JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, CRISPR-Cas9-hedefi faaliyeti kaybı olmadan daha yüksek bir özgüllüğü elde etmek için en iyi duruma getirmek için bir protokol mevcut. Keskin nişancı-ekran denilen bir yönlendirilmiş evrim yaklaşım istenen özelliklere sahip bir mutant Cas9 bulmak için kullanın. Keskin nişancı-Cas9 kesilmiş tek-Kılavuzu RNA'lar ve teslimat Ribonükleoprotein biçiminde, daha yüksek özelliklerine ulaşmak için iyi bilinen stratejileri ile uyumludur.

Özet

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) geliştirilmesi-ilişkili protein 9 (Cas9) tedavi yöntemleri potansiyel olarak zararlı hedef kapalı etkileri kaçınma gerektirir. Birkaç yöntem bu tür etkileri azaltmak için tasarlanmış. Burada, bir Escherichia colimevcut-tabanlı yönlendirilmiş evrim yöntemi en iyi duruma getirilmiş özgüllük ile bir Cas9 değişken edinme keskin nişancı-ekrana adı ve hedef üzerinde etkinlik, keskin nişancı-Cas9 denilen korudu. Keskin nişancı-ekran kullanarak, pozitif ve negatif seçim aynı anda gerçekleştirilebilir. Ekran da gerçek pozitif sayısı için zenginleştirmek için diğer tek-Kılavuzu RNA (sgRNA) serileri ile tekrar edilebilir. CMV PltetO1 çift organizatörü Cas9 türevleri ifade etmek için kullanarak, havuza alınan kitaplığın performansını hızlı bir şekilde memeli hücrelerinde denetlenebilir. Keskin nişancı-Cas9 özgüllüğü artırmak için yöntemleri de açıklanmaktadır. İlk olarak, kesilmiş sgRNAs kullanımı daha önce Cas9 özgüllüğü artırmak için gösterilmiştir. Diğer mühendislik Cas9s farklı olarak, keskin nişancı-Cas9 kesilmiş sgRNAs ile birleştirildiğinde hedef tarih etkinlik vahşi-tipi (WT) düzeyini korur. İkinci olarak, keskin nişancı-Cas9 teslim Ribonükleoprotein (RNP) biçiminde bir plazmid biçimi yerine hedef üzerinde faaliyete etkilemeden mümkündür.

Giriş

Bu yazıda, farklı stratejiler birleştirerek Cas9 özgüllüğü artırmak hedefliyoruz. CRISPR-Cas9 hedef kapalı etkileri kaçınmak çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Örneğin, kesilmiş sgRNAs daha yüksek özgüllük1elde etmek için kullanılabilir. Ayrıca, Cas9 Teslimat yöntemi plazmid biçiminden daha yüksek özgüllük2' yi edinmek için RNP biçimi değiştirilebilir. Belirli amino asit kalıntıları eklenmesi, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) protein rasyonel göre modifiye edilmiştir tasarım açıklanan daha önce3,4,5. Alternatif olarak, amino asitlerin rasgele bir şekilde değiştirilmiş ve Cas9 türevleri en yüksek özgüllük ile Maya6 veya eleme sistemi E. coli7,8 kullanarak tespit edilmiştir.

Ancak, birçok grup Cas9 türevleri nonspesifik etkileşimini etkiler, Cas9 ve substrat sergi düşük hedef üzerinde etkinlikler7,8,9, debilitate için tasarım kullanarak tasarlanmış bildirdin 10 , 11 , 12. bir E. coligeliştirdiğimiz-yönlendirilmiş evrim sistemini, rastgele mutagenized Cas9 türevleri ekran için keskin nişancı ekran, alan. Eleme sistemi bir E. coli E. colidaha hızlı katlama zaman ve daha yüksek dönüşüm verimliliği nedeniyle bir maya sistem avantajları vardır.

Negatif ve pozitif seçim, üç farklı Plazmid ve E. coli genom entegre bir gen (GOI) ilgi dayalı keskin nişancı ekran modunda kullanılır. E. coli belirlenen adaylar subcloning gerek kalmadan memeli hücreleri test edilebilir böylece Cas9 değişik bir düşük-kopya numarası plazmid CMV PltetO1 çift-organizatörü sisteminde ifade edilir. GOI Tn7 transposon sistemini kullanarak E. coli genom giriliyor. Çoğaltma sıcaklığa duyarlı kökeni içerir, sgRNA plazmid GOIhedefleme bir sgRNA ifade eder; Ancak, sgRNA ve GOI dizileri mükemmel eşleştirilir değil. Üzerinde bir üçüncü plazmid gyrase yapılabilir zehirler öldürücü bir ürün kodlar ccdB gen içeren bir mükemmel uyumlu sgRNA hedef bulunmaktadır. İki iplikçikli kırılmalar (DSBs) genomik DNA'SINDA bulunan uyumsuz sitesinde içine tanıttı çünkü bu sistemde, Cas9 türevleri ile yüksek hedef kapalı faaliyetleri ifade hücreleri kaldırılır. Öte yandan, Cas9 türevleri ile düşük hedef üzerinde hareket ifade hücreleri de öldürücü ccdB gen ekspresyonu nedeniyle kaldırılır. Cas9 türevleri ifade düzeyini seçimi kuvvet ayarlayan anhydrotetracycline (ATC), konsantrasyon değiştirerek değiştirilebilir.

Genomik DNA yerine bir plazmid eşleşmeyen sgRNA hedef site bulma sistemi duyarlılığını artırmak gerekçeli. Olmayacak birçok Plazmidler, her bir hedef site içinde tek bir içeren bu yaklaşımın avantajı sadece bir genomik site olduğunu ise E. coli hücre.

Bu sistemi kullanarak, bir Cas9 değişken, keskin nişancı-Cas9, hangi WT düzeyi hedef üzerinde etkinlikleri gösterir ve hedef kapalı etkinlikler için WT Cas9 karşılaştırıldığında düşük tespit edilmiştir. Keskin nişancı-Cas9 hatta yüksek özgüllük oranları kesilmiş sgRNAs veya RNP alan teslim plazmid alan teslim yerine kullanarak elde edebilirsiniz.

Protokol

1. BW25141 E. coli zorlanma içine insan GOI bütünleştirilmesi

  1. GOI klonlama
    1. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile astar yazmamalı ve XhoI restriksiyon enzimi siteleri içeren çeşitli aday hedef siteleri üzerinden standart PCR yöntemleri içeren bir insan GOI 500 bp uzunluğu yükseltmek.
      Not: Bu deneyde, insan EMX1 gen GOI oldu.
    2. PCR ürünü ve pgrg3613 vektör yazmamalı ve XhoI enzimleri ile sindirmek.
    3. Jel arındırmak istediğiniz parçaları (500 bp ve 12 kb).
    4. Birlikte T4 ligaz kullanarak parçaları ligate. Bunu yapmak için mix 50 ng sindirilmiş pgrg36 ve 6 ng PCR ucun 1 x ligaz tampon ve 0.5 U ligaz enzim içeren 20 μL tepki hacmine. Oda sıcaklığında (RT) gecede kuluçkaya.
    5. Ve birleştirilmiş plazmid DH5-α yetkili hücrelere dönüşümü. Ampisilin (100 μg/mL) 32 ° c içeren Luria suyu (LB) agar plakalar üzerinde elde edilen transformants büyümek ve gecede kuluçkaya. Bir koloni up pick ve gecede Ampisilin içeren LB medyada büyümek. Plazmid piyasada bulunan miniprep Kit kullanarak E. coli, DNA izole et. Mini plazmid hazırlık (mini hazırlık)13elde edilen plazmid sıralama Sanger tarafından GOI parçası ekleme onaylayın.
  2. BW25141 -GOI hazırlanması
    1. Elde edilen pgrg36 -GOI plazmid BW25141 e.coli suşu dönüşümü. Yanlış pozitif kolonileri sayısını en aza indirmek için bir BW25141 yük kullanmak esastır.
    2. 32 ° C'de LB arabellek dönüştürülmüş hücrelerde bir gecede büyümek. GOI BW25141 zorlanma (BW25141 -GOI) genomik DNA eklenir. Pgrg36 -GOI plazmid13standart pgrg36 protokolü kullanarak BW25141 -GOI zorlanma kaldırın. Kısaca, bir koloni seyreltik (yaklaşık 107-kat) ve bir gecede bir LB plaka 42 ° c üzerinde büyür. Kolonilerin LB plaka üzerinde çizgi ve onları 42 ° C'de gecede büyümek.
    3. Koloni pgrg36 protokolünde önerilen primerler kullanılarak PCR, tarafından doğru GOI ekleme onaylayın: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 've 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3'. Astar genomik DNA ekleme sitesi güçlendirir ve elde edilen PCR ürünün 904 olacak bp artı boyutu ekleme (500 bp bu durumda).
    4. Electrocompetent BW25141 -GOI hücreleri (detaylı bir protokol adımları 3.2.6–3.2.10 anlatılan) hazırlayın.

2. Cas9 varyant Kütüphane hazırlanması

  1. Kitaplık hazırlama
    1. Cas9 vektör7 dönüştürmek içine ticari E. coli mutator strain (Malzemeler tablo) ve değişken kitaplığı (Mutator kitaplığı) elde etmek için üreticinin yönergeleri izleyin.
    2. Hataya PCR Cas9 vektör bir hataya PCR Kiti (Tablo reçetesi) kullanarak, tüm WT Cas9 sırayla gerçekleştirin.
      Not: Sniper-Cas9 durumda protein özgün işlev etkilemesini önlemek için düşük-hata oranı iletişim kuralı kabul edilmiştir.
    3. Uygun enzimleri ile Cas9 vektör sindirmek. Jel arındırmak PCR ürünü (Kimden adım 2.1.2) ve sindirilmiş omurga.
      Not: Yaklaşık 4,3 kb SpCas9 gen boyutudur. XhoI ve KpnI, keskin nişancı-Cas9 durumda kullanılan pBLC-SpCas9 vektör sindirmek için seçilmiştir.
    4. Omurga parçası (2.1.3. adımdaki) ve izotermal vitro rekombinasyon üzerinden (2.1.3. adımdaki) hataya PCR kullanarak çoğaltılmış INSERT bir araya getirin.
      Not: 500'den fazla ng omurga kütüphane (hataya PCR [EP] kütüphane) yüksek konsantrasyon elde etmek için gereklidir. EP kitaplıkları keskin nişancı-Cas9 durumda hazırlamak için kullanılan iki farklı hataya PCR Kitleri (EP Kütüphane ı ve II).
    5. Derleme (Kimden adım 2.1.4) Urun arındırmak düşük hacimli elüsyon (Tablo reçetesi) sağlayan bir DNA arıtma seti kullanarak. Nükleaz ücretsiz su (NFW) 6 μL ile elute ve DNA konsantrasyonunu ölçün.
    6. 500'den fazla dönüşüm ng Cas9 Kütüphane vektörünün (her üç kütüphanelerin için) electrocompetent E. coli hücre (Tablo reçetesi) 50 μL içine. Adımları 3.2.1-3.2.4 elektroporasyon protokolünde bakın. Bu kütüphane hazırlık için SOC orta 1 mL 50 μL yetkili hücre başına 250 μL yerine kullanın.
    7. Yapmak 1: 100, 1:1, 000 ve 1:10,000 dilutions SOC orta ile kurtarılan hücreleri içeren karışımı. 100 mm LB Ağar kaplamalar kloramfenikol (12,5 μg/mL) ile desteklenmiş seyreltilmiş hücrelerdeyse plaka. 245 mm2 tabakta kalan hücreleri plaka. 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  2. Kütüphane karmaşıklık hesaplanması
    1. Seyreltme plakaları bir jel dokümantasyon sistemi veya sıradan bir dijital kamera ile fotoğraf. OpenCFU yazılım14 çalıştırmak ve seyreltme plakaları bir fotoğraf yükleyin. Sayım alanı bir tabak içinde ayarla ve yanlış kolonileri kaldırın.
    2. El ile transformants özgün dizi elde etmek için seyreltme faktörü tarafından kolonileri sayısını çarpın. Bu sayıların Logaritmik forma (10 tabanı) dönüştürün. Kütüphanede karmaşıklığını belirlemek için ortalamasını hesapla.
    3. Ne zaman istediğiniz karmaşıklık değer elde edilir, tüm kolonileri (adımından 2.1.7) 245 mm kare plaka üzerinde toplamak bir yayıcı ve kloramfenikol ile desteklenmiş lb 20 mL kullanarak. Toplanan kolonileri büyümek ve bir ticari midiprep kit kullanarak plazmid kitaplığı arındırmak değil.
      Not: Yüksek Kütüphane karmaşıklığı, daha iyi. Keskin nişancı-Cas9 tespit edildi zaman, 3 x 106 bir çeşitlilik her kitaplık için sağlanır.

3. olumlu ve olumsuz Cas9 gelişen için eleme

  1. Hedef seçimi ve plazmid İnşaat
    1. Bir hedef sgRNA spacer serisi içinde GOIseçin. Eşleşmeyen bir dizi üretmek için rasgele nükleotit bir ya da iki kalıntılarında yerine.
      Not: Sniper-Cas9 durumda insan EMX1 hedef site 3 (GGG PAM ile GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA) kullanılmıştır. Aşağıdaki kullanılan eşleşmeyen dizileri vardır: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA, GAacCCGAGCAGAAGAAGAA, GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA ve GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA.
    2. Eşleşmeyen sıra takın (bkz. Adım 3.1.1) standart Oligonükleotid (oligo) yordamlar7klonlama kullanarak sgRNA plazmid içine.
    3. Eşleşmeyen sıra 3' ucunda bir PAM ile p11-dantel-wtx1 (Standart oligo klonlama yordamlar15kullanarak ccdB plazmid oluşturmak için,Tablo reçetesi) yerleştirin.
  2. Keskin nişancı-tarama E. coli yetkili hücreleri hazırlanması
    1. BW25141 -GOI electrocompetent hücreler buz çözme.
    2. 1 ekleyin her ccdB Plazmid ve 50 μL çözdürülen BW25141 -GOI hücre içine Çift Kişilik eşleşmeme durumu ile sgRNA plazmid ng. Yavaşça hücreleri pipetting tarafından mix ve bir prechilled 0.1 cm elektroporasyon küvet taşıyabilirsiniz.
    3. Elektroporasyon ile iki Plasmid'ler ile E. coli dönüşümü. SOC orta 250 μL elektroporasyon hemen sonra ekleyin. Yavaşça hücreleri ve orta karıştırmak için çözüm pipette. Karışımı bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
      Not: maksimum verimlilik için gerilim 1,80 ayarla kV ve çalışma zamanı 4,8 ms ve 5.0 ms arasında olmalıdır.
    4. Dönüştürülmüş hücrelerin yeniden elde etmek ve onlara nazik sallayarak ile 1 h için 32 ° C'de kuluçkaya.
    5. Bir Ampisilin (50 μg/mL) kurtarılan hücrelerin 125 μL plaka / sefaloridin (25 μg/mL) LB agar plaka (kültür durumu). Plaka kalan hücreleri bir Ampisilin/sefaloridin/arabinoz üzerinde (1.5 mg/mL) LB agar plaka (ccdB-koşul ifade). 32 ° C'de gecede kuluçkaya.
    6. Koloniler ccdBüzerinde hayatta olmaması için kontrol-koşul plaka ifade. Koloniler bir yayıcı ve kültür ile 50 μg/mL Ampisilin ve 32 ° C'de sefaloridin 25 μg/mL ile takıma süper en iyi suyu (SOB) orta 250 mL içinde sallayarak nazik kullanarak kültür durumu plaka toplamak.
    7. Ne zaman, 600 nm (OD600) ulaştığı 0,4, optik yoğunluk buzda balon soğuk. Prechilled deiyonize su ve prechilled % 10 gliserol çözüm hazırlamak (kullanmadan önce sterilize etmek).
    8. (4 ° C'de 5 min için 4.000 x g ) de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 200 mL prechilled deiyonize su ekleyin. 10 mL serolojik pipet kullanarak hücreleri resuspend. 3 x bu adımı yineleyin.
    9. Hücreleri 50 mL prechilled % 10 gliserol çözeltisi ile yıkayın. Onları daha önce olduğu gibi (4 ° C'de 5 min için 4.000 x g ) de santrifüj kapasitesi.
    10. Süpernatant atın ve Pelet % 10 gliserol çözüm 300 μL içinde resuspend. 50 μL aliquots yapmak ve onları sıvı azot içinde dondurma. -80 ° C'de hücreler (keskin nişancı-tarama hücreleri) saklamak
  3. Keskin nişancı-tarama
    1. Keskin nişancı-tarama hücrelerden (Adım 3.2.10) 100 ile dönüşümü Cas9 varyant Plazmidler her Library (Kimden adım 2.2.3.See adım 2.1.1 ve 2.1.4) ng. Adımları 3.2.1–3.2.3 içinde açıklanan elektroporasyon adımları izleyin.
    2. Hücrelerin 250 μL taze 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. ATC 10 ng/mL nihai bir konsantrasyon yapmak için 250 pg ekleyin. (Bkz. Adım 3.2.4 kurtarma adım için) hem hava trafik kontrol içeren ve ATC içermeyen hücreleri kurtarmak.
    3. Kurtarılan ATC-Alerjik hücre kloramfenikol/sefaloridin LB agar tabakta (nonselective koşul) 25 μL plaka. Hava trafik kontrol 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon 245 mm LB plaka üzerinde yapmak için kurtarılan ATC içeren hücreleri ekleyin. Hemen tabakta kloramfenikol/sefaloridin/arabinoz LB agar (seçici koşul) hücreleri plaka. Gecede 32 ° C'de kuluçkaya
      Not: Boyutu ve LB plaka sayısı tarama kapakları çeşitliliği boyutu tarafından belirlenir. 100 mm Petri kabına 20 mL lb ile söz konusu olduğunda, ATC 2 μg ekleyin.
    4. Tabakları fotoğraf. OpenCFU yazılım14kullanarak kalıcı koloniler saymak. (Bkz. Adım 2.2.1) Koloniler nonselective plaka sayısı en az 10 x tüm türevlerini karşılamak için kütüphanede çeşitliliği daha büyük olduğundan emin olun.
    5. Aşağıdaki gibi hayatta kalma frekansını hesaplamak.
      Hayatta kalma frekans = kolonileri seçici bir plaka üzerinde sayısı / (kolonileri nonselective tabakta x 10 sayısı)
    6. Tüm üç kitaplıklarından seçici Tabaklarda hayatta kolonileri havuz. Hayatta kalan koloniler halinde 250 mL LB Orta 12.5 μg/mL kloramfenikol 42 ° c ile gecede takıma kuluçkaya. Filtrelenmiş Cas9 Kütüphane midiprep seti kullanarak DNA izole et.
      Not: Bu adımı sgRNA plazmid temizler.
    7. Hayatta kalma frekans bir plato ulaşıncaya kadar adımları 3.3.1–3.3.6 üzerinden tarama işlemi yineleyin. Seçili Cas9 plazmid dönüşümü ve 10 ng/mL hava trafik kontrol kurtarma sırasında kullanım 10 ng. Seçici koşul için 100 ng/mL, ATC konsantrasyon korumak.
  4. Karıştırma ve ikinci tarama
    1. Aşağıdaki DNA karıştırma protokolünü kullanarak seçili havuza alınan türevleri karıştır. PCR kanat primerler, INSERT sınırları üzerinden 150 nükleotit kullanılarak Cas9 plazmid Cas9 INSERT yükseltmek. Özet 2 μg Dnaz ile güçlendirilmiş PCR ürününün ben 37 ° C'de 1 dk
    2. Parçaları 70-200 bp uzunluğu % 2 özel Jel Elektroforez kullanarak arındırmak. PCR arıtılmış parçaları yükseltmek. PCR için şablon olarak kullanmak üzere ürün uygun astar Cas9 kanat Cas9 Ekle yükseltmek. 2.1.4. adımda açıklandığı gibi bir Cas9 kitaplığı oluşturmak için son PCR ürünü kullanın.
    3. Yeni keskin nişancı-tarama hücreleri (bkz. Bölüm 3.2) başka bir uyumsuz sgRNA plazmid ile hazırlamak (bkz. Adım 3.1.1). Tarama süreci (Bölüm 3.2-3.3) hayatta kalma oranı ulaştığı bir plato kadar yineler. Seçili Cas9 plazmid dönüşümü ve 10 ng/mL hava trafik kontrol kurtarma sırasında kullanım 10 ng. ATC konsantrasyonu 10 ng/mL seçici koşul için korumak.
  5. Gelişmiş Cas9 mutant plazmid yelpazesi
    1. Son tarama adım sonra rastgele yüz kolonileri seçici plaka almak ve onları kloramfenikol içeren LB orta 42 ° C'de gecede kültür.
    2. Bir miniprep yordam ve Sanger-sıra Cas9 içinde sıralama primerler kullanılarak ekler kullanarak plazmid yalıtmak.
    3. Onları insan hücre hatlarında test etmek için en iyi üç en sık gösterim çeşitleri seçilir.

4. bir RNP ile kesilmiş sgRNA olarak Cas9 teslimini

  1. CA-OFFinder kullanarak hedef gen seçimi
    1. CA-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) ile hedef siteleri seç. Cas9 ve hedef genom özel tipi için uygun PAM türünü seçin (insan, fare, Zebra balığı, vs.). Sorgu sıraları sekmesini doldurmak, sayı uyuşmazlığıseçin ve Gönder düğmesini tıklatın.
    2. Sonra bir kaç saniye, hedef (ile uyuşmazlığı sayı '0') üzerinde ve kapalı hedef siteleri olacak görünür. Genel olarak, bir ila üç uyuşmazlıkları ile kapalı hedef siteleri seçin.
  2. SgRNA şablon hazırlanması
    1. Sipariş aşağıdaki şablon serileri, yani crRNA sırası ile crRNA ve tracrRNA oligos: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3'; tracrRNA sıra: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'. N20 4.1.2. adımda elde hedef dizisi ile crRNA sırayla doldurun. Diziler kesilmiş sgRNAs tasarım, üslerin N19, N18 veya N17 sgRNA elde etmek için 5' uç kaldırmak için.
    2. PCR karışımı amplifikasyon sgRNA kodlama sırası aşağıdaki gibi hazırlamak: birleştirmek 10 μL arabellek x 5, crRNA oligo (100 pmol/μL) 0.5 μL, tracrRNA oligo (100 pmol/μL), dNTPs (10 mM her) 2.5 μL, DNA polimeraz 0.5 μL 0.5 μL ve NFW (tablo malzemelerin) 36 μL.
    3. Yani, aşağıdaki koşullar için ilk denatürasyon kullanarak şablon yükseltmek: 1 min 98 ° c; denatürasyon, tavlama ve uzantısı: 10 98 ° c, 15 s s 54 ° c, 20 s 25 döngüsü; 72 ° c son uzantısı için: 72 ° C'de 5 dk
    4. % 2 özel jel güçlendirilmiş şablonunda DNA'dan (Adım 4.2.3) 2 μL analiz. PCR arıtma seti kullanarak şablonu arındırmak.
      Not: Şablon DNA 125 büyüklüğünde kan basıncı.
  3. SgRNA sentezi
    1. Reaksiyon karışımı sgRNA sentezi için aşağıdaki gibi hazırlamak: 8,5 μL şablonunun DNA (4.2.3 adımdaki) birleştirmek UTP (25 mM), CTP (25 mM), GTP (25 mM), ATP (25 mM), MgCl2 (100 mM) 4.2 μL 1 μL 1 μL 1 μL 1 μL , T7 RNA polimeraz (50 U/μL) 4,5 μL, 10 x T7 RNA polimeraz arabelleği 3 μL pyrophosphatase (0.5 U/μL) 1.2 μL RNase inhibitörü (40 U/μL) 0,75 μL ve NFW 4.2 μL.
    2. 37 ° C tepki karisimin gecede kuluçkaya (en az 10 h için). Dnaz 0.5 μL ekleyin (2 U/μL) tepki karışıma ve 15 – 30 dk. arındırmak bir RNA arıtma seti kullanarak sgRNA 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. SgRNA165'-trifosfat tarafından tetiklenen doğuştan gelen bağışıklık yanıtının neden toksisite azaltmak için 5'-trifosfat Kılavuzu RNA'ların buzağı bağırsak alkalen fosfataz (CIP) ile gelen aşağıdaki gibi kaldırın: içinde vitro- 10 µg tedavi transkripsiyonu RNA ile 250 U CIP 100 U RNase inhibitörü huzurunda 37 ° C'de 3 h için. Bir RNA arıtma seti kullanarak CIP tedavi sgRNA arındırmak.

5. WT ve keskin nişancı Cas9 protein ifade ve arıtma

  1. E. coli ifadede protein
    1. Evde beslenen hayvan plazmid18 O'nun öğesini WT - ve keskin nişancı-Cas9 BL21 kodlama dönüşümü (DE3) E. coli zorlanma.
    2. Evde beslenen hayvan-Cas9 ifade Plazmid ve sallamak o gecede (200 devir/dakika) 37 ° C'de (preculture) barındıran bir taze koloni ile 50 μg/mL sefaloridin içeren LB orta 50 mL aşılamak.
    3. Gecede kültür 10 mL, 500 mL taze LB orta 50 μg/mL sefaloridin içeren aktarın. 2 h 37 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile Kültür kuluçkaya.
    4. Kültür orta log fazı büyüme (OD600 ≈ 0,6-0,7) ulaşıncaya kadar OD600 izlemek.
    5. WT ya da keskin nişancı Cas9 protein izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside ile ifade teşvik (0.25 son bir konsantrasyon, IPTG nM). 18 ° c kültür gecede kuluçkaya.
  2. Protein saflaştırma
    1. Santrifüjü 5000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından hücreleri hasat
    2. Pelet gram ıslak kilo başına 20 mL adlı lizis arabellekteki (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 4 mM dithiothreitol [DTT], 5 mM benzamidine, 100 mM phenylmethylsulfonyl florür [PMSF], pH 8) resuspend.
    3. PMSF, DTT ve lizozim 1 mg/mL her son bir konsantrasyon ekleyin ve karışımı 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
    4. Buz hücrelerdeyse solüsyon içeren temizleyicide. Nabız art arda 10 için bir 10 ile 200-300 W, s s 20 min Toplam süre her darbe dönemini soğutma.
    5. Lysate 6.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de santrifüj kapasitesi
    6. Süpernatant temiz bir tüp için kaldırın. 1 mL 5 mL de O'nun bağlama özel reçine lysate temizlenmiş ekleyin ve hafifçe 4 ° C'de 1 h için sallamak
    7. Lysate/HIS-Bind özel reçine karışımı bir kaplama alt şirketi ile bir sütuna yerleştirin.
    8. Alt kapağını çıkarın ve sütun akışı aracılığıyla toplamak.
    9. Sütun 2 yıkama x ile yıkama arabellek (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8); analiz için yıkama kesir Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez tarafından (SDS-sayfa) toplamak.
    10. Protein 10 elute x 1 mL elüsyon ile tampon (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8), toplama örnekleri SDS-sayfa için.
    11. 100 kDa Sütun filtresini kullanarak eluted WT ya da keskin nişancı Cas9 protein konsantre. 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl ve % 50 gliserol-80 ° C'de çözümde örnekleri depolamak

6. RNP teslim

  1. Transfection ve hücre Hazırlık'RNP dır
    1. Kartal'ın orta (DMEM) % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 5 CO237 ° C'de % 1 antibiyotik ile takıma Dulbecco'nın HEK293T hücrelerde değişiklik korumak.
    2. WT ya da keskin nişancı Cas9 protein (2 μg) sgRNA (2 μg) ile karıştırıp RT RNP kompleksleri yapmak, 10 min için kuluçkaya.
    3. Trypsinize ve hücreleri saymak. Bir reaksiyon başına 2 x 104 hücreleri hazırlayın. Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve santrifüj hücrelerle yıkayın. Süpernatant Aspire edin ve Pelet elektroporasyon arabelleği ile resuspend.
    4. Aşağıdaki ayarları kullanarak hücre içine Electroporate RNP kompleksleri, yani 1300 V, 30 ms ve bir darbe. Plaka FBS ve (6.1.1 adımda anlatıldığı gibi) antibiyotik ile elektroporasyon şu sonra takıma DMEM 500 μL 48-şey tabakta hücreleri dolu. %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
    5. Bir gDNA hazırlık seti, 48 h transfection sonra ile genomik DNA izole et.

7. transfection keskin nişancı-Cas9 ve sgRNA kodlama plazmid

  1. Bir sgRNA plazmid inşaatı
    1. İleri sipariş ve oligos aşağıdaki şablon serileri ile yani ileri ters: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; ters: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'. N20 4.1.2. adımda elde hedef sırasını değiştirin. Hedef sıra uzunluğu N19, N18 veya N17 kesilmiş sgRNA sentezlemek için kısaltmak.
    2. Her iki oligos T4 DNA ligaz arabellek x 1 tavlamak.
    3. BsaI restriksiyon enzimi ile pRG2 vektör sindirmek.
    4. Jel arındırmak sindirilir vektör (3.300 bp) % 0,8 özel jel kullanarak.
    5. Tavlanmış oligo ve 37 ° c mix 50 ng sindirilmiş pRG2 ve 1 T4 ligaz kullanma saf parçası ligate 20 μL tepki hacmine tavlanmış oligo ng. RT 15dk için kuluçkaya.
    6. Tüp ligasyonu karışımı DH5 Alfa zorlanma dönüştürmek ve Ampisilin (100 μg/mL) 37 ° C'de içeren LB agar plakaları transformants büyümek Vektör oligo ekleme tarafından standart sıralama onaylayın.
  2. Plazmid kodlama keskin nişancı-Cas9 ve sgRNA transfection
    1. %5 CO237 ° C'de % 10 FBS ve % 1 antibiyotik ile takıma DMEM hücrelerde HEK293T korumak. Bir gün önce transfection, trypsinize ve hücreleri saymak. 48-şey ölçekte 250 μL tam büyüme ortamının bir kuyu başına plaka 1 x 105 hücre çalışırken. Hücreleri % 50-%80 birleşmesi transfection gününde olmalı.
    2. 48-şey ölçekte 250 hazırlamak p3s-Cas9 Plazmid ve 250 ng ng sgRNA plazmid lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak transfection için. Plazmid ücretsiz serum-MEM 25 μL içinde karıştırın.
    3. Transfection reaktif 1 μL ücretsiz serum-MEM 25 μL ile sulandırmak. RT karisimin 5 dk. birleştirmek için iki karışımları kuluçkaya ve form plazmid-lipofectamine kompleksleri için 20 dk için RT, çözüm elde edilen kuluçkaya.
    4. 20 dk, kuluçka, ekledikten sonra çözüm içeren 50 μL plazmid-transfection reaktif kompleksleri doğrudan her içeren hücreleri de ve karışımı yavaşça ileri geri plaka rock yaparak. CO2 kuluçka transgene ifade için raporlaması önce 48-72 h sonrası transfection için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.

8. hedef üzerinde ve hedef kapalı faaliyetleri belirlemek için hesaplama Indel frekansları

  1. Hedef üzerinde ve potansiyel hedef kapalı siteleri analizi için derin sıralama hedef
    1. Adım 6.1.5 veya 7.2.4 gDNA hazırlık seti ile genomik DNA izole et. Derin sıralama kütüphaneler gDNA PCR güçlendirme tarafından hedef üzerinde ve kapalı hedef hedefleme astar ile oluşturun.
    2. Dizin astar her örnek etiketlemek için kullanın. Havuza alınan kütüphaneler bir nesil sıralama makine kullanarak eşleştirilmiş uç sıralama için tabi.
  2. CAS-Analyzer kullanarak derin sıralama analizi
    1. Cas-Analyzer değerlendirme aracı17kullanarak derin sıralama veri analiz.
    2. Fastq dosyaları Oku 1 ve okuma 2 sekmeler altında seçin (oku 1 XX_SXX_L001_R1_001.fastq, okuma 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq =).
    3. Temel bilgiler sekmesini doldurun ve Gönder düğmesini Analiz parametrelerini sekmesini tıklatın.

Sonuçlar

Keskin nişancı-ekran gerçekleştirildikten sonra hayatta kalma kolonileri yüzdesi kloramfenikol, sefaloridin, arabinoz ve hava trafik kontrol (CKAA) içeren LB plaka üzerinde kolonileri kolonileri içinde LB plaka içeren dizi sayısı bölerek hesaplanabilir kloramfenikol ve sefaloridin sadece (CK). Keskin nişancı-ekran SpCas9 kütüphaneleri ile gerçekleştirildiğinde bu oran genellikle çok düşük. Gerçek pozitif sayısı ekranın hayatta kalan havuzlu yineleyerek zenginleştirilmiş. Bu temsilcisi keskin nişancı-ekranda, örneğin, sonra üçüncü ekran (şekil 1) %100 sağkalım oranı elde edildi. Transfections RNPs veya plazmid kodlanmış keskin nişancı-Cas9 kullanarak çeşitli hedefleri ve elde edilen Tarih-hedef için yapılabilir ve hedef kapalı faaliyetleri tarafından ölçülen amplicon sıralama (Şekil 2) hedef. En hedefleri, keskin nişancı-Cas9 hedef tarih faaliyetleri aynı düzeyde gösterir ve WT kesildi sgRNAs kıyasla daha yüksek özgüllük oranları da daha fazla özgüllük (şekil 3) geliştirmek için kullanılabilir. Ancak, çoğu durumda tam uzunlukta sgRNAs kıyasla düşük hedef üzerinde faaliyetleri sonucunda çünkü bunların kullanımı sadece bazı hedefleri için sınırlıdır. Bu nedenle, sgRNAs değişen uzunlukları (gelen 17 - için 20-mers) ile test edilmesi gereken ve hedef üzerinde ve hedef kapalı faaliyetleri özgüllük optimize etmek için ölçülen gerekir.

figure-results-1559
Şekil 1: temsilcisi keskin nişancı-ekranlar gerçekleştirilen rasgele Cas9 türevleri farklı kitaplıklarıyla. Mutator Kütüphane, EP Kütüphane ben ve EP Kütüphane II Kitaplıklar farklı ticari kitleri kullanılarak yapılan gösterir. Birinci, ikinci ve son kez zenginleştirme ekran sayısı7gerçekleştirilen gösterir. Bu rakam Lee vd.7' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2282
Şekil 2: hedef üzerinde ve hedef plazmid veya RNP ile teslim bir 20-mer Kılavuzu sırası ile eşleştirilmiş faaliyetleri WT-Cas9 veya keskin nişancı-Cas9. Özgüllük oranları hedef üzerinde Etkinlik hedef dışı etkinlik tarafından bölünerek belirlenmiştir. Hata Çubuklarõn SEM (n = 3)7. Bu rakam Lee vd.7' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2986
Şekil 3: Tarih-hedef ve hedef kapalı keskin nişancı-Cas9 WT-Cas9 sgRNAs FANCF01 ve AAVS sitelerini hedefleme değişken uzunluktaki kullanılarak elde karşılaştırıldığında faaliyetlerinin. Özgüllük oranları Indel frekansları hedef tarih sitelerde bu ilgili hedef uzak sitelerdeki bölünerek belirlenmiştir. sgRNAs 5' terminus (GX18 veya GX19), eşleşen bir guanin ile ve bu eşleşmeyen bir guanin (gX17, gX18, gX19 veya gX20) ile gösterilir. Özgüllük oranları olarak hesaplanmadığını normalleştirilmiş hedef üzerinde faaliyetleri yaşındayken < % 707. Bu rakam Lee vd.7' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Keskin nişancı-Cas9 elde etmek için hantal tarama işlemleri önlemek için isteyenler için keskin nişancı-Cas9 protein ve kodlama plazmid mevcuttur. Bu malzemelerin sağlayan en yüksek özgüllük oranı tespit edilmelidir sgRNA, optimum uzunluğu kullanarak. Buna ek olarak, bir plazmid biçimde teslim daha yüksek özgüllük oranı genellikle sonuçlanan keskin nişancı-Cas9 ve sgRNA RNP biçimde önerilir. Keskin nişancı-Cas9 farklı olarak, diğer mühendislik Cas9 türevleri kesilmiş sgRNAs6,7 veya teslim RNP formu8 (dışında HiFi-Cas9) ile uyumlu değildir.

Keskin nişancı-ekran için en önemli adım eşleşmeyen sıra seçimidir. GOI sıra doğru düşük bölünme aktivitesiyle ilişkilendirilmiş eşleşmeyen bir sgRNA yelpazesi kaçınılmalıdır. Eğer değilse, Cas9 türevleri özgüllük WT düzeyi olan E. coli genomik DNA ile eşleşmeyen hedef site ayırmak değil. Bu etki çok sayıda arka plan koloniler, yordam eleme bütün tehlikeye neden olur.

E. coli hızlı olduğundan zaman ve yüksek dönüşüm verimliliği Maya, keskin nişancı ekran göre iki katına avantajlı Maya tabanlı tarama yöntemleri için karşılaştırılır. Ayrıca, keskin nişancı ekran diğer E. colidaha duyarlı olmalıdır-bir plazmid tabanlı sistemler eşleşmeyen sitesine gerçekleşiyor: genomik DNA'ın bir kopyası ve böylece tek sistemimiz, ancak çok sayıda eşleşmeyen sitesine kopyasını Plazmid içinde tek bir E. coli hücre.

DSBs, SaCas9 veya Cpf1s, gibi neden diğer DNA endonucleases özelliklerine de keskin nişancı ekran kullanarak gelişmiş olabilir. Ne yazık ki, temel editörler genomik DNA E.coli DSBs ikna etmek değil çünkü keskin nişancı ekran doğrudan, temel editörler özgüllüğü artırmak için kullanılamaz. Nickase veya Cas9, ölü sürümünde kendi sisteminin temel editörleri kullanmak gibi temel editörler özelliklerine keskin nişancı-ekran elde edilen sayısı kullanarak artış.

Açıklamalar

ToolGen Sniper-ekran kapsayan bir patent başvurusu (PCT/KR2017/006212) Filed under (durumu: beklemede, mucit: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung ve Euihwan Jeong ToolGen A.ş. çalışanları vardır

Teşekkürler

Bu araştırma bilim Bakanlığı ve Kore ICT (2017M3A9B4061406) ve Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Jungjoon K. Kore hükümeti (MSIT) (grant numaraları 2017M3A9B4061404 ve 2018M3A9H3020844) tarafından finanse edilen NMG) gelen hibe tarafından desteklenmiştir Lee. PGRG36 kodlama plazmid Nancy Craig (Addgene plazmid #16666) hediye etmişti ve p11-dantel-wtx1 Huimin Zhao hediyesiydi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)NEBM0290L
Ampicillin Sodium SaltFisher ChemicalBP1760-25
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma Aldrich37919 or 94664
Antibiotic Antimycotic solutionWelgeneLS203-01Media component
BamHIEnzynomicsR003L
ChloramphenicolSigma AldrichR4408
Diversify PCR Random MutagenesisClontech630703Error-prone PCR kit
DNA-Shuffling KitJena BiosciencePP-103
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM001-17Culture media
Endura Electrocompetent Cells (DUO)Lucigen60242-2E. coli electrocompetent cells for library preparation
Fetal Bovine Serum (FBS)WelgeneS101-01Media component
Gene Pulser IIBio-RadE. coli electroporation equipment
GeneMorph II Random Mutagenesis KitAgilent200550Error-prone PCR kit
genomic DNA prep kitGenAll106-152gDNA-prep kit
GlycerolBioShopGLY001.1
GP/MP Cuvette, 0.1cmBio-RadBR165-2089E. coli electroporation equipment
HEK293T cellATCCCRL-11268Human cell line
Kanamycin sulfateAcros Organics450810500
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA3256-25G
LaboPass PCR Purification KitCosmogenetechCMR0112
LaboPass Plasmid MiniCosmogenetechCMP0112Mini-prep kit
LB Agar MillerFormediumLMM0202
LB Broth MillerFormediumLMM0102
LipofectamineInvitrogen11668019Transfection reagent
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LGibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture
Neon Transfection SystemThermoMPK5000RNP Electroporation equipment
Neon Transfection System 10 µL KitThermoMPK1096RNP Electroporation equipment
NucleoBond Xtra Midi EFMacherey-Nagel740420.50Midi-prep kit
Oligo Clean & ConcentratorZymo ResearchD4061DNA purification kit that enables low-volume elution
Opti-MEMGibcoLS31985070Transfection media
p11-lacY-wtx1Addgene#123945
pgrg36Addgene#16666E. coli mutator strain
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530L
PyrophophataseNEBM2403L
Ribonucleotide Solution SetNEBN0450L
RNase inhibitorNEBM0314L
T7 RNA polymeraseNEBM0251L
Turbo DnaseAmbionAM2238
XbaIEnzynomicsR013L
XL1-Red Competent CellsAgilent200129

Referanslar

  1. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  2. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  3. Chen, J. S., et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy. Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).
  4. Kleinstiver, B. P., et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).
  5. Slaymaker, I. M., et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  6. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  7. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
  8. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
  9. Anderson, K. R., et al. CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nature Methods. 15, 512-514 (2018).
  10. Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides. Genome Biology. 18 (1), 218 (2017).
  11. Kulcsar, P. I., et al. Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage. Genome Biology. 18 (1), 190 (2017).
  12. Zhang, D., et al. Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases. Genome Biology. 18 (1), 191 (2017).
  13. McKenzie, G. J., Craig, N. L. Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event. BMC Microbiology. 6, 39 (2006).
  14. Geissmann, Q. OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects. PLoS One. 8 (2), e54072 (2013).
  15. Chen, Z., Zhao, H. A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases. Nucleic Acids Research. 33 (18), e154 (2005).
  16. Kim, S., et al. CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).
  17. Park, J., et al. Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data. Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).
  18. Studier, F. W., et al. Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes. Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 144keskin ni anchedef kapalTarih hedefCRISPRCas9RNPplazmid

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır