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摘要

我们提出了一种研究 mrna 翻译调节的方案, 在天花病毒感染细胞使用体外转录 Rna 基荧光素酶报告法。该方法可用于研究 mRNA 的cis元素的翻译调控, 包括 5 '-未翻译区域 (utr) 和 3 '-utr。使用此方法还可以检查不同的翻译启动模式。

摘要

病毒 DNA 复制后转录的每一个痘病毒 mRNA 都有一个进化保守的、非模板化的 5 '-聚 (A) 引线在 5 '-utr 中。为了剖析 5 '-聚 (A) 引线在天花病毒感染过程中 mRNA 翻译中的作用, 我们开发了一种体外转录 rna 基荧光素酶报告法。本报告分析包括四个核心步骤: (1) PCR 扩增 DNA 模板进行体外转录;(2) 利用 T7 RNA 聚合酶进行体外转录生成 mRNA;(3) 转染, 将体外转录的 mRNA 引入细胞;(4) 检测荧光素酶活性作为翻译指标。本文介绍的基于 rna 的荧光素酶报告法规避了弓形虫感染细胞中质粒复制和质粒中的神秘转录问题。该协议可用于确定 mRNA 中的 cis元素在 poxvirus-infected 感染细胞以外的系统中的翻译调控, 包括 5 '-utr 和 3 '-utr。此外, 还可以利用这种方法研究不同的翻译启动模式, 如与上限相关、与上限无关、重新启动和内部启动。

引言

根据中心教条, 遗传信息从 dna 流向 rna, 然后最后流向蛋白质1,2。遗传信息的这种流动在许多层面上受到高度调控, 包括 mrna 翻译3,4。研究用记者检测来衡量基因表达的调控, 将有助于了解这一过程中涉及的调控机制。在这里, 我们描述了一种研究 mrna 翻译的方案, 使用体外转录 rna 为基础的荧光素酶报告法在 pxvirs 感染细胞。

痘病毒包括许多高度危险的人类和动物病原体5。与所有其他病毒一样, 弓形病毒完全依靠宿主细胞机制进行蛋白质合成6,7,8。为了有效地合成病毒蛋白, 病毒进化出许多策略来劫持细胞翻译机制, 将其重定向, 用于病毒 rna 7,8的翻译。病毒常用的一种机制是在其转录中使用cis作用元素。值得注意的例子包括内部核糖体进入网站 (ires) 和与上限无关的翻译增强剂 (cite)9、10、11。这些cis元素通过通过不同的机制吸引翻译机械 12,13, 14,使病毒转录具有平移优势。超过 100个 poxvirus mrna 在 5 '-未翻译区域 (5 '-utr) 中具有进化保守的cis作用元素: 在这些 mrna15,16的 5 '-端的 5 '-多边形 (a) 引线。这些 5 ' poly (a) 引线的长度是异质性的, 是由 poxvirus-c金编码 rna 聚合酶在转录17,18 期间的滑移产生的。我们和其他人最近发现, 5 ' poly (a) 领导者赋予 mrna 在感染疫苗病毒 (vacv) 的细胞的翻译优势, 该病毒是天花病毒 19,20的典型成员。

体外转录 rna 基荧光素酶报告法初步开发, 以了解 5 '-聚 (a) 引线在猪病毒感染19,21期间 mrna 翻译中的作用。尽管基于粒细胞 dna 的荧光素酶记者检测已被广泛使用, 但有几个缺点会使感染 poxvirus-infected 细胞的结果解释复杂化。首先, 质粒能够在受 vac 感染的22细胞中复制。其次, 神秘转录往往发生在质粒dna 18,23,24。第三, VAC 启动子驱动转录产生聚 (A)-异质长度的引线, 因此在一些实验18中难以控制聚 (A) 引线长度。体外转录 rna 酶报告法规避这些问题, 数据解释很简单。

该方法有四个关键步骤: (1) 聚合酶链反应 (PCR) 生成体外转录的 DNA 模板;(2) 体外转录生成 mRNA;(3) 转染, 将 mRNA 输送到细胞中;(4) 检测荧光素酶活性作为翻译指标 (图 1)。生成的 PCR 放大器包含 5 ' 到 3 ' 方向中的以下元素: T7-tokor、poly (A) 引线或所需的 5 '-utr 序列、萤火虫荧光酶开放阅读框架 (ORF), 然后是聚 (A) 尾。以 PCR 放大器为模板, 利用 T7 聚合酶进行体外转录合成 mRNA。在体外转录过程中,mRNAg 帽或其他盖帽模拟被纳入新合成的 mrna 中。封顶的转录被转移到未经感染或没有感染的 vacv 细胞。细胞裂解液在转染后的所需时间被收集, 以测量表明转染 mRNA 产生蛋白质的荧光素酶活性。本报告法可用于研究 5 '-utr、3 '-utr 或其他区域 mRNA 中的cis元素的翻译调控。此外, 基于体外转录 rna 的检测方法可用于研究不同的翻译起始机制, 包括与上限相关的起始、与盖帽无关的起始、重新启动和像 RES 这样的内部起始。

研究方案

1. PCR 制备体外转录Dna 模板

  1. 要通过 PCR 制备 DNA 模板, 请设计引物。在设计引物时, 考虑引物长度、退火温度 (Tm)、gc 含量、3 ' 端 g 或 c 等关键特性。
    请注意:在这些文献25、26、27 中详细讨论了这些文献。
  2. 设计引物, 以生成 PCR 放大器包含以下元素在 5 ' 到 3 ' 的方向: T7-启动子, 聚 (A) 引线, 火红素酶 ORF 和聚 (A) 尾巴以下称为 T7_12A-fluc。设计引物 (正向和反向), 以涵盖模板 DNA 中不存在的所有其他元素 (图 2a)。
    请注意:所有元素的顺序都可以在表1中找到.
  3. 在正向引物 (5 '-3 ')28中包括几个额外的核苷酸, 然后是 t7 启动子、聚 (a) 引线或所需的 5 '-utr 序列和大约20个核苷酸, 根据 tm进行调整, 对应于报告基因的 5 ' 末端ORF。确保引物中的相应区域与基因的感觉链 (+ 链) 相同。
    请注意:对于长 5 '-utr, 合成两个 DNA 片段: 一个是 T7 启动子, 另一个是长 5 '-utr, 另一个是记者基因的 ORF。使用重叠扩展 PCR 29 连接这两个片段。
  4. 设计反向引物 (5 '-3 '), 包括聚 (A) 尾和大约20个核苷酸, 根据 Tm进行调整, 对应于报告基因的 ORF 的 3 ' 端。确保引物中的相应区域与基因的反义链 (-链) 相同, 在聚 (A) 尾之前存在一个框架内停止密码子。
    请注意:在聚 (A) 引线或聚 (A) 尾的 A 的所需长度可以在引物中定制。例如, 要在聚 (A) 尾添加 50 a, 反向引物应包含 50 T。同样, 在聚 (A) 引线中加上 2 0 a, 前引物应该需要 2 0个 A。
  5. 对于内部控制, 设计另一组引物, 其中包含 5 ' 至 3 ' 方向中的以下元素: T7 启动子, 包含 Kozak 序列的随机 5 '-utr 编码序列, Renilla luciferase orf 和 Poly (a) 尾以下称为 T7 _科扎克-吕克
  6. 在 PCR 管中, 按以下顺序添加试剂: DNase 无水、2倍高保真 DNA 聚合酶、引物和序列确认的荧光素酶模板 DNA (表 2)。
    请注意:混合物中的单个成分的数量应根据反应体积进行调整。
  7. 使用标准的3步 (变性、退火、扩展) PCR 周期生成 DNA 模板, 如表 3所示。
    请注意:退火温度 X°c 取决于所使用的引物集, 延长时间 T min 取决于所使用的 PCR 放大器大小和 DNA 聚合酶。
  8. 在1% 琼脂糖醋酸-edta (tae) 凝胶电泳 (含0.1μml 溴化乙酯) 中运行5-10 的 PCR 反应, 以及市售的分子量标准, 检测 PCR 产物。在紫外线照明器下可视化凝胶, 以确定 PCR 产品的大小。
  9. 在确定 PCR 产品的正确尺寸后, T7_12A-fluc ~ 1.7 kb, T7_Kozak-rluc ~ 1.0 kb, 使用市售 PCR 纯化试剂盒进行纯化。使用100μl 无核酸酶水 (图 2B) 来保护 dna。
  10. 纯化后, 使用分光光度计检查 DNA 浓度, 并确定 a260a280 比 (~ 1.8-2.0 是可以接受的)。
  11. 在-20°c 下储存纯化的 DNA 或立即用于体外转录。

2. 体外转录生成 mRNA

  1. 利用体外转录试剂盒 ( 图 3a), 在体外合成 PCR 产物中的 rna。
    注:     T7_12A-fluc 和 T7_Kozak rluc dna 模板分别用于合成12a-fluc 和 Kozak-Rluc Mrna。
    1. 为此, 取一个微离心管, 并按以下顺序添加试剂: DNase-RNase 无水、NTP 缓冲混合、CAP 模拟、模板 PCR 产品、T7-rna 聚合酶混合物 (表 4)。
      请注意:其他封盖系统也可用于按照制造商的指示进行体外转录后对 RNA 进行顺序封盖。
    2. 在37°c 下彻底混合并孵育2小时。
    3. 使用 RNA 纯化试剂盒继续纯化合成的 RNA。
  2. 在1.5% 琼脂糖-硼酸-edta (TBE) 凝胶 (含有0.5μgml 溴化物) 中运行纯化 rna 来检查 RNA。在紫外线照明器下显示凝胶 (图 3b)。
  3. 用分光光度计检查 RNA 的浓度, 并确定 a260a280 的比例 (~ 1.8-2.0 是可以接受的)。
  4. 将纯化后的 RNA 倾斜, 存放在-80°c。

3. 将 mRNA 转接到细胞

  1. 种子 HeLa 细胞在一个24孔板 (约约约约80-90% 融合第二天) 和孵育在37°c 的孵化器与 5% co 2 过夜.
  2. 在5的感染倍数 (MOI) 中感染维拉细胞, 以进行疫苗病毒 (VACV) 的治疗, 或保持未感染的平拉细胞进行比较。
    请注意:MOI 是每个细胞的传染性病毒颗粒的数量。
  3. X 的 MOI = {[(细胞数量 * X)/病毒标题] * 每个 1 mL 介质的病毒的1000μl。
  4. 在所需的 h 后感染 (hpi) (在这个实验在 10-12 hpi), 转染 mRNA (500 纳的总 mRNA 每井24孔板) 使用阳离子脂质转染试剂, 如图3C 所示。
    1. 对于24孔板的井, 将含有萤火虫荧光素酶 (12A-Fluc) 的12a 序列 mRNA 的 480 ng 和带有Renilla荧光素酶 (Kozak-Rluc) mrna 的20纳克混合在一个微离心管中。在另一个微离心管中加入1.1μl 的阳离子脂质转染试剂。
    2. 在两管中加入55μl 的减少血清培养基。在室温下混合孵育5分钟。
    3. 孵育5分钟后, 在含有 mRNA 的试管中加入含有降血血清的55μl 阳离子脂质转染试剂。
    4. 轻轻但彻底地混合, 在室温下孵育15分钟。
    5. 在培养过程中, 去除细胞培养基, 每道24孔板加入400Μl 的减少血清培养基。
    6. 孵育后, 将混合物的100Μl 滴下均匀地加入到24孔板的井中。

4. 测量荧光素酶活性

  1. 在12A-Fluc 和 Kozak-Rluc mRNA 的共同转染后五个小时, 使用能够进行两个报告检测的荧光素酶检测系统来测量荧光素酶活性 (例如, 双荧光素酶报告检测试剂盒)。
  2. 通过添加150μl1x 裂解缓冲液 (荧光素酶检测试剂盒的组成部分) 去除减少的血清培养基并裂解细胞。
  3. 在室温下孵育10分钟后, 通过清除细胞并转移到微离心管中收集裂解物。
  4. 在4°c 条件下, 以 12, 000 x 克离心裂解液 10分钟, 以颗粒细胞碎片。
  5. 在带固体底部的96孔白液测定板中加入30μl 上清液。
  6. 使用荧光素酶检测试剂盒和多模板式读取器流量计测量双发光。
  7. 使用动力学功能 (在每口井的基础上) 使用表5中描述的设置进行测量。
    请注意:读数也可以使用手动计时器进行。在杯中为 Fluc 添加等量的裂解液和基板。等待 2秒, 使用计量器测量10秒。在 Fluc 测量之后, 快速从计量仪中取出立方, 并手动添加相同体积的基板。再次, 等待 2秒, 并使用测光仪测量10秒。
  8. 将发光读数数据导出为理想的文件格式。
  9. 通过内部控制 Rluc 值划分 Fluc 值, 确定未感染和 VACV 感染的平拉细胞中 12A-Fluc mRNA 的相对转化率。
    请注意:补充图 1显示了对原始数据的分步分析, 以获得相对的 fluc 活动。

结果

体外转录 rna 基荧光素酶报告法的四个步骤: PCR 生成 DNA 模板体外转录, 体外转录生成 mRNA, mRNA 转染, 和荧光素酶测量, 可以在示意图中看到 (图 1)。图中说明了 DNA 模板 (Fluc 和 Rluc) 引物的设计和悬垂扩展 PCR 的一般方案 (图 2a)。PCR 后, TAE 琼脂糖凝胶电泳检测出正确大小的 PCR 产物 (图 2B)。随后, PCR 产物被用?...

讨论

所有四核步骤都是体外转录 rna 基荧光素酶报告法成功的关键。应特别注意引物设计, 特别是 T7 启动子序列。T7 RNA 聚合酶开始转录从在 5 '-utr 序列之前添加的 T7 启动子中的下划线第一 g (gGg-5 '-utr-aug-)。虽然转录起始位点 (TSS) 从 5 ' 端的第一个 G 开始, 但在 T7 启动子区域中, 减少 G 的小于3的数量会减少体外转录的 RNA 产量/输出。在实验中, 我们观察到凝胶纯化 DNA 产物不是最佳的体外转录, 因?...

披露声明

提交人希望声明没有相互竞争的经济利益。

致谢

该项目由国家卫生研究院 (AI128406 www.nih.gov) 资助至 ZY, 部分由约翰逊癌症研究中心 (http://cancer.k-state.edu) 资助, 形式是研究生暑期津贴至 PD。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master mixNew England BiolabsM0492High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabsS1411LAnti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplateCorning3693Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1960Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOMEGA BIO-TEKD6492PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate LuminometerPromegaGM2010Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis KitNew England BiolabsE2050SIn Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Reduced serum media
Purelink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific12183018ARNA purification kit
Vaccinia Capping SystemNew England BiolabsM2080Capping system

参考文献

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