시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

요약

우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 '-미 번역 지역 (UTR) 및 3 '-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.

초록

바이러스 DNA 복제 후에 전사 된 모든 폭스 바이러스 mRNA는 5 '-UTR의 진화 적으로 보존 된 비 템플릿 기반 5 ' 폴 리 (A) 선두 주자입니다. 폭스 바이러스 감염 시 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 해 하는 우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 검정을 개발 했습니다. 이 리포터 검정은 4 개의 핵심 단계를 포함 한다: (1) 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 증폭 하는 PCR; (2) 시험관 내 전사 T7 RNA 중 합 효소를 사용 하 여 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 시험관 내에서 세포 내로 전사 된 mRNA를 도입 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출. 여기에 설명 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 플라스 미드 로부터 폭스 바이러스에 감염 된 세포 및 비밀 전사의 플라스 미드 복제의 문제를 회피 한다. 이 프로토콜은 폭스 바이러스에 감염 된 세포가 아닌 시스템에서 5 '-UTR 및 3 '-UTR를 포함 한 mRNA의 cis원소에의 한 번역 조절을 결정 하는데 사용 될 수 있다. 또한이 방법을 사용 하 여 cap 종속, cap 독립적, 다시 시작 및 내부 시작과 같은 다양 한 번역 시작 모드를 조사할 수 있습니다.

서문

중앙 교리에 따르면, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 그리고 마침내 단백질^1,2로 흐릅니다. 유전 정보의이 흐름은 mRNA 번역^3을포함 하 여 많은 수준에서 높게 통제 됩니다,⁴. 유전자 발현 조절을 측정 하기 위한 리포터 분석의 개발은이 과정에 관여 하는 규제 메커니즘의 이해를 용이 하 게 한다. 여기서 우리는 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법을 사용 하 여 mRNA 번역을 연구 하는 프로토콜을 설명 한다.

폭스 바이러스는 많은 매우 위험한 인간과 동물 병원 균을 포함 한다⁵. 다른 모든 바이러스 처럼, 폭스 바이러스 독점적으로 단백질 합성에 대 한 호스트 세포 기계에 의존^6,7,8. 바이러스 성 단백질을 효율적으로 합성 하기 위해 바이러스는 세포 중개 기계를 납치 하 여 바이러스 mrnas^7,8의 번역을 위해이를 리디렉션하는 많은 전략을 진화 시켰습니다. 바이러스에 의해 일반적으로 채택 되는 기계 장치는 그들의 전사체에 있는 cis행동 요소를 사용 하는 것입니다. 주목할 만한 예로는 내부 리보솜 진입 부위 (에 어) 및 캡 독립적인 번역 증강 인자 (인용),¹¹등이 있다. 이러한 cis요소는 다양 한 기 작^12,13,14를 통해 중개 기계를 유치 함으로써 번역 적 우위를 바이러스 전사체를 렌더링 한다. 100 폭스 바이러스 mrnas는 5 ' 미 번역 지역 (UTR)에서 진화 하 여 보존 된 시스-작동 소자를가지고 있으며^,이러한 mrnas¹⁵의 5 ' 말단에서 5 ' 폴 리 (a) 리더입니다. 이러한 5 '-폴 리 (A) 지도자의 길이는 이종 이며 전사 동안 폭스 바이러스 부호화 RNA 중 합 효소^17,18의 미 끄 러 짐에 의해 생성 된다. 우리와 다른 사람들은 최근 5 '-폴 리 (A) 지도자가 백 시 니 아 바이러스 (vacv)에 감염 된 세포에서 mRNA에 번역 이점을 부여 한다는 것을 발견 하였으며,이는 폭스 바이러스^19,20의 프로토 타입 부재 이다.

시험관 내 전사 된 RNA 계 루시퍼 라 제 리포터 분석은 처음에 폭스 바이러스 감염^19,21동안 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 이해 하기 위하여 개발 되었다. 플라스 미드 DNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법이 널리 사용 되 고 있지만, 폭스 바이러스 감염 세포에서의 결과 해석을 복잡 하 게 하는 몇 가지 단점이 있다. 먼저, 플라스 미드는 VACV 감염 세포 (²²)에서 복제할 수 있다. 둘째, 암호화 된 전사는 플라스 미드 DNA^18,23,24에서 종종 발생 한다. 셋째, VACV 프로모터 구동 전사는 불균일 한 길이의 폴 리 (A) 리더를 생성 하 여 일부 실험¹⁸에서 폴 리 (a) 지시선 길이를 제어 하기 어렵게 한다. 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 이러한 문제를 회피 하 고 데이터 해석은 간단 합니다.

이 방법에는 4 가지 주요 단계가 있습니다. (1) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성 하는 단계; (2) 시험관 내 전사 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 세포에 mRNA를 전달 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출 (그림 1) 얻어진 PCR 증폭은 5 ' ~ 3 ' 방향으로 다음과 같은 요소를 포함 합니다: T7, 폴 리 (a) 리더 또는 원하는 5 ' UTR 서 열, 반딧불 루시퍼 라 제 오픈 리딩 프레임 (ORF) 뒤에 폴 리 (a) 꼬리. PCR 증폭은 T7 중 합 효소를 사용 하 여 시험관 내 전사에 의해 mRNA를 합성 하는 템플릿으로 사용 된다. 시험관 내 전사 동안, m⁷G 캡 또는 다른 캡 아날로그는 새로 합성 된 mRNA에 혼 입 된다. 캡 핑 된 전사체는 감염 되지 않은 또는 VACV 감염 된 세포로 형질 전환 된다. 세포 파쇄 액은 형질 감염 후 원하는 시간에 수집 되어 mRNA 로부터 단백질 생산을 나타내는 루시퍼 라 제 활동을 측정 한다. 이 리포터 분석 법은 mRNA의 5 '-UTR, 3 '-UTR 또는 그밖 지구에 있는 cis원소 존재에 의해 번역 규칙을 공부 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 더욱이, 시험관 내 전사 된 RNA-기반 어 세이는 캡 의존적 개시, 캡 독립적 개시, 재 개시 및 아 스와 같은 내부 개시를 포함 하는 번역 개시의 상이한 메커니즘을 연구 하는데 사용 될 수 있다.

프로토콜

1. 시험관 내 전사 를 위한 PCR에의 한 DNA 템플릿 제조

1. PCR에 의해 DNA 템플릿을 제조 하기 위해, 프라이 머를 설계 하였다. 프라이 머를 설계 할 때 뇌관 길이, 어 닐 링 온도 (T_m), GC 내용, G 또는 C 등으로 3 끝과 같은 중요 한 특성을 고려
   참고: 이들 문헌^25,26,27에서 상세히 논의 한다.
2. 다음 원소를 포함 하는 PCR 앰 플 아이콘을 생성 하는 프라이 머를 설계 하 여 5 ' 내지 3 ' 방향: T7, 폴 리 (A) 리더, 반딧불 루시퍼 라 제 ORF 및 폴 리 (A) 꼬리는 T7_12A로 서 지칭 된다. 디자인 프라이 머 (정방향 및 역방향)는 템플릿 DNA에 존재 하지 않는 모든 부가적인 원소 들을 포괄 한다 (도 2a).
   참고: 모든 요소의 시퀀스는 표 1 에서 찾을 수 있습니다.
3. 앞으로 프라이 머 (5T7 ')²⁸의 추가 뉴클레오티드를 포함 하 고, 상기 리포터 유전자의 5 ' 말단에 상응 하는, UTR 서 열 및 약 20 개 뉴클레오티드를 기준으로 하 여, tm에 기초 하 여 조정 된 다. Orf. 프라이 머에 상응 하는 영역이 유전자의 센스 가닥 (+ 가닥)과 동일한 지 확인 한다.
   참고: 긴 5 '-UTR의 경우, 두 개의 DNA 단편을 합성 합니다: T7 프로모터를 가진 하나는 리포터 유전자의 ORF과 함께 긴 5 '-UTR 및 두 번째. 이 두 단편을 중첩 확장 PCR²⁹를 사용 하 여 결합 합니다.
4. 폴 리 (A) 꼬리와 약 20 개의 뉴 클레 오타 이드를 포함 하는 역방향 프라이 머 (5M.3t)는 리포터 유전자의 ORF의 3 ' 말단에 상응 하는 T_m에 기초 하 여 조정 한다. 프라이 머에서 상응 하는 영역이 폴 리 (A) 꼬리에 존재 하는 유전자의 안티 센스 가닥 (가닥)과 동일한 인-프레임 정지 코 돈을 확인 한다.
   참고: 폴 리 (A) 지시선 또는 폴 리 (A) 꼬리의 원하는 길이는 프라이 머에서 사용자 정의 할 수 있다. 예를 들어 폴 리 (A) 꼬리에 50 A를 추가 하려면 역방향 프라이 머가 50 T의 것을 수반 해야 합니다. 마찬가지로, 폴 리 (A) 리더에 20A의를 추가 하기 위해, 전방 프라이 머는 20 A의를 수반 한다.
5. 내부 제어를 위하여, 다음 원소 들을 5 ' 내지 3 ' 방향으로 포함 하는 또 다른 프라이 머 세트를 설계 한다: T7 프로모터, 코자크 서 열을 포함 하는 랜덤 한 5 '-UTR 코딩 서 열, 렌 딜 로 루시퍼 라 제 ORF 및 폴 리 (a) 꼬리는 하기에서 언급 되었다 T7_ 고 자크-루크.
6. PCR 튜브에서 다음과 같은 순서로 시 약을 추가 합니다. DNase 자유 물, 2 배의 고 충실도 DNA 중 합 효소, 프라이 머 및 서 열 루시퍼 라 제 템플릿 DNA를 확인 하였다 (표 2).
   참고: 혼합물 내의 개별 성분의 양은 반응 부피에 따라 조정 되어야 한다.
7. 표 3에 나타난 바와 같이 표준 3 단계 (변성, 어 닐 링, 연장) PCR 주기를 사용 하 여 DNA 템플릿을 생성 한다.
   참고: 소 둔 온도 X ° c는 사용 되는 프라이 머 세트 및 연장 시간 T min에 의존 하 여 PCR 증폭 크기 및 사용 된 DNA 중 합 효소에 의존 한다.
8. Pcr 산물의 5-10%를 상업적으로 이용 가능한 분자량 표준에 따라 1% 아가 로스 트리 스 아세테이트 EDTA (태) 겔 전기 영동으로 실행 하 여 pcr 생성 물을 검출 한다. UV 조명 아래에서 겔을 시각화 하 여 PCR 산물의 크기를 결정 한다.
9. PCR 산물의 정확한 크기를 결정 한 후에, T7_12A-Fluc 및 T7_Kozak에 대해 1.0 kb에 대해 ~ 1.7 kb, 시판 되는 PCR 정제 키트를 사용 하 여이를 정제 한다. 100 µ L 뉴 클레 아 제 자유 물을 사용 하 여 DNA를 용 수 (그림 2b).
10. 일단 정제 되 면 분 광 광도 계를 이용 하 여 DNA의 농도를 확인 하 고 A260/A280 비율을 결정 한다 (~ 1.8-2.0은 허용 가능).
11. 정제 된 DNA를-20°c에서 저장 하거나 즉시 시험관 내 전사에 사용 한다.

2. 시험관 내 전사에의 한 mRNA 생성

1. 시험관 내에서 PCR 산물 로부터 RNA를 합성 하 고, 시험관 내 전사 키트를 사용 한다 (도 3a).
   참고: T7_12A-fluc 및 T7_Kozak-RLUC DNA 템플릿은 각각 12a-Fluc 및 코자크 Rluc mRNAs를 합성 하는 데 사용 됩니다.
   1. 이를 위해 마이크로 원심 분리기 튜브를가지고 다음과 같은 순서로 시 약을 추가 합니다. DNase-RNase가 없는 물, NTP 버퍼 믹스, 캡 아날로그, 템플릿 PCR 제품, T7-RNA 중 합 효소 혼합물 (표 4).
      참고: 다른 캡 핑 시스템은 또한 제조자의 지시에 따라 시험관 내 전사 후에 RNA를 순차적으로 캡으로 사용할 수 있다.
   2. 2 시간 동안 37 ° c에서 철저히 혼합 하 고 배양 하십시오.
   3. RNA 정제 키트를 이용 하 여 합성 된 RNA의 정제를 진행 한다.
2. 정제 된 RNA를 1.5%의 스 트리 보 레이트-EDTA (TBE) 젤 (0.5 µ)으로 실행 하 여 RNA를 확인 하였다. UV 조명 아래에서 젤을 시각화 합니다 (그림 3b).
3. 분 광 광도 계를 이용 하 여 RNA의 농도를 확인 하 고 A260/A280 비율 (~ 1.8-2.0은 허용 가능)을 확인 한다.
4. 정제 된 RNA를 분 취 하 고-80 ° c에서 저장 한다.

3. 세포에 형질 주입 mRNA

1. 24 웰 플레이트에 있는 종자 헬 라 세포 (약 ~ 80-90%의 콘 유창 다음 날) 및 5% CO2로 37 ° c에서 인큐베이터에서 밤새 배양 한다.
2. 감염의 다중성에 (VACV) 백 시 니 아 바이러스로 헬 라 세포를 감염 (MOI) 5 또는 비교를 위한 감염 되지 않은 헬 라 세포를 유지.
   참고: MOI는 세포 당 전염 성 바이러스 입자의 수입니다.
3. X의 모이 (세포 수 * X)/바이러스 역가 1000} µ 바이러스의 1 mL 배지 당.
4. 바람직한 h 사후 감염 (hpi) (10-12 hpi에서 본 실험에서), 도 3c에 도시 된 바와 같이 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 사용 하 여 형질 주입 mrna (24 웰 플레이트의 웰 당 총 mrna의 500 ng).
   1. 24 웰 플레이트의 웰에 대해서는, 1 개의 마이크로 원심 분리기 튜브에 루시퍼 라 제의 12A 시퀀스 베어링 반딧불이 및 20 ng의 코자크 서 열 베어링 Renilla 루시퍼 라 제 (kozak-rluc) mrna를 혼합 480 ng. 또 다른 마이크로 원심 분리기 튜브에는 양이온 성 지질 형질 감염 시 약의 1.1 µ L을 추가 합니다.
   2. 두 튜브에 55 µ L의 감소 된 혈 청 배지를 추가 합니다. 상 온에서 5 분간 혼합 하 여 배양 한다.
   3. 인큐베이션의 5 분 후에, 55 µ L 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 포함 하는 mRNA에서 감소 된 혈 청 배지를 함유 하는 튜브를 첨가 한다.
   4. 부드럽게 하지만 철저히 혼합 하 고 실 온에서 15 분간 배양 합니다.
   5. 배양 동안, 세포 배양 액을 제거 하 고 24 웰 플레이트의 웰 당 감소 된 혈 청 배지를 400 µ L을 첨가 한다.
   6. 배양 후, 혼합물의 100 µ L을 24 웰 플레이트의 웰에 고르게가 하 여 첨가 한다.

4. 루시퍼 라 제 활동 측정

1. 5 시간 후 12A-Fluc 및 Kozak-Rluc mRNA의 공동 형질 전환-2 개의 리포터 분석 (예컨대, 이중 루시퍼 라 제 리포터 분석 키트)을 수행할 수 있는 루시퍼 라 제 분석 시스템을 사용 하 여 루시퍼 라 제 활성을 측정 한다.
2. 감소 된 혈 청 배지를 제거 하 고 150 µ L 1x 용 해 완충 액을 추가 하 여 세포를 lyse, 루시퍼 라 제 분석 키트의 구성 요소.
3. 실 온에서 10 분간 인큐베이션 한 후, 세포를 스크 래핑 하 여 파쇄 물을 수집 하 고 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
4. 파쇄 물을 12000 x g 에서 4°c에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛 세포 파편으로 한다.
5. 고체 바닥으로 불투명 벽 96 잘 흰색 분석 판에 상층 액의 30 µ L을 추가 합니다.
6. 루시퍼 라 제 분석 키트 및 다중 모드 플레이트 리더 루미 노 미터를 사용 하 여 이중 발광을 측정 하십시오.
7. 표 5에 설명 된 설정을 사용 하 여 역학 기능 (well 기준)을 사용 하 여 측정을 수행 합니다.
   참고: 독서는 또한 수동 루미 노 미터를 사용 하 여 촬영 할 수 있습니다. 큐 벳에 Fluc에 대 한 용 해물과 기질을 동량 추가 합니다. 2 초 동안 기다렸다가 루미 노 미터를 사용 하 여 10 초 동안 측정 합니다. Fluc 측정에 따라 루미 노 미터에서 큐 벳을 빠르게 꺼내 수동으로 Rluc 용 기판의 동량을 추가 합니다. 다시, 2 s를 기다린 루미 노 미터를 사용 하 여 10 s에 대 한 측정 합니다.
8. 형광 판독 데이터를 바람직한 파일 형식으로 내보냅니다.
9. 내부 대조 Rluc 값에 의해 Fluc 값을 분할 하 여 감염 되지 않은 및 VACV 감염 된 헬 라 세포에서 12A-Fluc mRNA 로부터 상대적인 번역 속도를 결정 한다.
   참고: 보충 그림 1 은 상대적인 fluc 활동을 얻기 위해 원시 데이터의 단계별 분석을 보여줍니다.

결과

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 4 단계: 시험관 내 기록 체에 대 한 DNA 템플릿 생성 PCR, mRNA 트랜스 펙 션 및 루시퍼 라 제 측정을 생성 하는 생체 외 전사, 개략도에서 볼 수 있다 ( 그림 1). DNA 템플릿 (Fluc 및 Rluc) 모두를 위한 프라이 머의 설계 및 오버행 확장 PCR의 일반적인 계획은 도식 적으로 예시 된다 (도 2a

토론

모든 4-코어 단계는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 성공에 매우 중요 합니다. 특히 T7 프로모터 서 열에 대 한 프라이 머 디자인에 특별 한 주의가 주어져야 한다. T7 RNA 중 합 효소는 T7 프로모터의 밑줄이 그어진 첫 번째 G (gGG-5'-UTR) 로부터 전사를 시작 하 여 5 ' UTR 서 열 전에 첨가 하였다. 전사 개시 사이트 (TSS)는 5 ' 말단에서 제 1 G 로부터 시작 하지만, T7 프로모터 영?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master mix	New England Biolabs	M0492	High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog	New England Biolabs	S1411L	Anti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate	Corning	3693	Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit	OMEGA BIO-TEK	D6492	PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate Luminometer	Promega	GM2010	Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit	New England Biolabs	E2050S	In-Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	Reduced serum media
Purelink RNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	RNA purification kit
Vaccinia Capping System	New England Biolabs	M2080	Capping system