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要約

ここでは、ターゲット上の活動の損失することがなくより高い特定性を達成するために CRISPR Cas9 を最適化するためにプロトコルを提案する.狙撃スクリーンと呼ばれる進化のアプローチを使用して、所望の特性を持つ変異体 Cas9 を見つけます。スナイパー Cas9 は切り捨てられた単一ガイド Rna とリボ核蛋白質形式で配信より高い特異性を達成するためのよく知られている戦略と互換性が。

要約

クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) の開発-治療戦略に関連付けられている蛋白質 9 (Cas9) その潜在的有害なオフターゲット効果の回避が必要です。このような効果を減らすためにいくつかの方法が考案されています。今回、大腸菌-ベース進化メソッドは最適化された特異性 Cas9 のバリアントを取得する狙撃画面を呼び出され、狙撃兵 Cas9 と呼ばれる対象のアクティビティを保持します。狙撃画面を使用して、正と負の選択を同時に実行することができます。画面は、真の肯定的なヒット曲を豊かにするその他の単一ガイド RNA (sgRNA) のシーケンスを繰り返すことができます。Cas9 のバリエーションを表現する CMV PltetO1 デュアル プロモーターを用いて、哺乳類細胞でプールされたライブラリのパフォーマンスをすばやくチェックできます。スナイパー Cas9 の特異性を高めるための方法について述べる。最初に、切り捨てられた sgRNAs の使用は以前 Cas9 特異性を増加する示されています。その他の設計された Cas9s とは異なりは、狙撃 Cas9 は、ターゲット上の活動切り捨てられた sgRNAs と組み合わせた場合の野生型 (WT) レベルを保持します。第二に、プラスミドの形式ではなくリボ核タンパク質 (RNP) 形式での狙撃兵 Cas9 の配信は、その対象の活動に影響を与えることがなく可能です。

概要

この論文では異なる戦略を組み合わせることによって Cas9 の特異性を向上を目指します。CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を回避するためのさまざまな方法が開発されています。たとえば、切り捨てられた sgRNAs は、高い特異性1を達成するために使用できます。さらに、高い特異性2を取得する RNP 形式にプラスミド形式からの Cas9 の配信方法を変更できます。化膿連鎖球菌Cas9 の特定のアミノ酸残基 (SpCas9) 蛋白質によると、合理的な変更された設計は前述3,4,5。また、アミノ酸残基は、ランダムな方法で変更されている、最高の特異性を持つ Cas9 亜種は酵母6または大腸菌7,8スクリーニング システムのいずれかを使用して識別されました。

しかし、多くのグループは Cas9 バリアント設計デザインを使用して Cas9 と基板の展示対象の活動量の少ない7,8,9,の非特異的な相互作用を消耗することを報告しています。10,11,12。 我々 は、大腸菌を開発-ベースの狙撃画面、画面のランダムに人為 Cas9 亜種に進化システム。スクリーニング システムエシェリヒア属大腸菌大腸菌の高速化 2 倍時間と高い変換効率のため酵母システム上の利点があります。

3 つの異なるプラスミドと大腸菌ゲノムに興味 (五井) の遺伝子に基づく正および負の選択は、狙撃画面で使用されます。Subcloning を必要とせず哺乳類細胞における大腸菌で特定の候補者をテストできるように、低コピー数プラスミドの CMV PltetO1 デュアル プロモーター システムの下で Cas9 のバリエーションを表現します。五井は Tn7 トランスポゾンを用いた大腸菌のゲノムに導入されます。SgRNA プラスミド複製の温度に敏感な起源を含んだ表現五井; をターゲット、sgRNAただし、sgRNA と五井シーケンスは、完全に一致がないです。完全に一致した sgRNA ターゲット サイトは、ジャイレースの毒致死製品をエンコードccdB遺伝子を含む 3 番目のプラスミドに存在します。このシステムは、二重鎖切断 (Dsb) のゲノム DNA にある不一致のサイトに導入されますのでオフのターゲットの高い活動と Cas9 の亜種を発現する細胞が削除されます。その一方で、対象の活動量の少ない Cas9 亜種を発現する細胞も致死ccdB遺伝子発現のため削除されます。Cas9 亜種の発現レベルは、選択力を調整 anhydrotetracycline (ATC) の濃度を変えることによって変更できます。

我々 はゲノム DNA ではなく、プラスミド、不一致 sgRNA ターゲット サイトを検索システムの感度を高めるだろうと推論しました。このアプローチの利点は 1 つのゲノムのサイトがあることそれぞれ 1 つのターゲット サイトを含む多くのプラスミドがあるに対しエシェリヒア属大腸菌のセル。

このシステムを使用して、Cas9 のバリアント、狙撃兵-Cas9、WT レベル対象のアクティビティが表示されますし、WT Cas9 に比べてオフのターゲット活動の減少がわかりました。スナイパー Cas9 プラスミド ベースの配信ではなく、切り捨てられた sgRNAs または RNP ベースの配布を使用して、さらに高い特異性比を実現できます。

プロトコル

1. 人間五井の BW25141大腸菌株への統合

  1. 五井のクローニング
    1. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は、ノッティと XhoI の制限酵素サイトを含むプライマー標準 PCR 法による様々 な候補者のターゲット ・ サイトを含む人間五井の 500 bp の長さを増幅します。
      注: この実験で五井 EMX1遺伝子だった。
    2. ノッティと XhoI 制限の酵素と pgrg3613ベクトルと PCR の製品を消化します。
    3. ゲルは、目的のフラグメント (500 bp、12 kb) を浄化します。
    4. T4 リガーゼを使用してフラグメントを縛る。これを行うには、ミックス 50 消化 pgrg36 と 6 の ng 1 x リガーゼ バッファーと 0.5 U リガーゼの酵素を含む 20 μ L の反応量の PCR 挿入の ng。一晩 (RT) 室温で孵化させなさい。
    5. 縛られたプラスミッドを dh 5 位 α 有能なセルに変換します。32 ° c (100 μ g/mL) アンピシリンを含むルリア スープ (LB) 寒天の結果として得られる形質転換体を成長し、一晩インキュベートします。コロニーをピックアップし、一晩アンピシリンを含む LB 媒体の成長します。プラスミド大腸菌、市販 miniprep のキットを使用してからの DNA を分離します。サンガー ミニ プラスミッドの準備 (小型準備)13から得られたプラスミドをシーケンスによって五井フラグメントの挿入を確認します。
  2. BW25141-五井の準備
    1. BW25141大腸菌株に得られた pgrg36五井プラスミドを変換します。BW25141 ひずみを使用して、偽の肯定的なコロニーの数を最小限に抑えるために不可欠です。
    2. 32 ° C で LB バッファーに変換されたセルを一晩成長します。五井は、BW25141 株 (BW25141-五井) のゲノム DNA に挿入されます。標準的な pgrg36 プロトコル13を使用して BW25141-五井ひずみから pgrg36五井プラスミドを削除します。簡単に、植民地を希釈 (約 107-フォールド) し一晩、42 ° C で LB プレートに成長します。LB プレートのコロニーを連勝、一晩 42 ° C でそれらを育てます。
    3. コロニー pgrg36 プロトコルで提案したプライマーを用いた PCR による正しい五井挿入を確認: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3 'と 5'-GATGACGGTTTGTCACATGGA-3'。ゲノム DNA 挿入部位を増幅するプライマーと結果として得られる PCR の製品のサイズは 904 になります bp プラス挿入のサイズ (500 この場合 bp)。
    4. Electrocompetent BW25141-五井細胞 (詳細なプロトコル、手順 3.2.6–3.2.10 で説明します) を準備します。

2. Cas9 バリアント ライブラリの準備

  1. ライブラリの準備
    1. 変換 Cas9 ベクトル7商業エシェリヒア属大腸菌にミューテーター (資材表) をひずみし、バリアント ライブラリ (ミューテーター ライブラリ) を取得する製造元の指示に従ってください。
    2. エラーを起こしやすい PCR キット (資材表) を使用して、Cas9 ベクターの WT Cas9 シーケンス全体でエラーを起こしやすい PCR を実行します。
      注: 低エラーレート プロトコルは蛋白質の元の機能を中断することを避けるために狙撃 Cas9 ケースに採択されました。
    3. 適切な制限の酵素と Cas9 ベクトルを消化します。ゲル (ステップ 2.1.2) から PCR の製品と消化のバックボーンを浄化します。
      注: SpCas9 遺伝子のサイズが約 4.3 kb です。XhoI KpnI 狙撃 Cas9 ケースに使われていた pBLC SpCas9 ベクトルを消化するため選ばれました。
    4. (ステップ 2.1.3) からバックボーン フラグメントと等温の in vitro再結合を介して (ステップ 2.1.3) からエラーを起こしやすい PCR を使用して増幅された挿入を組み立てます。
      注: 以上 500 (エラーを起こしやすい PCR [EP] 図書館) の高濃度に必要なバックボーンの ng。スナイパー Cas9 ケースで EP ライブラリを準備する 2 つの異なるエラーを起こしやすい PCR キットが使用された (EP ライブラリ I および II)。
    5. (ステップ 2.1.4) からアセンブリから製品を浄化する低ボリューム溶出 (資材表) を可能にする DNA 精製キットを使用します。ヌクレアーゼ フリー水 (NFW) の 6 μ L の溶出し、DNA の濃度を測定します。
    6. 500 以上の変換 electrocompetent大腸菌細胞 (材料表) の 50 μ L に (3 つのライブラリのそれぞれ) のための Cas9 ライブラリ ベクトルの ng。手順 3.2.1-3.2.4 でエレクトロポレーション プロトコルを参照してください。このライブラリの準備のためには、有能なセルの 50 μ L あたり 250 μ L の代わりに SOC 培地 1 mL を使用します。
    7. 作る 1:1、1: 100 000、1: 10,000 のおよび希薄 SOC 培地で回復した細胞を含んでいる混合物。クロラムフェニ コール (12.5 μ g/mL) を添加した 100 mm LB 寒天培地プレートに希釈した細胞をプレートします。245 mm2プレートの残りの細胞をプレートします。37 ° C で一晩インキュベートします。
  2. ライブラリの複雑さの計算
    1. 希釈板ゲルのドキュメンテーション システムまたは普通のデジタル カメラの写真します。OpenCFU ソフトウェア14を実行し、希釈プレートの写真をアップロードします。プレート内部カウントの領域を設定し、偽の植民地を削除します。
    2. 手動で形質転換体の元の数を取得する希釈倍率によってコロニーの数を乗算します。これらの数字を対数形式 (基本 10) に変換します。ライブラリの複雑さを決定する平均を計算します。
    3. 望ましい複雑さの値が取得されると、ステップで収集すべての植民地 245 mm 正方形板 (2.1.7) スプレッダーとクロラムフェニ コールを添加したポンドの 20 mL を使用しています。収集したコロニーを成長しないし、商業 midiprep キットを使用してプラスミッド ライブラリを浄化します。
      注: ライブラリ複雑さより良い。スナイパー Cas9 確認されたため、3 × 106の多様性はライブラリごとに達成されました。

3. 正と負 Cas9 の進化のスクリーニング

  1. ターゲットの選択とプラスミド構築
    1. 五井でターゲット sgRNA スペーサー シーケンスを選択します。一致シーケンスを生成するランダムな塩基配列に 1 つまたは 2 つの残基に置き換えてください。
      注: 人間EMX1ターゲット サイト 3 (GGG pam GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA) は狙撃 Cas9 ケースで使用されました。以下は、使用される不一致シーケンス: GAGTCCGAGCAGAAagAGAA、GAacCCGAGCAGAAGAAGAA、GAGTCCGAGCAGAgGAAGAA、および GAGcCCGAGCAGAAGAAGAA。
    2. 一致シーケンスを挿入 (手順 3.1.1 参照) 標準的なオリゴヌクレオチド (オリゴ) 手順7のクローン作成を使用して sgRNA プラスミドに。
    3. P11-レース-wtx1 (材料表) 標準的なオリゴ クローン手順15を使用してccdBプラスミドを構築するために 3' 端に PAM と不一致のシーケンスを挿入します。
  2. スナイパー スクリーニングエシェリヒア属大腸菌の有能なセルの準備
    1. 雪解けの氷の上の BW25141-五井electrocompetent セル。
    2. 1 を追加各ccdBプラスミッドおよび解凍 BW25141-五井細胞の 50 μ L にダブルの不一致 sgRNA プラスミドの ng。軽くピペッティングにより細胞をミックスし、prechilled 0.1 cm エレクトロポレーション キュベットに移動します。
    3. 電気穿孔法による 2 種のプラスミドを持つ大腸菌を変換します。エレクトロポレーション後すぐに 250 μ L の SOC 培地を追加します。優しく、細胞と培地を混合するソリューションをピペットします。1.5 mL 遠心チューブに混合物を転送します。
      注: 最大効率のためには、電圧を設定 1.80 kV とランタイムは 4.8 ミリ秒から 5.0 ms の間する必要があります。
    4. トランス ホーム細胞を回復し、穏やかな揺れで 1 h 32 ° C でそれらを孵化させなさい。
    5. アンピシリン (50 μ g/mL) に回復した細胞の 125 μ L をプレート/カナマイシン (25 μ g/mL) LB 寒天培地プレート (培養条件)。残りの板細胞、アンピシリン/カナマイシン/アラビノース (1.5 mg/mL) LB 寒天培地プレート (ccdB-条件を表現する)。32 ° C で一晩インキュベートします。
    6. CcdBのコロニーの存続の有無を確認します-条件プレートを表現します。スプレッダーとアンピシリンの 50 μ g/mL と 25 μ g/mL 32 ° c、カナマイシンを添加した超最適スープ (すすり泣き) 媒体の 250 の mL では揺れ穏やかな文化を使用して培養条件プレートからコロニーを収集します。
    7. とき 600 nm (外径600) に達すると、0.4 の光学濃度は、氷上フラスコを冷やします。Prechilled の脱イオン水と prechilled の 10% グリセロールの解決の準備 (使用する前に消毒する)。
    8. (4 ° C で 5 分間 4,000 x g ) で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します。Prechilled の脱イオン水 200 ミリリットルを追加します。10 mL の血清ピペットを使用して細胞を再懸濁します。3 x この手順を繰り返します。
    9. Prechilled 10% グリセリン溶液の 50 mL の細胞を洗浄します。前と同じように、に (4,000 x g 4 ° C で 5 分間) でそれらを遠心します。
    10. 上澄みを廃棄し、300 μ L の 10% グリセリン溶液でペレットを再懸濁します。50 μ L の因数を行い、それらを液体窒素で凍結します。-80 ° C の細胞 (狙撃スクリーニング細胞) の保存します。
  3. スナイパー スクリーニング
    1. 100 (ステップ 3.2.10) から狙撃スクリーニング細胞を変形 (ステップの 2.2.3.See ステップ 2.1.1 と 2.1.4) から各ライブラリから Cas9 バリアント プラスミドの ng。手順 3.2.1–3.2.3 で説明されているエレクトロポレーション手順に従います。
    2. セルの 250 μ L を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。10 ng/mL の最終的な集中に ATC の 250 ページを追加します。(手順 3.2.4 リカバリ手順を参照してください) ATC 含むと ATC 無料両方の細胞を回復します。
    3. クロラムフェニ コール/カナマイシン LB 寒天培地プレート (非選択状態) に復元された ATC 無料細胞の 25 μ L をプレートします。ATC を 245 mm LB プレートに 100 ng/mL の最終濃度に回復した ATC を含むセルに追加します。すぐにクロラムフェニ コール、カナマイシン、アラビノース LB 寒天培地プレート (選択状態) に細胞をプレートします。32 ° C で一晩インキュベートします。
      注: サイズと LB プレートの数は、スクリーニング カバーの多様性のサイズによって決定されます。100 mm ペトリ皿を 20 mL LB の ATC の 2 μ g を追加します。
    4. 写真のプレート。OpenCFU ソフトウェア14を使用して実行可能なコロニーの数をカウントします。(2.2.1 手順を参照)非選択的プレートのコロニー数が少なくとも 10 倍にすべてのバリエーションをカバーするライブラリの多様性もであることを確認します。
    5. 生存周波数を次のように計算します。
      生存周波数選択板のコロニーの数を =/(非選択的プレート x 10 のコロニー数)
    6. すべての 3 つのライブラリから選択式ナンバー プレートで生き残ったコロニーをプールします。250 mL の LB 培地クロラムフェニ コール μ g/mL 12.5 42 ° C で一晩添加に生き残ったコロニーを孵化させなさい。スクリーンの Cas9 ライブラリ midiprep キットを使用して DNA を分離します。
      注: この手順は、sgRNA プラスミドをクリアします。
    7. 生存周波数に達する高原までの手順 3.3.1–3.3.6 からスクリーニング プロセスを繰り返します。変換に 10 ng/mL ATC の回復中に選択した Cas9 プラスミドの使用 10 ng。選択条件の 100 ng/mL で ATC 濃度を維持します。
  4. シャッフルと二次検診
    1. 次の DNA シャフリング プロトコルを使用して選択されたプールされたバリアントをシャッフルします。PCR 増幅並ぶプライマー、挿入の境界からの 150 のヌクレオチドを使用して Cas9 プラスミド Cas9 の挿入です。ダイジェスト 2 μ g の増幅 PCR の製品の私は 37 ° C で 1 分
    2. 2% アガロースゲル電気泳動を使用して長さの断片 70-200 bp を浄化します。PCR は、精製のフラグメントを増幅します。Pcr のテンプレートとして使用製品は、適切なプライマー Cas9 を並べると Cas9 挿入を増幅します。2.1.4 の手順で説明されているように Cas9 ライブラリを構築するのに最後の PCR の製品を使用します。
    3. 別の不一致 sgRNA プラスミドを持つ新しい狙撃スクリーニング細胞 (3.2 節参照) を準備 (3.1.1 の手順を参照してください)。高原は生存率に達するまで (セクション 3.2-3.3) のスクリーニング プロセスをやり直します。変換と回復中に 10 ng/mL ATC の選択した Cas9 プラスミドの使用 10 ng。選択条件の 10 ng/mL で ATC 濃度を維持します。
  5. 進化した Cas9 変異体プラスミドの選択
    1. 最後の選考ステップ後ランダムに 100、選択式ナンバー プレートからコロニーを拾うし、一晩 42 ° C でクロラムフェニ コールを含む LB 培地でそれらを文化します。
    2. Cas9 内配列のプライマーを使用して挿入 miniprep プロシージャとサンガー シーケンスを使用してプラスミッドを分離します。
    3. ひと培養細胞でそれらをテストするトップ 3 つの最も頻繁な亜種を選択します。

4. 切り捨てられた sgRNA と RNP として Cas9 の配信

  1. Ca OFFinder を使用してターゲット遺伝子選択
    1. Ca-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) とターゲット ・ サイトを選択します。Cas9 とターゲットのゲノムの特定の種類に適した PAM 型を選択 (ヒト、マウス、ゼブラフィッシュなど。)。クエリの順序タブを入力、数が一致しませんを選択し、送信ボタンをクリックします。
    2. 後、数秒、('0' 数の不一致) で [ターゲットとオフのターゲット サイトが表示されます。通常、1 ~ 3 の不一致とオフのターゲット サイトを選択します。
  2. SgRNA テンプレートの準備
    1. 次のテンプレートのシーケンス、すなわち crRNA シーケンスと crRNA と tracrRNA oligos を注文: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAA-3';tracrRNA シーケンス: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'。4.1.2 の手順で得られたターゲット シーケンスの crRNA シーケンスを N20 を入力します。切り捨てられた sgRNAs を設計するには、N19、N18、または N17 の sgRNA シーケンスを取得する 5' 末端から拠点を削除します。
    2. 次のように sgRNA エンコード シーケンスの拡大のため、pcr を準備: バッファー x 5 の 10 μ L、crRNA オリゴ (100 pmol/μ L) の 0.5 μ L、0.5 μ L tracrRNA オリゴ (100 pmol/μ L)、(10 mM) の dNTPs の 2.5 μ L、0.5 μ L の DNA ポリメラーゼの結合、と NFW (材料表) の 36 μ L。
    3. 初期変性のすなわち、次の条件を使用してテンプレートを増幅: 98 ° C で 1 分変性、アニーリング、および拡張のため: 10 98 ° c、15 s 54 ° c、20 s 72 ° c、25 サイクル s最終的な拡張子: 72 ° C で 5 分
    4. 2 μ L の 2% の agarose のゲルに増幅されたテンプレート (ステップ 4.2.3) からの DNA を分析します。PCR 精製キットを使用してテンプレートを浄化します。
      注: テンプレート DNA のサイズは 125 bp。
  3. SgRNA の合成
    1. 次のように sgRNA 合成の反応混合物を準備: テンプレート DNA (ステップ 4.2.3) からの 8.5 μ L を組み合わせて UTP (25 mM)、CTP (25 mM)、GTP (25 mM)、ATP (25 mM)、MgCl2 (100 mM) の 4.2 μ L の 1 μ L の 1 μ L の 1 μ L の 1 μ L、T7 RNA ポリメラーゼ (50 U/μ L) の 4.5 μ L、10 x T7 RNA ポリメラーゼ バッファーの 3 μ L、ピロホスファターゼ (0.5 U/μ L) の 1.2 μ L、RNase 阻害剤 (40 U/μ L)、0.75 μ NFW 4.2 μ。
    2. 37 ° C で反応混合物を一晩インキュベート (少なくとも 10 時間)。DNase の 0.5 μ L を追加 (2 U/μ L) 反応混合物を 15-30 分浄化 RNA 精製キットを使用して sgRNA の 37 ° C で孵化させなさいと。
    3. SgRNA165' リン酸によってトリガーされる生得の免疫反応によって引き起こされる毒性を減らすためには、5'-三リン酸ガイドから外します Rna ふくらはぎ小腸アルカリホスファターゼ (CIP) で次のように:体外の 10 μ g の治療250 U 100 U の RNase 阻害剤存在下で 37 ° C で 3 h の CIP の転写 RNA。RNA 精製キットを使用して CIP 処理 sgRNA を浄化します。

5. WT と狙撃 Cas9 タンパク質の発現と精製

  1. 大腸菌でのタンパク質発現
    1. ペット プラスミド18 BL21 彼の付けられた WT- と狙撃兵-Cas9 にエンコードを変換 (DE3)エシェリヒア属大腸菌の緊張。
    2. ペット Cas9 発現プラスミドやふれ 37 ° c (清酒) (200 rpm) を一晩それをかくまっている新鮮なコロニーで 50 μ g/mL カナマイシンを含む LB 培地 50 mL を接種します。
    3. 一晩かけて培養の 10 mL を 50 μ g/mL カナマイシンを含む新鮮な LB 培地 500 mL に転送します。2 h の 37 ° c (200 rpm) を振動と文化を孵化させなさい。
    4. 文化成長 (外径600 ≒ 0.6-0.7) の中間ログ段階に達するまでは、外径600を監視します。
    5. イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside WT または狙撃 Cas9 蛋白質の発現を誘導する (IPTG 最終濃度 0.25 nM)。18 ° C で文化を一晩インキュベートします。
  2. 蛋白質の浄化
    1. 4 ° C で 10 分間 5,000 × gで遠心分離によって細胞を収穫します。
    2. グラム湿重量あたり 20 mL の溶解バッファー (50 mM NaH2PO4, 300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール、4 mM ジチオトレイトール [DTT]、5 mM benzamidine, 100 mM 特異フッ化物 [PMSF]、pH 8) にペレットを再懸濁します。
    3. PMSF、DTT、リゾチームを加える最終濃度 1 mg/mL と混合物 30 分間氷の上を孵化させなさい。
    4. 氷の上の細胞を超音波照射します。10 の繰り返しパルス 10 で 200-300 W に s s 総時間 20 分、各パルスの間の期間を冷却します。
    5. ライセートの 4 ° C で 30 分間 6,000 × gで遠心分離します。
    6. 新鮮なチューブに上清を除去します。彼バインド agarose 樹脂 5 mL に 1 mL クリア ライセートを加え、4 ° C で 1 時間を軽く振る
    7. キャップの下のコンセントを列にライセート/彼バインド Agarose 樹脂の混合物をロードします。
    8. ボトム キャップを削除し、列の流れを介して収集します。
    9. コラム 2 を洗浄洗浄バッファー (50 mM NaH2PO4, 300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール pH 8); xナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分析のため洗浄率を収集します。
    10. 溶出蛋白質 10 x 1 ml の溶出バッファー (50 mM NaH2PO4, 300 mM の NaCl、250 mM のイミダゾール pH 8) 収集サンプルの SDS ページの。
    11. 100 kDa 列フィルターを使用して溶離された WT または狙撃 Cas9 蛋白質を集中します。-80 ° C で 10 mM トリス-HCl、150 mM の NaCl、および 50% グリセリン溶液のサンプルを格納します。

6. RNP 配信

  1. トランスフェクションと RNP 配信用細胞の調製
    1. ダルベッコ HEK293T 細胞変更 10% 牛胎児血清 (FBS) と 5% CO2と 37 ° C で 1% 抗生物質を添加したイーグル培地 (DMEM) を維持します。
    2. WT や狙撃 Cas9 蛋白質 (2 μ g) を混ぜて sgRNA (2 μ g) と RNP 複合体に RT で 10 分間インキュベートします。
    3. Trypsinize し、セルをカウントします。2 x 10 の4セルあたり 1 つの反作用を準備します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) および遠心分離機の細胞を洗浄します。上清を吸引し、エレクトロポレーション バッファーでペレットを再懸濁します。
    4. 次の設定を使用してセルに Electroporate RNP 複合体、すなわち 1300 V、30 ms と 1 パルスします。プレート 48 ウェル プレート上のセル、エレクトロポレーション後 FBS と抗生物質 (6.1.1 のステップで説明します)、DMEM の 500 μ L でいっぱい。5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
    5. GDNA 準備キット、トランスフェクション後 48 時間でゲノム DNA を分離します。

7. プラスミドの狙撃兵 Cas9 と sgRNA のトランスフェクション

  1. SgRNA プラスミドの建設
    1. 前方を注文し、前方すなわち次のテンプレート シーケンス oligos を逆: 5'-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3';逆: 5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'。N20 を 4.1.2 の手順で得られたターゲット シーケンスに置き換えます。ターゲット シーケンスを N19、N18、または N17 切り捨てられた sgRNA を合成するための長さを短きます。
    2. T4 DNA リガーゼ バッファー × 1 で両方 oligos をアニールします。
    3. PRG2 ベクトル BsaI 制限の酵素と消化します。
    4. ゲルの浄化消化のベクトル (3,300 bp) 0.8% の agarose のゲルを使用しています。
    5. 焼なましオリゴと消化 pRG2 の 37 ° c: ミックス 50 ng で 1 T4 リガーゼを使って浄化されたフラグメントを縛る 20 μ L の反応量の焼なまし oligo の ng。室温で 15 分間インキュベートします。
    6. 結紮混合物を dh 5 位アルファひずみに変換し、37 ° C で (100 μ g/mL) アンピシリンを含む LB 寒天培地プレートに形質転換体を育てる標準シーケンスによるベクトルの oligo の挿入を確認します。
  2. プラスミドの狙撃兵 Cas9 と sgRNA のトランスフェクション
    1. 5% CO2と 37 ° C で 10 %fbs と 1% 抗生物質で DMEM HEK293T 細胞を維持します。トランスフェクション、前日 trypsinize のセルをカウント.ときに完全な成長媒体の 250 μ L の井戸あたりプレート 1 × 105セル 48 ウェル スケール勤務。セルは、当日 transfection の 50-80% の合流をする必要があります。
    2. 48 よくスケールで準備 250 p3s Cas9 プラスミドと 250 の ng 脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた遺伝子導入の sgRNA プラスミドの ng。25 μ L の血清無料の MEM でプラスミドをミックスします。
    3. 25 μ L の血清無料の MEM のトランスフェクション試薬の 1 μ L を希釈します。孵化 5 分結合の常温混合物 2 つの混合物およびプラスミド lipofectamine 錯形成に 20 分間、RT で得られた溶液を孵化させなさい。
    4. インキュベーションの 20 分後プラスミド トランスフェクション試薬複合体直接それぞれに含まれている細胞をよく、軽く混ぜるロッキング プレートを前後を含む混合溶液 50 μ L を追加します。遺伝子発現のための試金する前に 48-72 h ポスト transfection のため CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。

8. ターゲットとターゲットをオフ活動を決定する塩基頻度の計算

  1. [ターゲットと潜在的なターゲットをサイトの分析のためのディープ シーケンスを対象と
    1. 6.1.5 または 7.2.4 gDNA 準備キットとステップからゲノム DNA を分離します。[ターゲットとターゲットをターゲットのプライマーと、gDNA の PCR 増幅によるディープ シーケンス ライブラリを生成します。
    2. 各サンプルのラベルにインデックスのプライマーを使用します。次世代シーケンス マシンを使用してペアエンド シーケンスのプールされたライブラリを対象します。
  2. Ca アナライザーを使用してディープ シーケンス解析
    1. Ca アナライザー評価ツール17を使用してディープ シーケンス データを分析します。
    2. 1 読み取りと読み取り 2タブの下 Fastq ファイルを選択 (読み取り 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq、読み取り 2 = XX_SXX_L001_R2_001.fastq)。
    3. [基本情報] タブに記入し、解析パラメーター ] タブは、送信ボタンをクリックします。

結果

植民地の生存の割合を LB プレートを含むコロニーの数によってクロラムフェニ コール、カナマイシン、アラビノース、および ATC (CKAA) を含む LB プレートのコロニーの数で除して計算できます狙撃画面の実行後クロラムフェニ コール及びカナマイシンのみ (CK)。狙撃画面が SpCas9 のライブラリで実行されたとき、この割合は通常非常に低かった。真正のヒットは、存続のプールが付いているスクリーンを繰り返すことによって濃縮することができます。たとえば、100% 生存率はこの代表の狙撃兵-画面で 3 番目の画面 (図 1) の後得られました。さまざまなターゲットおよび結果のターゲットの結合またはプラスミッドでエンコードされた狙撃兵 Cas9 を使用して transfections を行うことができます、ターゲットを離れて活動によって測定対象私アンプリコン シーケンス (図 2)。ほとんどのターゲット狙撃 Cas9 は対象の活動の同じレベルを重量省略された sgRNAs と比較してより高い特異性比率はさらに特異性 (図 3) を改善するためにも使用できます。しかし、その使用は、彼らはフルレングスの sgRNAs、ほとんどの場合と比較して低対象の活動になるのでのみいくつかのターゲットに制限されます。したがって、さまざまな長さ (から 17 に 20-mers) と sgRNAs をテストする必要があり、特異性を最適化するためにターゲットにターゲットを離れて活動を測定しなければなりません。

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図 1: 代表狙撃画面ランダム Cas9 亜種の異なるライブラリを使用して実行します。ミューテーター図書館、EP ・ EP ライブラリ II 別商業キットを使用して作られたライブラリを示します。最初、2 番目、および最終濃縮スクリーンされた回数実行7を示します。この図は、李ら7から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2: [ターゲットとターゲットをプラスミッドまたは RNP を介して配信 20 mer ガイド シーケンスと対になって活動 WT Cas9 や狙撃 Cas9 。オフのターゲット アクティビティが対象のアクティビティを分割により特異性比を求めた。誤差範囲を示す SEM (n = 3)7。この図は、李ら7から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: ターゲットとターゲットを狙撃 Cas9 WT Cas9 FANCF01 と通気のサイトをターゲット変数長の sgRNAs を使用して得られたと比較しての活動。それぞれのオフのターゲット サイトにそれらのターゲット ・ サイトで塩基周波数で割って特異性比を求めた。sgRNAs (GX18 または GX19) 5' 末端に一致するグアニンと不一致グアニン (gX17、gX18、gX19、または gX20) が示されます。正規化の対象の活動の頃特異性比が計算されない < 707。この図は、李ら7から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

スナイパー Cas9 面倒な審査手続きを避けたい人は、狙撃 Cas9 タンパク質とエンコードのプラスミドがあります。これらの材料の最高の特異性比を提供する決定する必要があります sgRNA の最適な長さを使用してください。さらに、狙撃兵 Cas9 と RNP 形式で sgRNA の配信を通常プラスミド形式での配信よりも高い特異性比を得られるのでお勧め。狙撃兵-Cas9 とは異なり他の設計された Cas9 の亜種は切り捨てられた sgRNAs6,7 RNP フォーム8 (ハイファイ-Cas9) を除いて配信への互換性ではありません。

狙撃画面が一致しないシーケンスの選択は最も重要なステップです。五井シーケンスに対する低胸の谷間アクティビティに関連付けられている不一致 sgRNA の選択は避けるべきであります。されていない場合は、WT レベルの特異性を持つ Cas9 亜種なる不一致ターゲット サイトにエシェリヒア属大腸菌のゲノム DNA を切断していません。この効果は、大規模なスクリーニング プロシージャ全体を危険にさらす背景コロニー数になります。

大腸菌がある速いので倍加時間と酵母、狙撃画面と比較して高い変換効率は有利な方法と比較して酵母ベースのスクリーニング。狙撃画面がより他の大腸菌よりも敏感でなければなりませんまた、-プラスミドに基づいて一致しないサイトが運ばれるシステム: ゲノム DNA のコピー 1 つとこの 1 つだけがある私たちのシステムが多数の不一致のサイトのコピー単一の内のプラスミド大腸菌細胞。

狙撃画面を使用して、SaCas9 または Cpf1s などの偏向を引き起こす他の DNA 酵素の特異性も改善できるでしょう。残念ながら、基本エディターはエシェリヒア属大腸菌のゲノム DNA を誘発しないために、直接、基本編集者の特異性を高めるため狙撃画面が使用できません。Nickase または、システムのコアで死んでいるバージョン Cas9 のベースのエディターを使用して、基本エディターの特異性は狙撃画面から得られたヒットを使用して高めることが。

開示事項

ToolGen は特許を出願 (PCT/KR2017/006212) 狙撃画面をカバー (状態: 保留中、発明者: Jungjoon イ ・ ヨンギ)。Jungjoon イ ・ ヨンギ、Joonsun 李、Minhee チョン Euihwan チョン ToolGen、株式会社の従業員であります。

謝辞

この研究は科学省と韓国の ICT (2017M3A9B4061406) 国立研究財団の韓国 (NRF) Jungjoon K に韓国政府 (MSIT) (許可番号 2017M3A9B4061404 および 2018M3A9H3020844) によって資金を供給からの補助金によって支えられました。李。PGRG36 をエンコード プラスミド ナンシー クレイグ (Addgene プラスミド #16666) からの贈り物、p11 レーシー wtx1 はホイミン趙からの贈り物。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)NEBM0290L
Ampicillin Sodium SaltFisher ChemicalBP1760-25
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma Aldrich37919 or 94664
Antibiotic Antimycotic solutionWelgeneLS203-01Media component
BamHIEnzynomicsR003L
ChloramphenicolSigma AldrichR4408
Diversify PCR Random MutagenesisClontech630703Error-prone PCR kit
DNA-Shuffling KitJena BiosciencePP-103
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM001-17Culture media
Endura Electrocompetent Cells (DUO)Lucigen60242-2E. coli electrocompetent cells for library preparation
Fetal Bovine Serum (FBS)WelgeneS101-01Media component
Gene Pulser IIBio-RadE. coli electroporation equipment
GeneMorph II Random Mutagenesis KitAgilent200550Error-prone PCR kit
genomic DNA prep kitGenAll106-152gDNA-prep kit
GlycerolBioShopGLY001.1
GP/MP Cuvette, 0.1cmBio-RadBR165-2089E. coli electroporation equipment
HEK293T cellATCCCRL-11268Human cell line
Kanamycin sulfateAcros Organics450810500
L-(+)-ArabinoseSigma AldrichA3256-25G
LaboPass PCR Purification KitCosmogenetechCMR0112
LaboPass Plasmid MiniCosmogenetechCMP0112Mini-prep kit
LB Agar MillerFormediumLMM0202
LB Broth MillerFormediumLMM0102
LipofectamineInvitrogen11668019Transfection reagent
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LGibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture
Neon Transfection SystemThermoMPK5000RNP Electroporation equipment
Neon Transfection System 10 µL KitThermoMPK1096RNP Electroporation equipment
NucleoBond Xtra Midi EFMacherey-Nagel740420.50Midi-prep kit
Oligo Clean & ConcentratorZymo ResearchD4061DNA purification kit that enables low-volume elution
Opti-MEMGibcoLS31985070Transfection media
p11-lacY-wtx1Addgene#123945
pgrg36Addgene#16666E. coli mutator strain
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530L
PyrophophataseNEBM2403L
Ribonucleotide Solution SetNEBN0450L
RNase inhibitorNEBM0314L
T7 RNA polymeraseNEBM0251L
Turbo DnaseAmbionAM2238
XbaIEnzynomicsR013L
XL1-Red Competent CellsAgilent200129

参考文献

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