Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 '-região não traduzida (UTR) e 3 '-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.

Resumo

Cada mRNA do poxvirus transcrito após a replicação viral do ADN tem um 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, não-modelado do 5 '-UTR. Para dissecar o papel de 5 '-Poly (A) líder na tradução de mRNA durante a infecção do poxvirus nós desenvolvemos in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Este ensaio do repórter compreende de quatro etapas do núcleo: (1) PCR para amplificar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA usando T7 RNA polimerase; (3) transfecção para introduzir in vitro o mRNA transcrito nas pilhas; (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução. O ensaio do repórter do luciferase RNA-baseado descrito aqui contorna edições da replicação do plasmídeo em pilhas poxvirus-contaminadas e na transcrição enigmático do plasmídeo. Este protocolo pode ser usado para determinar o Regulamento da tradução por cis-elementos em um mRNA que inclui 5 '-UTR e 3 '-UTR nos sistemas diferentes das pilhas poxvirus-contaminadas. Além disso, diferentes modos de iniciação de tradução, como o tampão-dependente, Cap-Independent, re-iniciação, e iniciação interna podem ser investigados usando este método.

Introdução

De acordo com o dogma central, a informação genética flui do DNA para o RNA e, finalmente, para a proteína^1,2. Este fluxo de informação genética é altamente regulamentado em vários níveis^,incluindo a tradução mRNA^3,4. O desenvolvimento de ensaios de repórter para medir a regulação da expressão gênica facilitará a compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos nesse processo. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a tradução do mRNA usando um in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase em pilhas poxvirus-infected.

Os poxvirus compreendem muitos micróbios patogénicos humanos e animais altamente perigosos⁵. Como todos os outros vírus, os poxvirus dependem exclusivamente de máquinas de células hospedeiras para síntese protéica^6,7,8. Para sintetizar de forma eficiente as proteínas virais, os vírus evoluíram com muitas estratégias para a seqüestro da maquinaria translacional celular para redirecioná-la para a tradução de mRNAs virais^7,8. Um mecanismo comumente empregado por vírus é o uso de elementos de ação cisem suas transcrições. Exemplos notáveis incluem o local de entrada Ribossome interna (ires) e o potenciador de tradução independente de Cap (CITE)^9,10,11. Esses cis-elementos tornam as transcrições virais uma vantagem translacional atraindo máquinas translacionais através de diversos mecanismos^12,13,14. Mais de 100 mRNAs de Poxvirus têm um elemento cis-acting evolutivamente conservado na região 5 '-Untranslated (5 '-UTR): um 5 '-Poly (a) líder no muito 5 ' extremidades destes mRNAs^15,16. Os comprimentos destes 5 '-Poly (a) os líderes são heterogêneos e são gerados pelo derrapagem da polimerase poxvirus-codificada do RNA durante a transcrição^17,18. Nós, e outro, descobrimos recentemente que o 5 '-Poly (a) o líder confere uma vantagem da tradução a um mRNA nas pilhas contaminadas com o vírus de vaccinia (vacv), o membro prototípicas de Poxvirus^19,20.

O ensaio de repórter de luciferase baseado em RNA transcrito in vitro foi inicialmente desenvolvido para compreender o papel do líder 5 '-Poly (a) na tradução de mRNA durante a infecção pelo poxvirus^19,20. Embora os ensaios do repórter do luciferase DNA-baseado do plasmídeo sejam amplamente utilizados, há diversos inconvenientes que complicarão a interpretação do resultado em pilhas poxvirus-contaminadas. Em primeiro lugar, os plasmís são capazes de replicar em células infectadas VACV²². Em segundo lugar, a transcrição críptica geralmente ocorre a partir do plasmídeo DNA^18,23,24. Em terceiro lugar, a transcrição impulsionada pelo promotor VACV gera poli (A)-líder de comprimentos heterogêneos, consequentemente, dificultando o controle do comprimento do líder Poly (A) em alguns experimentos¹⁸. Um ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseado em RNA contorna estas edições e a interpretação dos dados é direta.

Há quatro etapas chaves neste método: (1) reacção em cadeia do polymerase (PCR) para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA; (3) transfection para entregar o mRNA nas pilhas; e (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução (Figura 1). O amplicon resultante do PCR contem os seguintes elementos no sentido 5 ' a 3 ': T7-promotor, líder poli (A) ou 5 '-seqüência desejada de UTR, frame de leitura aberto do luciferase do Firefly (ORF) seguido por uma cauda poli (A). O amplicon do PCR é usado como o molde para sintetizar mRNA pela transcrição in vitro usando o polymerase de T7. Durante a transcrição in vitro, o tampão de m⁷G ou o outro Analog do tampão são incorporados no mRNA recentemente sintetizado. As transcrições tampadas são transfected em células não infectadas ou VACV-infectadas. O lisado da pilha é coletado no tempo desejado após o transfection para medir atividades do luciferase que indicam a produção da proteína do mRNA transfected. Este ensaio do repórter pode ser usado para estudar a regulação da tradução pelo cis-elemento atual em 5 '-UTR, em 3 '-UTR ou em outras regiões de um mRNA. Além disso, o ensaio in vitro transcrito RNA-baseado pode ser usado para estudar os mecanismos diferentes da iniciação da tradução que incluem a iniciação tampão-dependente, a iniciação tampão-independente, a reiniciação e a iniciação interna como IRES.

Protocolo

1. preparação do modelo de DNA por PCR para transcrição in vitro

1. Para preparar o modelo de DNA por PCR, iniciadores de design. Ao projetar primers considerar características cruciais como primer comprimento, temperatura de recozimento (T_m), GC conteúdo, 3 ' final com G ou C etc.
   Nota: Discutido em detalhe nesta literatura^25,26,27.
2. Projete primeiras demão para gerar o amplicon do PCR que contem os seguintes elementos em 5 ' a 3 ' sentido: T7-promoter, líder poli (A), luciferase do Firefly ORF e uma cauda de Poly (A) consultá-se daqui para a T7_12A-Fluc. Iniciadores de design (Forward e Reverse) para abranger todos os elementos adicionais não presentes no modelo DNA (Figura 2a).
   Nota: A sequência de todos os elementos pode ser encontrada na tabela 1.
3. Inclua diversos nucleotídeos extra na primeira demão para diante (5 '-3 ')²⁸, seguido pelo T7-promotor, pelo líder poli (A) ou pela seqüência desejada de 5 '-UTR e por aproximadamente 20 nucleotídeos, ajuste baseado em T_m, correspondendo ao 5 ' extremidade do gene do repórter Orf. Assegure-se de que a região correspondente no primer seja idêntica à vertente do sentido (+ vertente) do gene.
   Nota: Para longo 5 '-UTR, sintetizar dois fragmentos de DNA: um com o promotor T7 seguido por Long 5 '-UTR e segundo com ORF do gene do repórter. Junte esses dois fragmentos usando a extensão de sobreposição PCR²⁹.
4. O primer reverso do projeto (5 '-3 ') para incluir a cauda poli (A) e aproximadamente 20 nucleotides, ajusta baseado em T_m, correspondendo ao 3 ' extremidade do ORF do gene do repórter. Assegure-se de que a região correspondente na primeira demão seja idêntica à vertente antisense (-vertente) do gene e um Codon do batente do em-frame esteja atual antes da cauda de Poly (A).
   Nota: O comprimento desejado de A em um poli (A) líder ou Poly (A) cauda pode ser personalizado nos primers. Por exemplo, para adicionar 50 a ' s na cauda poli (a), o primer reverso deve implicar 50 T' s. Da mesma forma, para adicionar 20 A ' s no poli (a) líder, o primer para a frente deve implicar 20 A ' s.
5. Para o controle interno, projete um outro conjunto de primers contendo os seguintes elementos em 5 ' a 3 ' direção: T7 promotor, uma sequência de codificação 5 '-UTR aleatória contendo a sequência de Kozak, renilla luciferase ORF e Poly (a) cauda referida doravante como T7_ Kozak-Rluc.
6. Em um tubo do PCR, adicione os reagentes na seguinte ordem: água livre de DNase, polymerase do ADN da elevado-fidelidade 2x, primeiras demão, e ADN confirmado seqüência do molde do luciferase (tabela 2).
   Nota: As quantidades de componentes individuais na mistura devem ser ajustadas de acordo com o volume da reacção.
7. Use um ciclo de PCR padrão de 3 etapas (desnaturação, recozimento, extensão) para gerar um modelo de DNA, conforme mostrado na tabela 3.
   Nota: Temperatura de recozimento X ° c depende do conjunto de primer sendo usado e tempo de extensão T min dependem do tamanho do amplicon PCR e DNA polimerase usado.
8. Detecte o produto do PCR executando 5-10% da reação do PCR na electroforese do gel do agarose Tris-Acetato-EDTA (Tae) de 1% (que contem o brometo do etídio 0.1 μg/ml) junto com o padrão de peso molecular disponível comercialmente. Visualize o gel um iluminador UV para determinar o tamanho do produto do PCR.
9. Após ter determinado o tamanho correto do produto do PCR, ~ 1,7 KB para T7_12A-Fluc e ~ 1,0 KB para T7_Kozak-rluc, purificar o usando um jogo comercialmente disponível da purificação do PCR. Elute o DNA usando 100 μL de água livre de nuclease (Figura 2b).
10. Uma vez purificada, verifique a concentração do DNA usando um espectrofotômetro e determine a relação A260/A280 (~ 1.8-2.0 é aceitável).
11. Armazene o ADN purified a-20 ° c ou use-o para a transcrição in vitro imediatamente.

2. gerar mRNA por transcrição in vitro

1. Sintetizar RNA do produto PCR in vitro, utilizando um kit de transcrição in vitro (Figura 3a).
   Nota: os moldes do ADN de T7_12A-Fluc e de T7_Kozak-rluc são usados para sintetizar 12A-Fluc e Kozak-Rluc mRNAs, respectivamente.
   1. Para fazer isso, pegue um tubo de microcentrífuga e adicione os reagentes na seguinte ordem: água livre de DNase-RNase, mistura do tampão de NTP, Analog do tampão, produto do PCR do molde, mistura da polimerase T7-RNA (tabela 4).
      Nota: Outros sistemas tampando podem igualmente ser usados para tampar o RNA sequencialmente após a transcrição in vitro que segue a instrução do fabricante.
   2. Misture completamente e incubar a 37 ° c durante 2 h.
   3. Prossiga para a purificação do RNA sintetizado usando um kit de purificação de RNA.
2. Executar RNA purificado em 1,5% de agarose Tris-borato-EDTA (TBE) gel (contendo 0,5 μg/ml de brometo de etídio) para verificar o RNA. Visualize o gel um iluminador UV (Figura 3B).
3. Verifique a concentração do RNA usando um espectrofotômetro e determine a relação A260/A280 (~ 1.8-2.0 é aceitável).
4. Aliquot o RNA purified e armazene em-80 ° c.

3. transfect mRNA para células

1. Células HeLa semente em uma placa de 24 poços (para ser aprox. ~ 80-90% confluente no dia seguinte) e incubar durante a noite em uma incubadora em 37 ° c com 5% CO₂.
2. Infectar células HeLa com vírus vacinia (VACV) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 ou manter células HeLa não infectadas para comparação.
   Nota: MOI é o número de partículas virais infecciosas por célula.
3. MOI de X = {[(número de células * X)/titer de vírus] * 1000} μL de vírus por 1 mL médio.
4. Após a infecção desejada do borne de h (HPI) (neste experimento em 10-12 HPI), difícil transfecção mRNA (500 ng do mRNA total por o poço de 24 placas do poço) usando um reagente catiônicos do transfection do lipido como mostrado na Figura 3C.
   1. Para um poço de uma placa de 24 poços, misture 480 ng da seqüência 12A que carrega o luciferase do Firefly do vagalume (12A-Fluc) mRNA e 20 ng da seqüência de Kozak que carrega o mRNA de Renilla luciferase (Kozak-rluc) em um tubo do microcentrífuga. Em outro tubo de microcentrífuga adicionar 1,1 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica.
   2. Adicionar 55 μL de meio sérico reduzido em ambos os tubos. Misture e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
   3. Após 5 min de incubação, adicionar 55 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica contendo meio sérico reduzido em tubo contendo mRNA.
   4. Misture suavemente, mas completamente, e incubar à temperatura ambiente por 15 min.
   5. Durante a incubação, retire o meio de cultura celular e acrescente 400 μL de meio sérico reduzido por poço de placas de 24 poços.
   6. Após a incubação, adicione 100 μl da mistura gota e uniformente a um poço de 24 placas do poço.

4. Meça atividades de luciferase

1. Cinco horas pós-co-transfection de 12A-Fluc e Kozak-Rluc mRNA, meça a atividade do luciferase usando um sistema do ensaio do luciferase capaz de executar dois ensaios do repórter (por exemplo, jogo duplo do ensaio do repórter do luciferase).
2. Remova o meio sérico reduzido e lyse as células adicionando 150 μL de tampão de Lise 1x, um componente do kit de ensaio de luciferase.
3. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, colete o lisado raspando as células e transfira para um tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugue o lisado em 12.000 x g por 10 minutos em 4 ° c aos restos da pilha da pelota.
5. Adicionar 30 μL de sobrenadante em placa de ensaio com paredes opacas 96 bem branco com fundo sólido.
6. Meça a luminescência dupla usando o kit de ensaio de luciferase e um luminômetro de leitor de placas multimodo.
7. Realize a medição utilizando a função cinética (numa base por poço) utilizando as definições descritas na tabela 5.
   Nota: A leitura também pode ser tomada usando o luminômetro manual. Adicionar um volume igual de lisado e substrato para Fluc em uma cubeta. Aguarde 2 s e meça por 10 s usando o luminômetro. Após a medição Fluc, rapidamente tirar a cubeta do luminômetro e adicionar um volume igual do substrato para Rluc manualmente. Novamente, aguarde 2 s e meça por 10 s usando o luminômetro.
8. Exporte os dados de leitura de luminescência para um formato de arquivo desejável.
9. Determine a taxa relativa da tradução de 12A-Fluc mRNA em pilhas não infectados e vacv Infected Hela dividindo o valor de Fluc pelo controle interno valor de rluc.
   Nota: A Figura 1 complementar mostra a análise passo a passo dos dados brutos para obter a atividade Fluc relativa.

Resultados

As quatro etapas do ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseada em RNA: PCR para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro, in vitro a transcrição para gerar o mRNA, o transfection do mRNA, e a medida do luciferase, podem ser considerados no diagrama esquemático ( Figura 1). A concepção de primers para ambos os modelos de DNA (Fluc e rluc) e o esquema geral de extensão de saliência PCR é ilustrado no esquema (

Discussão

Todas as etapas do quatro-núcleo são críticas ao sucesso do in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Uma atenção especial deve ser dada ao projeto da primeira demão, especial para a seqüência do promotor T7. T7 RNA polymerase começa a transcrição do sublinhado primeiro G (ggg-5 '-UTR-Aug-) em T7 promotor adicionado antes da seqüência de 5 '-UTR. Embora o local do começo da transcrição (TSS) Comece do primeiro G no 5 ' extremidade, diminuindo o número de G ' s menos de tr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master mix	New England Biolabs	M0492	High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog	New England Biolabs	S1411L	Anti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate	Corning	3693	Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	OMEGA BIO-TEK	D6492	PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate Luminometer	Promega	GM2010	Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit	New England Biolabs	E2050S	In Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	Reduced serum media
Purelink RNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	RNA purification kit
Vaccinia Capping System	New England Biolabs	M2080	Capping system