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摘要

我们提供以乙基或甲基硫磷酸为生物标志物的圈养驼鹿安慰剂口服狂犬病疫苗诱饵,并使用新型液相色谱法与串联质谱法(LC-MS/MS)方法验证诱饵的捕杀。

摘要

小型印度驼鹿(赫皮斯特龙),是波多黎各狂犬病病毒(RABV)的宿主,每年报告的动物狂犬病病例占70%以上。控制野生生物水库的RABV循环通常是通过口服狂犬病疫苗接种(ORV)策略实现的。目前波多黎各不存在野生动物ORV项目。对口服狂犬病疫苗和各种诱饵类型的研究已经展开,取得了可喜的成果。监测ORV的成功依赖于估计目标物种的诱饵吸收,这通常涉及评估接种后RABV中和抗体(RVNA)的变化。在有活跃的野生动物或病毒计划的地区,或在RABV是动物的和在水库物种中存在RVNA背景水平的地区,这种策略可能难以解释。在这种情况下,与疫苗或诱饵基质结合的生物标志物可能很有用。我们提供16个圈养的驼鹿安慰剂ORV诱饵含有乙基-硫磷酸(et-IPA)的浓度在诱饵内和0.14%在诱饵内和0.14%的诱饵内。我们还提供了12个含有甲基-硫磷酸(me-IPA)的圈养驼鹿ORV诱饵,其浓度为0.035%、0.07%和0.14%。我们在提供诱饵之前收集了血清样本,然后每周在提供后八周内收集。我们从血清中提取硫磷酸到醋酸,并使用液相色谱/质谱法进行定量。我们通过液相色谱-质谱法分析了血清的et-IPA或me-IPA。我们发现,对于et和me-IPA,分别至少8周和4周的标记能力。两种IPA衍生物都适用于对驼鹿的ORV诱饵摄入量进行实地评估。由于在蒙古塞的标记的寿命,必须小心,不要混淆结果,使用相同的IPA衍生物在连续评估。

引言

狂犬病病毒(RABV)是一种负感单搁浅赖萨病毒,在食肉动物和奇罗普特拉的指令内的各种野生植物群中传播。多种驼鹿是RABV的储藏库,而小印度驼鹿是波多黎各和西半球其他加勒比岛屿中唯一的水库。1、2、3.控制野生生物水库的RABV循环通常是通过口服狂犬病疫苗接种(ORV)策略实现的。在美国(美国),这一管理活动由美国农业部/APHIS/野生动物服务局国家狂犬病管理计划(NRMP)4协调。目前波多黎各不存在野生动物ORV项目。对狂犬病疫苗和各种诱饵类型的研究已经进行,有希望的结果表明,一个ORV计划为驼鹿是可能的5,6,7,8。

监测ORV的影响依赖于估计目标物种的诱饵吸收,这通常涉及评估RV抗体血清患病率的变化。然而,在野生动物或病毒项目活跃的地区,或者在RV是动物的、RABV中和抗体(RVNA)的背景水平存在于储层物种的地区,这一策略可能具有挑战性。在这种情况下,诱饵或外部诱饵基质中包含的生物标志物可能很有用。

各种生物标记已经被用来监测诱饵的摄入在众多物种,包括熊(普罗西翁乐透)9,10, stoats(Mustela ermine)11,12,欧洲 (梅莱斯·梅莱斯)13、野猪(苏斯·斯克鲁瓦)14只,印度小猩猩15只,草原犬(西诺米卢斯多维丘斯)16只,17只,等等。在美国,操作的ORV诱饵通常包括1%四环素生物标志物在诱饵基质监测诱饵的捕杀18,19。然而,使用四环素的缺点包括越来越担心抗生素在环境中的分布,四环素的检测通常是侵入性的,需要拔牙或破坏动物才能获得骨骼样本20.罗丹胺B已被评估为各种组织中的标记物,可以用紫外线(UV)光和荧光在头发和胡须10、21中检测出来。

硫磷酸 (IPA) 是一种白色,结晶粉末,已用于评估在土狼(Canis latrans)22的诱饵消费, 北极狐 (Vulpes lagopus)23,红狐 (Vulpes vulpes)24,熊9,25、野猪14只、红鹿(塞弗乌斯·拉普胡斯)26只、欧洲12只野猪和雪铁龙(M.furo)27只,以及其他几种哺乳动物。 IPA的保留时间因物种而异,从一些动物不到两周28,29,到至少26周,在未顾胶26和超过52周的家庭狗(卡尼斯狼疮熟悉)30。保留时间也可能与剂量相关31。硫磷酸与血清白蛋白强结合,历史上通过测量血碘水平32来检测。这种间接方法被高性能液相色谱 (HPLC) 方法所取代,用 UV 检测33直接测量硫磷酸浓度,并最终使用液相色谱和质谱法 (LCMS)34,35.在这项研究中,开发了一种高度敏感和选择性的液相色谱与串联质谱法(LC-MS/MS)方法,利用多反应监测(MRM)来量化两种类似物的硫磷酸。我们的目标是使用此 LC-MS/MS 方法评估 2-(3-羟基-2,4,6-三硫多苯基)丙酸(甲基-IPA 或 me-IPA)和 2-(3-羟基-2、4、6-三硫多苯基)丁酸(乙基-IPA 或 et-IPA)的标记能力,并在 ORV 中交付诱饵圈养的蒙古人。

蒙古人被关在网箱陷阱中,诱饵上装有商业上可用的熏香肠和鱼油。蒙古被安置在单独的60厘米x60厘米x40厘米不锈钢笼子,并喂养每天口粮约50克商业干猫食品,每周两次补充与商业可用的鸡大腿。水是可用的。 我们向安慰剂或V诱饵中的圈养的驼鹿交付了IPA的两种衍生物,乙基IPA和甲基IPA。所有诱饵均由28毫米x20毫米x9毫米箔泡包组成,带有外部涂层(下同"诱饵基质"),含有粉状鸡蛋和明胶(材料表)。诱饵含有0.7 mL的水或IPA衍生物,重约3克,其中±2克为外部诱饵基质。

我们提供16个圈养的蒙古和IPA在三种浓度: 0.14% (2.8毫克和IPA在+2 g诱饵基质; 3男性[m],3雌性[f]),0.4%(0.7 mL水泡组体积为2.8毫克和IPA;3m,3f),和1.0%(0.7 mL起泡包体积为7.0毫克乙酰IPA;2m,2f)。总剂量为2.8毫克,相当于5毫克/千克27,36的剂量率,以波多黎各560克的平均驼鹿体重为基础。我们选择1%作为最高浓度,因为研究表明,某些生物标志物的味觉厌恶在某些物种37中可能发生浓度>1%。我们只提供水泡包中的1%剂量,因为絮凝剂防止溶质溶解在溶剂中充分,以均匀地融入诱饵基质。一个对照组(2米,1f)收到装满无菌水的诱饵,没有IPA。在喂食其日常维持配给期间或之前,我们于上午(上午 8 点)向驼鹿提供诱饵。大约24小时后,诱饵遗骸被移走。我们在治疗前采集血液样本,治疗后一天,治疗后每周8周。我们通过吸入亚福兰毒气来麻醉驼鹿,并通过颅面静脉穿刺收集高达1.0 mL的全血,如雪铁龙38所述。我们离心全血样本,将血清转移到冷冻液中,并将其储存在-80°C,直到分析。并非所有动物都对所有时间段进行取样,以尽量减少重复采血对动物健康的影响。对照动物在治疗后第0天进行采样,然后每周进行8周。

我们在三种浓度中交付了 me-IPA:0.035%(0.7 毫克)、0.07%(1.4 毫克)和 0.14% (2.8 毫克),全部纳入诱饵基质,每个治疗组有 2 名男性和 2 名女性。两名男性和两名女性接受充满无菌水的诱饵,没有IPA。提供时间和蒙古麻醉的诱饵如上所述。我们在治疗前第1天采集血液样本,然后在治疗后每周4周。

我们测试了血清浓度数据的正常性,并估计了不同治疗组血清IPA浓度的方法。我们使用线性混合模型来比较平均血清和IPA浓度汇集在个人之间。诱饵类型(矩阵/水泡包)是一个固定的效果,除了实验日,而动物ID是一个随机效应。所有程序均使用通用统计软件(材料表)运行,显著性在 ±0.05 处进行评估。

研究方案

所有程序都通过美国农业部国家野生动物研究中心的机构动物护理和使用委员会根据批准的研究协议QA-2597批准。

注:以下协议描述了检测蒙古血清中甲基-硫磷酸的分析过程。该方法是迭代过程的最终版本,从分析蒙古血清中的乙酰-硫磷酸开始。在初步评估乙基-硫磷酸时,对方法进行了细微的修改,最终形成了如下协议。代表性的结果包括两次迭代期间获得的结果。

1. 制定解决方案和标准

  1. 购买我-IPA和及IPA。
  2. 对于移动阶段 A,通过将 1 mL 的甲酸与 1 L 的超纯水 (± 18 MΩ)结合,制备水中 1 L 0.1% (v/v) 的甲酸。对于移动阶段 B,通过将 1 mL 的甲酸与 1 L 的 ACN 结合,在醋酸 (ACN) 中制备 1 L 0.1% (v/v) 的甲酸。
  3. 对于稀释剂,通过将 1 mL 的 TFA 与 200 mL 的 ACN 结合,在 ACN 中制备 200 mL 的 0.5% (v/v) 三氟乙酸 (TFA)。
  4. 在ACN中制备浓缩的i-IPA和和IA的浓缩投资度/技术,浓度约为1,000微克/升。
    1. 在微平衡上称重约10毫克的me-IPA,并将质量记录为±0.0001毫克。声波1分钟溶解所有固体,然后用ACN体积。
    2. 将每只库存的 ±8 mL 转移到琥珀色 8 mL 玻璃瓶中,带聚四氟乙烯 (PTFE) 内衬盖。在室温 (RT) 下储存。将剩余库存转移到危险废物中。
  5. 对于 25x-7 me-IPA 库存(表1),在 ACN 中准备约 200 μg/mL 的 me-IPA 库存。示例:使用 1,000 μL 玻璃注射器将 1 mL 的 me-IPA 浓缩库存从步骤 1.4.2 转移到 5 mL A 类体积烧瓶。使用 ACN 稀释至容量。将库存转移到带 PTFE 内衬盖的琥珀色 8 mL 玻璃瓶中。在 RT 存储。
  6. 准备表 1中描述的另外 6 个 25 倍 me-IPA 股票。对于每种库存,将使用重复移液器指示的体积与带 PTFE 衬里盖的琥珀色 8 mL 琥珀色玻璃瓶中结合。将每种库存存储在 RT 上。
  7. 对于 25 倍代理库存,从步骤 1.4.2 中准备的浓缩库存中,以大约 10 μg/mL 的 ACN 中 m-IPA 代理库存。使用 100 μL 玻璃注射器将 0.100 mL 的浓缩 me-IPA 库存转移到 10 mL A 类体积烧瓶中,然后用 ACN 稀释至体积。
    1. 将 ±8 mL 转移到带 PTFE 内衬盖的琥珀色 8 mL 玻璃瓶中。存放在 RT. 将剩余库存转移到危险废物中。
  8. 如表2所述,准备4x库存,其中含有2 mL螺旋顶玻璃自动进样小瓶中的两种分析物。
    1. 例如,要准备库存 4x-7,到 2 mL 小瓶中,请使用具有 0.5 mL 容量尖端的重复移液器,从步骤 1.5 中添加步骤 1.5 中的 25x-7 me-IPA 库存的 0.20 mL。使用具有 0.5 mL 容量尖端的重复移液器,从步骤 1.7 中添加步骤 1.7 中的 25 倍代理和 IPA 库存的 0.20 mL。
    2. 使用具有 1 mL 容量尖端的重复移液器添加 0.85 mL 的 ACN。将小瓶牢固地盖住,并反转 5 倍以混合。
  9. 如表 3所述,在 2 mL 螺杆顶自动进样小瓶中准备标准曲线。
    1. 例如,要准备标准 7 (Std 7), 到 2 mL 小瓶中,请使用具有 0.5 mL 容量尖端的重复移液器从步骤 1.8.2 添加步骤 1.8.2 的 4x-7 库存的 0.20 mL。使用具有 1 mL 容量尖端的重复移液器添加 0.60 mL 的超纯 DI 水。将小瓶牢固地盖住,并反转 5 倍以混合。

2. 样品制备

注意:执行此程序的人员必须接受完整的狂犬病暴露前预防,并且有来自联邦职业健康指定医疗机构的记录狂犬病抗体定度超过 0.5 IU。在进行提取时,人员必须始终穿着实验室外套和眼睛防护服。注意:在 II 类生物安全机柜中执行步骤 2.3_2.6。

  1. 对于每个样品,准备一个含有200~300毫克NaCl的1.5 mL微离心管。在步骤 2.6 中预留以使用。
    注:对于大量样品,建议使用微勺(或其他小型测量设备)。
  2. 对于每个样品,将两个 1.5 mL 微离心管标记为"A",另一个标记为"B"。将管放在 80 位置的塑料机架中。
  3. 将血清提取所需的以下材料和设备放入 II 类生物安全柜中:步骤 2.1 和 2.2 中制备的微型离心管(机架中),涡旋混合器,具有 0.5 mL 和 5 mL 容量的重复移液器,100~1,000 μL 空气位移位带有 1,000 μL 吸头的移液器、每个稀释剂和超纯 DI 水的容器,以及一个生物危害废物容器。
  4. 从冷冻储存中取出血清样本,并在生物安全柜中加热至 RT。涡流在取样前混合每个血清样本。
  5. 使用具有 0.5 mL 容量尖端的重复移液器,将 0.050 mL 的驼鹿血清放入管"A"中,并添加 0.050 mL 的 25 倍代理库存。然后,使用具有 5 mL 容量尖端的重复移液器向管"A"添加 0.950 mL 稀释剂。盖牢固,涡旋混合10~15s。
  6. 将步骤2.1的预先称重NaCl放入管"A"和涡旋混合3x8⁄12s。使用70%(v/v)异丙醇擦拭装有管"A"的瓶架的外表面。
    注:样品架现在可以从 II 类生物安全机柜中取出。
  7. 离心管"A"在12,000 x g1分钟,以分离水相和ACN相。移液器 0.80 mL 的上 ACN 相位管"B"使用 100×1,000 μL 空气位移移移液器。将管"A"中的剩余溶液转移到危险废物中,并将空管丢弃在生物危险废物容器中。
  8. 在 45°C 水浴中用轻柔的 N2气体从管"B"中取出 ACN 和 TFA。
  9. 使用重复移液器将 0.250 mL 的 ACN 添加到管"B"中,涡旋混合 4⁄5 s,然后在 12,000 x g处短暂离心(2⁄4 s),以收集管底部的液体。
  10. 使用具有 5 mL 容量尖端的重复移液器向管"B"中加入 0.750 mL 的超纯 DI 水,涡旋混合 4⁄5 s,然后在 12,000 x g下离心 1 分钟,以澄清样品。
  11. 使用 1,000 μL 空气位移移移液器将 0.75 mL 的上清液转移到自动进样小瓶。丢弃生物危害废物容器中的移液器吸头。
  12. 盖自动进样小瓶牢固,由LC-MS/MS分析(第4节)。将管"B"中的剩余溶液转移到危险废物中,并将空管丢弃到生物危险废物容器中。通过高压灭菌或焚烧处理所有生物危险废物。

3. 质量控制样品

注意:遵循第 2 节中所述的警告性声明。

注:以下过程描述了分析所需的最低质量控制 (QC) 样本数量。如果有足够的控制蒙古斯血清可用,建议在每个级别进行复制。

  1. 准备四个含有200~300毫克NaCl的1.5 mL微离心管。将管放在 80 位置的塑料机架中。
  2. 对于每个QC样品,将两个1.5 mL微离心管贴上标签:一个为"A",另一个标记为"B"。将管放在 80 位置的塑料机架中。
  3. 重复步骤 2.3。
  4. 从冷冻储存中取出控制蒙鹅血清,在生物安全柜中加热到RT。涡流在取样前混合控制血清。
  5. 使用具有 0.5 mL 容量尖端的重复移液器,将 0.050 mL 的控制驼鹿血清放入四个 1.5 mL"A"管中。
  6. 使用具有 0.5 mL 容量尖端的重复移液器,强化表 4中指定的四个 QC 样品中的每个样本。牢固地盖住每个 QC 样品,涡旋混合 10-15 s。
  7. 执行步骤 2.6_2.12 中所述的提取过程。

4. LC-MS/MS 分析

  1. 使用表 5中描述的所有参数配置 LC-MS/MS。打开 LC-MS/MS 电源,使电列在将流速设置为 0.800 mL/min 之前达到 70°C。
  2. 在数据采集软件(材料表)中设置一个序列,在每批质量控制样品和未知样品的前后注入标准曲线。
  3. 注入所有标准和样品,并使用表5中列出的参数获取MRM组子色谱图。
  4. 序列完成后,关闭 LC-MS/MS 并将所有自动进样小瓶作为危险废物处理。

5. 量化

  1. 使用数据分析软件生成相对响应与相对浓度的校准曲线,使用 et-IPA 作为内部标准。计算来自 me-IPA 的量化器 MRM 转换的相对响应 (556.6 = 428.7) 除以 et-IPA 的 MRM 转换 (570.7 = 442.7)。使用加权 1/x 并忽略原点的二阶二次函数构造 7 级校准曲线。
  2. 使用以下等式计算me-IPA 的血清浓度 (C 血清):
    figure-protocol-4432
    其中c仪器是仪器从校准曲线以μg/mL单位为单位确定的浓度,1.25为稀释因子,Vfigure-protocol-4575最终为最终样本体积(1.0 mL),V血清为血清体积(以mL为单位)0.050 mL 标称)。

结果

图1中给出了来自me-IPA分析的代表性的环位图。对照蒙古斯血清(图1A)说明了et-IPA(代理Anlya)的保留时间和在指定保留时间没有me-IPA。质量控制样本(图1B)说明了me-IPA与et-IPA的基线分离,以及me-IPA的量化和限定符转换。图1C显示了该研究的代表性样本,观察到血清浓度为33.5微克/mL me-IPA。

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讨论

为研究开发的LC-MS/MS方法利用多反应监测的选择性,准确量化了ms-IPA和et-IPA中的驼鹿血清。MS/MS 检测的选择性还允许一个简单的清理方案,仅依靠醋酸酯在分析前从血清中沉淀蛋白质。

硫磷酸可溶于ACN,但几乎不溶于水。为了排除ACN萃取中的水,添加了氯化钠以迫使清水:ACN相分离,通过增加水(血清)相的离子强度。还添加了挥发性酸三氟化酸(TFA),以确保在提取过程中将硫磷酸进行质?...

披露声明

作者AV和SO是口腔狂犬病疫苗诱饵制造商的全职员工。

致谢

这项研究部分得到了美国农业部、动植物卫生检验局、野生动物服务局、国家狂犬病管理项目和IDT Biologika(德国德绍-罗斯劳)的校内研究计划的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile, Optima gradeFisherA996
Analytical balanceMettler ToledoXS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle sizeWaters Corp.186003085
ESI SourceAgilent G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 %Sigma AldrichN/ALot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS gradeFisherA117
LCMS softwareAgilentMassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w)PR EuroChem Ltd.N/ALot PR0709514717
Microanalytical balanceMettler ToledoXP6U
MicrocentrifugeEppendorf5415C
MS/MSAgilentG6470A
N-EvapOrganomation115
Oral Rabies Vaccine BaitsIDT Biologika, Dessau Rossleau, GermanyN/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w)PR EuroChem Ltd.N/ALot PR100612108RR
Repeat pipettorEppendorfM4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-linedAgilent5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS gradeFisherS271
Statistical Software PackageSAS Institute, Cary, North Carolina, USAN/A
Trifluoroacetic acid, 99 %Alfa AesarL06374
UPLCAgilent1290 Series
Vortex MixerGlas-Col099A PV6
0.2-mL pipettor tipsEppendorf30089.413
0.5-mL pipettor tipsEppendorf30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubesFisher14-666-325
1250-µL capacity pipette tipsGeneMateP-1233-1250
1-mL pipettor tipsEppendorf30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vialsAgilent5182-0716
5-mL pipettor tipsEppendorf30089.456
80-position microcentrifuge tube rackFisher05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined capsWheaton224754
70 % (v/v) isopropanolFisherA459
100-1000 µL air displacement pipetteEppendorfES-100

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