直接用来增加基础编辑器的特异性, 因为碱基编辑不会诱导 dsb 在大肠杆菌的基因组 dna。由于基础编辑器在其系统的核心中使用了 cas9 的镍酶或死版本, 因此可以通过使用从狙击手屏幕获得的点击率来提高基础编辑器的特性。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	NEB	M0290L
Ampicillin Sodium Salt	Fisher Chemical	BP1760-25
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma Aldrich	37919 or 94664
Antibiotic Antimycotic solution	Welgene	LS203-01	Media component
BamHI	Enzynomics	R003L
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	R4408
Diversify PCR Random Mutagenesis	Clontech	630703	Error-prone PCR kit
DNA-Shuffling Kit	Jena Bioscience	PP-103
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Welgene	LM001-17	Culture media
Endura Electrocompetent Cells (DUO)	Lucigen	60242-2	E. coli electrocompetent cells for library preparation
Fetal Bovine Serum (FBS)	Welgene	S101-01	Media component
Gene Pulser II	Bio-Rad		E. coli electroporation equipment
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit	Agilent	200550	Error-prone PCR kit
genomic DNA prep kit	GenAll	106-152	gDNA-prep kit
Glycerol	BioShop	GLY001.1
GP/MP Cuvette, 0.1cm	Bio-Rad	BR165-2089	E. coli electroporation equipment
HEK293T cell	ATCC	CRL-11268	Human cell line
Kanamycin sulfate	Acros Organics	450810500
L-(+)-Arabinose	Sigma Aldrich	A3256-25G
LaboPass PCR Purification Kit	Cosmogenetech	CMR0112
LaboPass Plasmid Mini	Cosmogenetech	CMP0112	Mini-prep kit
LB Agar Miller	Formedium	LMM0202
LB Broth Miller	Formedium	LMM0102
Lipofectamine	Invitrogen	11668019	Transfection reagent
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture
Neon Transfection System	Thermo	MPK5000	RNP Electroporation equipment
Neon Transfection System 10 µL Kit	Thermo	MPK1096	RNP Electroporation equipment
NucleoBond Xtra Midi EF	Macherey-Nagel	740420.50	Midi-prep kit
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4061	DNA purification kit that enables low-volume elution
Opti-MEM	Gibco	LS31985070	Transfection media
p11-lacY-wtx1	Addgene	#123945
pgrg36	Addgene	#16666	E. coli mutator strain
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530L
Pyrophophatase	NEB	M2403L
Ribonucleotide Solution Set	NEB	N0450L
RNase inhibitor	NEB	M0314L
T7 RNA polymerase	NEB	M0251L
Turbo Dnase	Ambion	AM2238
XbaI	Enzynomics	R013L
XL1-Red Competent Cells	Agilent	200129