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Resumen

Presentamos un protocolo para estudiar la regulación de la traducción de mRNA en células infectadas por poxvirus usando el ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN. El ensayo se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Elements de un mRNA, incluyendo 5 '-región no traducida (UTR) y 3 '-UTR. También se pueden examinar diferentes modos de iniciación de la traducción utilizando este método.

Resumen

Cada poxvirus mRNA transcrito después de la replicación del ADN viral tiene un líder de 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, no con plantilla en el 5 '-UTR. Para diseccionar el papel de 5 '-Poly (A) líder en la traducción de mRNA durante la infección por el poxvirus desarrollamos un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa. Este ensayo de reportero consta de cuatro pasos principales: (1) PCR para amplificar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar ARNm utilizando la polimerasa de T7 RNA; (3) transfección para introducir in vitro el mRNA transcrito en las células; (4) detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción. El ensayo de la reportera luciferasa basado en ARN descrito aquí elude los problemas de la replicación plásmia en las células infectadas por el poxvirus y la transcripción críptica del plásmido. Este protocolo se puede utilizar para determinar la regulación de la traducción por CIS-Elements en un mRNA que incluye 5 '-UTR y 3 '-UTR en sistemas que no sean células infectadas por el poxvirus. Por otra parte, diferentes modos de iniciación de la traducción como dependiente de la PAC, Cap-independiente, re-iniciación, y la iniciación interna se pueden investigar utilizando este método.

Introducción

Según el dogma central, la información genética fluye del ADN al ARN y finalmente a la proteína1,2. Este flujo de información genética está altamente regulado en muchos niveles, incluyendo la traducción de mRNA3,4. El desarrollo de ensayos de reportera para medir la regulación de la expresión génica facilitará la comprensión de los mecanismos regulatorios involucrados en este proceso. Aquí describimos un protocolo para estudiar la traducción de mRNA usando un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa en células infectadas con poxvirus.

Los poxvirus comprenden muchos patógenos humanos y animales altamente peligrosos5. Como todos los demás virus, los poxvirus dependen exclusivamente de la maquinaria de célula huésped para la síntesis de proteínas6,7,8. Para sintetizar eficientemente las proteínas virales, los virus desarrollaron muchas estrategias para secuestrar la maquinaria celular translacional para redirigirla para la traducción de mRNAs virales7,8. Un mecanismo comúnmente empleado por virus es utilizar elementos de acción CISen sus transcripciones. Algunos ejemplos notables son el sitio de entrada ribosome interno (IRES) y el potenciador de la traducción independiente de la PAC (CITE)9,10,11. Estos elementos CIShacen de las transcripciones virales una ventaja traslacional al atraer maquinaria traslacional a través de diversos mecanismos12,13,14. Más de 100 mRNAs de poxvirus tienen un elemento de acción CISevolutivamente conservado en la región 5 '-no traducida (5 '-UTR): un 5 '-poli (a) líder en los 5 ' extremos de estos mRNAs15,16. Las longitudes de estos 5 '-Poly (A) líderes son heterogéneos y se generan por el deslizamiento de la polimerasa del arn codificado con poxvirus durante la transcripción17,18. Nosotros, y otros, recientemente descubrimos que el 5 '-poli (A) líder confiere una ventaja de traducción a un mRNA en las células infectadas con el virus vaccinia (VACV), el miembro prototypic de poxvirus19,20.

El ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa se desarrolló inicialmente para entender el papel del líder 5 '-Poly (A) en la traducción de mRNA durante la infección por poxvirus19,21. Aunque los ensayos de reportero de luciferasa basados en ADN plásmido han sido ampliamente utilizados, hay varios inconvenientes que complicarán la interpretación de resultados en las células infectadas por el poxvirus. En primer lugar, los plásmidos son capaces de replicar en las células infectadas por VACV22. En segundo lugar, la transcripción críptica a menudo ocurre a partir del ADN plásmido18,23,24. En tercer lugar, la transcripción impulsada por el promotor de VACV genera Poly (A)-líder de longitudes heterogéneas por lo que dificulta el control de la longitud del líder Poly (a) en algunos experimentos18. Un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa que evita estos problemas y la interpretación de los datos es sencilla.

Hay cuatro pasos clave en este método: (1) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar mRNA; (3) transfección para entregar mRNA en las células; y (4) la detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción (figura 1). El amplificador de PCR resultante contiene los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7-Promoter, líder Poly (A) o la secuencia deseada de 5 '-UTR, luciferasa Firefly con marco de lectura abierta (ORF) seguida de una cola Poly (A). El amplicón de PCR se utiliza como la plantilla para sintetizar mRNA por transcripción in vitro usando la T7 polimerasa. Durante la transcripción in vitro, m7G Cap u otro análogo de la tapa se incorpora en el mRNA recién sintetizado. Las transcripciones coronadas se transfectadas en células no infectadas o infectadas por VACV. El lisado celular se recoge en el momento deseado después de la transfección para medir las actividades de luciferasa que indican la producción de proteínas del mRNA transfeccionado. Este ensayo reportero se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Element presente en 5 '-UTR, 3 '-UTR u otras regiones de un mRNA. Además, el ensayo in vitro transcrito basado en ARN puede utilizarse para estudiar diferentes mecanismos de iniciación de la traducción, incluyendo iniciación dependiente de la PAC, iniciación independiente de la tapa, reiniciación e iniciación interna como IRES.

Protocolo

1. preparación de la plantilla de ADN por PCR para la transcripción in vitro

  1. Para preparar la plantilla de ADN mediante PCR, diseñe imprimadores. Al diseñar imprimaciones considerar características cruciales como la longitud de imprimación, temperatura de recocido (Tm), contenido GC, 3 ' end con G o C, etc.
    Nota: Discutidos detalladamente en esta literatura25,26,27.
  2. Diseño de imprimadores para generar amplicón PCR que contiene los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7-Promoter, líder Poly (A), luciferasa Firefly ORF y una cola Poly (A) referida a continuación como T7_12A-FLUC. Diseño de imprimadores (avance y retroceso) para abarcar todos los elementos adicionales no presentes en el ADN de la plantilla (figura 2A).
    Nota: La secuencia de todos los elementos se puede encontrar en la tabla 1.
  3. Incluir varios nucleótidos adicionales en el primer avance (5 '-3 ')28, seguidos por el T7-promotor, el líder Poly (A) o la secuencia deseada 5 '-UTR y aproximadamente 20 nucleótidos, ajuste basado en Tm, correspondiente al extremo 5 ' del gen del reportero Orf. Asegúrese de que la región correspondiente en la imprimación sea idéntica a la hebra de sentido (+ hebra) del gen.
    Nota: Durante largos 5 '-UTR, sintetizar dos fragmentos de ADN: uno con T7 promotor seguido de largo 5 '-UTR y segundo con ORF del reportero gene. Unir estos dos fragmentos utilizando la extensión de superposición PCR29.
  4. Diseño de imprimación inversa (5 '-3 ') para incluir la cola Poly (a) y aproximadamente 20 nucleótidos, ajuste basado en Tm, correspondiente al extremo 3 ' del ORF del gen reportero. Asegúrese de que la región correspondiente en la imprimación es idéntica a la hebra antisentido (-Strand) del gen y un codón de parada en el bastidor está presente antes de la cola Poly (A).
    Nota: La longitud deseada de la A en un poly (A) líder o poli (A) cola se puede personalizar en los imprimadores. Por ejemplo, para agregar 50 a en la cola Poly (a), la imprimación inversa debe implicar 50 T. Del mismo modo, para agregar 20 a en el líder Poly (A), la imprimación delantera debe implicar 20 A.
  5. Para el control interno, diseñe otro conjunto de imprimadores que contengan los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7 Promoter, una secuencia de codificación aleatoria de 5 '-UTR que contiene la secuencia Kozak, Renilla luciferasa ORF y la cola Poly (a) referida a continuación como T7_ Kozak-Rluc.
  6. En un tubo de PCR, agregue los reactivos en el siguiente orden: agua libre de DNase, 2x polimerasa de ADN de alta fidelidad, imprimadores, y secuencia confirmada de ADN de la plantilla de luciferasa (tabla 2).
    Nota: Las cantidades de componentes individuales en la mezcla deben ajustarse de acuerdo con el volumen de reacción.
  7. Utilice un ciclo de PCR estándar de 3 pasos (desnaturalización, recocido, extensión) para generar una plantilla de ADN como se muestra en la tabla 3.
    Nota: La temperatura de recocido X ° c depende del conjunto de imprimación que se está utilizando y el tiempo de extensión T min depende del tamaño de amplicón PCR y de la polimerasa de ADN utilizada.
  8. Detecte el producto de PCR ejecutando el 5-10% de la reacción PCR en electroforesis de gel de tris-acetato-EDTA (TAE) al 1% (conteniendo 0,1 μg/ml de bromuro de etilo) junto con el estándar de peso molecular disponible comercialmente. Visualice el gel bajo un iluminador UV para determinar el tamaño del producto de PCR.
  9. Después de determinar el tamaño correcto del producto de PCR, ~ 1,7 KB para T7_12A-FLUC y ~ 1,0 KB para T7_Kozak-Rluc, purificarlo usando un kit de purificación de PCR disponible comercialmente. Elute el ADN utilizando 100 μL de agua libre de nucleasa (figura 2B).
  10. Una vez purificada, Compruebe la concentración del ADN utilizando un espectrofotómetro y determine la relación A260/A280 (~ 1.8-2.0 es aceptable).
  11. Almacene el ADN purificado a-20 ° c o utilice para la transcripción in vitro inmediatamente.

2. generar mRNA por transcripción in vitro

  1. Sintetizar ARN del producto PCR in vitro, utilizando un kit de transcripción in vitro (figura 3a).
    Nota:     las plantillas de ADN T7_12A-FLUC y T7_Kozak-Rluc se utilizan para sintetizar mRNAs 12A-FLUC y Kozak-rluc, respectivamente.
    1. Para ello, tome un tubo de microcentrífuga y agregue los reactivos en el siguiente orden: agua libre de DNase-RNase, mezcla de búfer NTP, análogo de Cap, producto de PCR de plantilla, mezcla de pomerasa T7-RNA (tabla 4).
      Nota: Otros sistemas de taponado también se pueden utilizar para tapar secuencialmente el ARN después de la transcripción in vitro siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Mezclar bien e incubar a 37 ° c durante 2 h.
    3. Proceda a la purificación del ARN sintetizado utilizando un kit de purificación de ARN.
  2. Ejecutar ARN purificado en 1,5% Tris-borato-EDTA (TBE) gel (conteniendo 0,5 μg/ml de bromuro de etidio) para comprobar el ARN. Visualice el gel bajo un iluminador UV (figura 3B).
  3. Compruebe la concentración del ARN utilizando un espectrofotómetro y determine la relación A260/A280 (~ 1.8-2.0 es aceptable).
  4. Aliquot el ARN purificado y almacenar a-80 ° c.

3. transfect mRNA a las células

  1. Semillas de células HeLa en una placa de 24-Well (para ser aprox. ~ 80-90% confluente al día siguiente) e incubar durante la noche en una incubadora a 37 ° c con 5% CO2.
  2. Infectar las células HeLa con el virus vaccinia (VACV) en una multiplicidad de infecciones (MOI) de 5 o mantener las células de HeLa no infectadas para la comparación.
    Nota: MOI es el número de partículas virales infecciosas por célula.
  3. MOI de X = {[(número de células * X)/virus titer] * 1000} μl de virus por 1 mL de medio.
  4. Después de la infección de h post deseada (HPI) (en este experimento a 10-12 HPI), transfectar mRNA (500 ng de ARNm total por pozo de placas de 24-Well) utilizando un reactivo de transexcreción lipídica catiónica como se muestra en la Figura 3C.
    1. Para un pozo de una placa de 24-Well, mezclar 480 ng de 12A de rodamiento de la secuencia luciferasa Firefly (12A-FLUC) mRNA y 20 ng de la secuencia Kozak que lleva Renilla luciferasa (Kozak-rluc) mRNA en un tubo de microcentrífuga. En otro tubo de microcentrífuga añadir 1,1 μL de reactivo de transfección de lípidos catiónicos.
    2. Añadir 55 μL de medio sérico reducido en ambos tubos. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Después de 5 min de incubación, añadir 55 μL de reactivo de transfección de lípidos catiónicos que contiene un medio sérico reducido en mRNA que contiene el tubo.
    4. Mezclar suavemente pero a fondo, e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Durante la incubación, retire el medio de cultivo celular y añada 400 μL de medio sérico reducido por pozo de placas de 24 pozo.
    6. Después de la incubación, añadir 100 μl de la mezcla gota a gota y uniformemente a un pozo de placas de 24-well.

4. Mida las actividades de luciferase

  1. Cinco horas después de la transfección de 12A-FLUC y Kozak-rluc mRNA, miden la actividad de luciferasa utilizando un sistema de ensayo luciferasa capaz de realizar dos ensayos de reportera (p. ej., dual luciferasa Reporter kit de ensayo).
  2. Quitar el medio sérico reducido y lisar las células añadiendo 150 μL de tampón de lisis 1x, un componente del kit de ensayo luciferasa.
  3. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, recoger el lisado por desguace las células y transferir a un tubo de microcentrífuga.
  4. Centrifugar el lisado a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c a desechos de células de pellet.
  5. Añadir 30 μL de sobrenadante en placa de ensayo de pared opaca 96 bien blanca con un fondo sólido.
  6. Mida la luminiscencia doble utilizando el kit de ensayo luciferasa y un luminómetro de lector de placas multimodo.
  7. Realice la medición utilizando la función cinética (sobre una base por pozo) utilizando los ajustes descritos en la tabla 5.
    Nota: La lectura también se puede tomar con Luminómetro manual. Añadir un volumen igual de lisado y sustrato para FLUC en una cubeta. Espere 2 s y mida durante 10 s con el luminómetro. Después de la medición de FLUC, sacar rápidamente la cubeta del luminómetro y añadir un volumen igual del sustrato para Rluc manualmente. Una vez más, espere 2 s y mida durante 10 s con el luminómetro.
  8. Exporte los datos de lectura de luminiscencia a un formato de archivo deseable.
  9. Determine la tasa de conversión relativa del mRNA 12A-FLUC en las células HeLa infectadas no infectadas y VACV, dividiendo el valor de FLUC por el valor de Rluc de control interno.
    Nota: La figura 1 complementaria muestra el análisis paso a paso de los datos sin procesar para obtener la actividad FLUC relativa.

Resultados

Los cuatro pasos del ensayo in vitro transcrito de la luciferasa basada en ARN: la PCR para generar una plantilla de ADN para la transcripción in vitro, la transcripción in vitro para generar ARNm, la transfección de mRNA y la medición de luciferasa, se pueden ver en el diagrama esquemático ( Figura 1). El diseño de imprimadores para ambas plantillas de ADN (FLUC y Rluc) y el esquema general de PCR de extensión de voladizo se ilustra en el esquema (

Discusión

Todos los pasos de cuatro núcleos son fundamentales para el éxito del ensayo de reportero de luciferasa, basado en ARN transcrito in vitro. Se debe prestar especial atención al diseño de imprimación, especialmente para la secuencia de promotor T7. La polimerasa de T7 RNA comienza la transcripción de la primera G (gGG-5'-UTR-Aug-) subrayada en T7 promotor añadida antes de la secuencia 5 '-UTR. Aunque el sitio de inicio de la transcripción (TSS) comienza a partir de la primera G en el extremo 5 ', la disminu...

Divulgaciones

A los autores no les gustaría declarar ningún interés financiero competidor.

Agradecimientos

El proyecto fue financiado por los institutos nacionales de la salud (AI128406 www.nih.gov) a la ZY y en parte por el centro de investigación del cáncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu) en forma de postgrado estudiante verano Stipend a PD.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master mixNew England BiolabsM0492High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabsS1411LAnti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplateCorning3693Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1960Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOMEGA BIO-TEKD6492PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate LuminometerPromegaGM2010Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis KitNew England BiolabsE2050SIn-Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Reduced serum media
Purelink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific12183018ARNA purification kit
Vaccinia Capping SystemNew England BiolabsM2080Capping system

Referencias

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