JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол для изучения регулирования перевода мРНК в poxvirus-инфицированных клетках с использованием в пробирке Транскрибированного РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Анализ может быть использован для изучения правил перевода СНГ-элементами мРНК, в том числе 5 '-непереведенного региона (UTR) и 3 '-UTR. С помощью этого метода можно также изучить различные режимы инициирования перевода.

Аннотация

Каждый poxvirus мРНК транскрибируется после вирусной репликации ДНК имеет эволюционно сохраняется, не-шаблонированные 5 '-поли (а) лидер в 5 '-UTR. Для того, чтобы вскрыть роль 5 '-поли (A) лидер в переводе мРНК во время poxvirus инфекции мы разработали в пробирке транскрипции РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Этот репортер анализ состоит из четырех основных этапов: (1) ЦР, чтобы усилить шаблон ДНК для экстракорпорального транскрипции; (2) в пробирке транскрипции для генерации мРНК с использованием T7 РНК-полимеразы; (3) трансфеекция ввести в пробирке транскрибированной мРНК в клетки; (4) обнаружение активности люциферазы как индикатора перевода. РНК-основанная люцифазы репортер анализ описал здесь обходит вопросы плазмированной репликации в poxvirus-инфицированных клеток и загадочные транскрипции из плазмида. Этот протокол может быть использован для определения правил перевода СНГ-элементов в мРНК, включая 5 '-UTR и 3 '-UTR в системах, не инфицированных poxvirus. Кроме того, с помощью этого метода можно исследовать различные режимы инициирования перевода, такие как ограничения, зависящие от капитализации, повторное посвящение и внутреннее инициирование.

Введение

Согласно Центральной догме, генетическая информация течет от ДНК к РНК, а затем, наконец, к белку1,2. Этот поток генетической информации жестко регулируется на многих уровнях, включая мРНК перевод3,4. Разработка журналистскими проверочные исследования для измерения регулирования экспрессии генов облегчит понимание регуляторных механизмов, участвующих в этом процессе. Здесь мы описываем протокол для изучения перевода мРНК с помощью экстракорпорального транскрибированного РНК-анализа на основе вируса люциферазы в poxvirus-инфицированных клетках.

Poxviruses состоят из многих очень опасных патогенов человека и животных5. Как и все другие вирусы, поксвирусов полагаются на оборудование клеток-хозяев для синтеза белка6,7,8. Для эффективного синтеза вирусных белков, вирусы развивались многие стратегии, чтобы захватить сотовой трансляционной машины, чтобы перенаправить его для перевода вирусного mRNAs7,8. Одним из распространенных механизмов, используемых вирусами, является использование в их транскриптах элементов, действующих в СНГ. Известные примеры включают в себя внутренний вход ribosome (IRES) и Кап-независимый перевод усилитель (цитируют)9,10,11. Эти СНГ-элементы оказывают вирусную стенограммы поступательное преимущество путем привлечения поступательного машинного оборудования через различные механизмы12,13,14. Более 100 poxvirus mRNAs имеют эволюционно консервативны цис-действующий элемент в 5 '-непереведенный регион (5 '-UTR): 5 '-поли (а) лидер в самом 5 ' концы этих mRNAs15,16. Длины этих 5 '-поли (а) лидеры гетерогенных и генерируются проскальзывание poxvirus кодируется РНК полимеразы во время транскрипции17,18. Мы и другие, недавно обнаружили, что 5 '-поли (а) лидер дает перевод преимущество мРНК в клетках, инфицированных вирусом вакцинии (ВАВ), прототипический член поксвирусов19,20.

В пробирке транскрибированный РНК-основанный люциффераз репортер анализ был первоначально разработан, чтобы понять роль 5 '-поли) лидер в мРНК перевода во время poxvirus инфекция19,21. Хотя плазмино ДНК-основанные люциферазы репортер анализы широко используются, есть несколько недостатков, которые усложнят интерпретации результатов в poxvirus-инфицированных клеток. Во-первых, плазмид способны реплицировать в ВАV-инфицированных клетках22. Во-вторых, загадочные транскрипции часто происходит от плазмид ДНК18,23,24. В-третьих, ВАВ промоутер управляемой транскрипции генерирует поли (а)-лидер гетерогенной длины, следовательно, делает его трудно контролировать поли (а)-лидер длины в некоторых экспериментах18. В пробирке транскрибированный на основе РНК-люциффераза репортер анализ обходит эти вопросы и интерпретации данных проста.

Есть четыре ключевых шага в этом методе: (1) полимеразной цепной реакции (ЦР) для генерации шаблона ДНК для экстракорпорального транскрипции; (2) в пробирке транскрипции для генерации мРНК; (3) трансфеекция для доставки мРНК в клетки; и (4) обнаружение деятельности люциферазы в качестве показателя перевода (рис. 1). В результате КЦР ампликон содержит следующие элементы в 5 ' к 3 ' направление: T7-промоутер, поли (а) лидер или желаемого 5 '-UTR последовательности, Открытый люциферазы чтения кадр (ОРФ), а затем поли (а) хвост. КЦР ампликон используется в качестве шаблона для синтеза мРНК в пробирке транскрипции с использованием T7 полимеразы. Во время в пробирке транскрипции, m7G Cap или другой аналоговый колпачок включен в недавно синтезированных мРНК. Увенчанные стенограммы трансфцируются в неинфицированные или вкv-инфицированные клетки. Клетка lyнасыт собирается в нужное время после переливания для измерения деятельности люциферазы, которые указывают на выработку белка с трансффицированных мРНК. Этот репортер анализ может быть использован для изучения перевода регулирование СНГ-элемент присутствует в 5 '-UTR, 3 '-UTR или других регионах мРНК. Кроме того, в пробирке транскрибированной РНК-анализ может быть использован для изучения различных механизмов начала перевода в том числе крышки-зависимого инициирования, крышка независимого инициирования, повторного посвящения и внутреннего начала, как IRES.

протокол

1. Подготовка ДНК шаблона путем ЦР для экстракорпорального транскрипции

  1. Для подготовки шаблона ДНК по ЦР, Дизайн праймеров. При проектировании праймеров рассмотрим важнейшие характеристики, такие как длина грунтовки, отжима температуры (Tm), содержание GC, 3 ' конец с G или C и т.д.
    Примечание: Подробно обсуждался в этой литературе25,26,27.
  2. Дизайн праймеров для создания КЦР ампликон содержащие следующие элементы в 5 ' к 3 ' направление: T7-промоутер, поли (а) лидер, Светлячок люциферазы ОРФ и поли (а) хвост, упомянутых далее в качестве T7_12A-fluc. Дизайн праймеров (вперед и назад), чтобы охватить все дополнительные элементы, не присутствующие в шаблоне ДНК (рисунок 2A).
    Примечание: Последовательность всех элементов можно найти в таблице 1.
  3. Включите несколько дополнительных нуклеотидов в форвард грунт (5 '-3 ')28, а затем T7-промоутер, поли (а) лидер или желаемого 5 '-UTR последовательности и около 20 нуклеотиды, корректировать на основе Tm, соответствующий 5 ' конец репортер гена Orf. Убедитесь, что соответствующий регион в прайде идентична нити чувства (+ нить) гена.
    Примечание: Для длинных 5 '-UTR, синтезировать два фрагмента ДНК: один с T7 промоутер следуют длинные 5 '-UTR и второй с журналистом гена ОРФ. Присоединяйтесь к этим двум фрагментам, используя расширение перекрытия ЦР-29.
  4. Дизайн обратной грунтовки (5 '-3 '), чтобы включить поли (а) хвост и около 20 нуклеотиды, корректировать на основе тм, соответствующий 3 ' конец репортер гена в ОРФ. Обеспечить соответствующий регион в грунт совпадает с анти-Sense прядь (-Стрэнд) гена и в кадр остановка кодон присутствует перед поли (а) хвост.
    Примечание: Желаемая длина A в поли (A) лидер или поли (A) хвост может быть настроен в праймеров. Например, чтобы добавить 50 A в поли (A) хвост, обратный грунт должен повлечь за собой 50 т. Аналогичным образом, чтобы добавить 20 а в поли (а) лидер, вперед грунт должен повлечь за собой 20 а.
  5. Для внутреннего контроля, Дизайн другой набор праймеров, содержащие следующие элементы в 5 ' к 3 ' направление: T7 промоутер, случайные 5 '-UTR последовательности кодирования, содержащие последовательность Козака, Ренилла люциферазы ОРФ и поли (а) хвост, упомянутых далее в качестве T7_ Козак-Рлюк.
  6. В трубке для ЦР добавьте реагенты в следующем порядке: Свободная вода, 2x высокая точность ДНК-полимеразы, праймеры и последовательность подтвержденной ДНК шаблона люциферазы (Таблица 2).
    Примечание: Количество отдельных компонентов в смеси должно корректироваться в зависимости от объема реакции.
  7. Используйте стандартный 3-Step (денатурации, Анналин, расширение), цикл для создания шаблона ДНК, как показано в таблице 3.
    Примечание: Аннилинг температура X ° c зависит от набора грунтовки используются и время расширения T мин зависит от размера КЦР ампулион и полимеразы ДНК используется.
  8. Обнаружить продукт ЦР путем запуска 5-10% от реакции ЦР в 1% агарозы рис-ацетат-ЭДТА (ТЭ) гель электрофорез (содержащий 0,1 мкг/мл этидий бромид) наряду с коммерчески доступным молекулярный вес стандарта. Визуализируйте гель под ультрафиолетовым иллюминатором, чтобы определить размер продукта для ЦР.
  9. После определения правильного размера продукта КЦР, ~ 1,7 КБ для T7_12A-fluc и ~ 1,0 КБ для T7_Kozak-Rluc, очистить его с помощью коммерчески доступного комплекта очистки ЦР. Елют ДНК с помощью 100 мкл Нуклеаза свободной воды (рис. 2B).
  10. После очищения, проверить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра и определить соотношение A260/A280 (~ 1.8-2.0 является приемлемым).
  11. Храните очищенную ДНК при температуре-20 °C или используйте сразу в пробирке.

2. генерировать мРНК в пробирке транскрипции

  1. Синтезировать РНК из продукта ЦР в пробирке, используя в пробирке комплект транскрипции (Рисунок 3a).
    Примечание:     T7_12A-fluc и T7_Kozak-RLUC ДНК шаблоны используются для синтеза 12A-fluc и Козак-Рлюк mRNAs, соответственно.
    1. Для этого следует взять трубку микроцентрифуги и добавить реагенты в следующем порядке: Свободная вода, НТП буфер Mix, Кап аналоговый, шаблон ЦР-продукт, T7-РНК-полимеразы Mix (Таблица 4).
      Примечание: Другие системы укупорки также могут быть использованы для ограничения РНК последовательно после экстракорпорального транскрипции после инструкции производителя.
    2. Тщательно перемешать и инкубировать при температуре 37 ° c в течение 2 ч.
    3. Приступаем к очистке синтезированной РНК с помощью комплекта для очистки РНК.
  2. Выполнить очищенную РНК в 1,5% агарозы ТРС-боната-ЭДТА (TBE) гель (содержащий 0,5 мкг/мл этидий бромид) для проверки РНК. Визуализируйте гель под ультрафиолетовым иллюминатором (рисунок 3B).
  3. Проверить концентрацию РНК с помощью спектрофотометра и определить соотношение A260/A280 (~ 1.8-2.0 приемлемо).
  4. Aliquot очищенной РНК и хранить при температуре-80 ° c.

3. transfect мРНК к клеткам

  1. Семян Неа клетки в 24-хорошо пластины (будет около. ~ 80-90% свободно на следующий день) и инкубировать ночь в инкубаторе при 37 ° c с 5% CO2.
  2. Заразить клетки Неа с вакциной вируса (ВАВ) на множественности инфекции (МВД) из 5 или сохранить незараженные клетки Хелы для сравнения.
    Примечание: МВД является количество инфекционных вирусных частиц на ячейку.
  3. МВД X = {[(количество ячеек * X)/вирус Титер] * 1000} мкл вируса на 1 мл среды.
  4. После желаемого h сообщению инфекции (ИНН) (в этом эксперименте на 10-12 Инн), трансфицировать мРНК (500 нг общей мРНК в колодец 24-хорошо пластин) с использованием катионических липидного перелив, как показано на рисунке 3c.
    1. Для одной скважины из 24-хорошо пластины, смешайте 480 нг 12A последовательности подшипник люциферазы Светлячок (12A-fluc) мРНК и 20 нг последовательности Козак подшипник Ренилла люциферазы (Козак-рлюк) мРНК в одной микроцентрифуге трубки. В другой трубке микроцентрифуга добавить 1,1 МКН катионических липидных преобразовающих реагентов.
    2. Добавить 55 мкл уменьшил сыворотки в обеих трубках. Смешайте и Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
    3. После 5 минут инкубации, добавить 55 мкл катионический липидный перелив, содержащий снижение сыворотки средней в мРНК содержащие трубки.
    4. Смешайте осторожно, но тщательно, и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
    5. Во время инкубации, удалить клеточной культуры среды и добавить 400 мкл уменьшил сыворотки среднего на хорошо 24-хорошо пластин.
    6. После инкубации, добавить 100 мкл смеси дровыли и равномерно, чтобы один колодец 24-хорошо пластин.

4. мера Люцифераза деятельности

  1. Пятичасовой пост-совместное подключение 12A-fluc и Козак-Рлюк мРНК, мера Люцифераза деятельности с помощью системы анализа Люцифера, способных выполнять два репортера (например, двойной люциферазы репортер пробирного комплекта).
  2. Удалите уменьшые средние и Lyse клетки, добавив 150 Мкl 1x-буфер лизиса, компонент пробирного набора люциферазы.
  3. После 10 мин инкубации при комнатной температуре, соберите lyнасыт путем утилизации клеток и передачи в пробирку микроцентрифуги.
  4. Центрифуга насытить на 12 000 x g в течение 10 минут при температуре 4 ° с до мусора клеток гранул.
  5. Добавить 30 мкл супернатант в непрозрачной стеной 96 хорошо белая Пробирная плита с твердым дном.
  6. Измерьте двойное свечение с помощью пробирного комплекта люцифферазы и многорежимного читателя пластины люминиметр.
  7. Выполните измерение с помощью кинетики функции (на основе хорошо) с помощью параметров, описанных в таблице 5.
    Примечание: Чтение также может быть взято с помощью ручного светильнометра. Добавьте равный объем ливы и субстрата для fluc в кюветте. Подождите 2 с и измерьте 10 с использованием светильнометра. После измерения fluc, быстро Возьмите Кюветт из лютометра и добавить равный объем подложки для Рлюка вручную. Опять же, подождите 2 с и измерить 10 с помощью светильнометра.
  8. Экспорт люминесценции чтения данных в желаемом формате файла.
  9. Определите относительный коэффициент перевода от 12A-fluc мРНК в незараженных и ВАВ инфицированных клетках Неа путем деления значения fluc внутренним контролем Rluc значение.
    Примечание: Дополнительная диаграмма 1 показывает пошаговый анализ исходных данных для получения относительной активности fluc.

Результаты

Четыре шага в пробирке транскрибированной РНК-на основе корреспондент анализа: КЦР для создания шаблона ДНК для в пробирке транскрипции, в пробирке транскрипции для генерации мРНК, РНК-трансформирования и измерения люциферазы, можно увидеть в схеме схематичный (

Обсуждение

Все четыре основные шаги имеют решающее значение для успеха в пробирке транскрибированной РНК-на основе анализа репортер люциферазы. Особое внимание следует уделять дизайну грунтовки, особенно для последовательности промоутера T7. T7 РНК-полимеразы начинается транскрипция с подчеркну...

Раскрытие информации

Авторы хотели бы заявить о неконкурирующем финансовом интересе.

Благодарности

Проект финансировался национальными институтами здоровья (AI128406 www.nih.gov) в ZY и частично Джонсон онкологический исследовательский центр (http://cancer.k-state.edu) в форме аспирант летняя Стипендия для PD.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master mixNew England BiolabsM0492High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabsS1411LAnti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplateCorning3693Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1960Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOMEGA BIO-TEKD6492PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate LuminometerPromegaGM2010Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis KitNew England BiolabsE2050SIn Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Reduced serum media
Purelink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific12183018ARNA purification kit
Vaccinia Capping SystemNew England BiolabsM2080Capping system

Ссылки

  1. Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
  2. Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  3. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  4. Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
  5. Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
  6. Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
  7. Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
  8. Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
  9. Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
  10. Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
  11. Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
  12. Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
  13. Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
  14. Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
  15. Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
  16. Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
  17. Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
  18. Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
  19. Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
  20. Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
  21. Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
  22. De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
  23. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
  24. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
  25. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  26. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
  27. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
  28. Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
  29. Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
  30. Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
  31. Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
  32. Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
  33. Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
  34. Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
  35. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147poxvirus5 UTR5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены