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要約

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 '-非翻訳領域 (UTR) および 3 '-UTR を含む、mRNA のシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。この方法を使用して、異なる翻訳開始モードを調べることもできます。

要約

ウイルス DNA 複製後に転写されるすべてのポックスウイルス mRNA は、5 '-UTR において進化的に保存された、非テンプレート 5 '-ポリ (A) リーダーを有する。ポックスウイルス感染時の mRNA 翻訳における 5 ' ポリ (A) リーダーの役割を分析するために、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイを開発しました。このレポーターアッセイは、4つのコアステップで構成されています:(1) PCR 法転写のための DNA テンプレートを増幅します。(2) T7 RNA ポリメラーゼを用いて mRNA を生成する in vitro 転写;(3) インビトロで転写した mRNA を細胞内に導入するトランスフェクション。(4) 翻訳の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出ここで説明した RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染細胞におけるプラスミド複製の問題と、プラスミドからの不可解な転写を回避します。このプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞以外の系で 5 '-UTR および 3 '-UTR を含む mRNA 中のシス要素による翻訳調節を決定するために用いることができる。さらに、この方法を使用して、キャップ依存性、キャップ非依存、再開始、および内部開始などのさまざまな変換開始モードを調べることができます。

概要

セントラルドグマによると、遺伝情報は DNA から RNA へ、そして最終的にタンパク質1,2に流れます。この遺伝情報の流れは、mRNA 翻訳3,4を含む多くのレベルで高度に調節されている。遺伝子発現の調節を測定するレポーターアッセイの開発は、このプロセスに関与する規制メカニズムの理解を容易にします。ここでは、ポックスウイルスに感染した細胞において、in vitro 転写 RNA ベースのルシフェラーゼを用いた mRNA 翻訳を研究するためのプロトコールについて述べる。

ポックスウイルスは、多くの非常に危険なヒトおよび動物病原体5を含む。他のすべてのウイルスと同様に、ポックスウイルスはタンパク質合成6、7、8のための宿主細胞機械に独占的に依存しています。ウイルスは、ウイルスタンパク質を効率的に合成するために、ウイルス mRNAs7,8の翻訳にリダイレクトするために細胞翻訳機械をハイジャックする多くの戦略を進化させました。ウイルスによって一般的に採用されているメカニズムの1つは、 cisの作用する要素をトランスクリプトに使用することです。顕著な例には、内部リボソーム進入部位 (IRES) およびキャップ非依存性翻訳促進剤 (引用)9、10、11が含まれる。これらのシス元素は、ウイルス転写物を多様なメカニズム12,13,14を介して翻訳機械を誘致することによって翻訳優位にレンダリングする。100以上のポックスウイルス mRNAs は、5 '-非翻訳領域 (5 '-UTR) において進化的に保存されたシス作用素子を有する: これらの mRNAs15,16の非常に 5 ' 末端の 5 '-ポリ (a) リーダー。これらの 5 '-ポリ (A) リーダーの長さは不均一であり、転写17,18の間にポックスウイルスで符号化された RNA ポリメラーゼの滑りによって生成される。我々、および他の人は、最近、5 '-ポリ (A) リーダーがワクシニアウイルス (VACV) に感染した細胞の mRNA に翻訳優位を与えることを発見し、ポックスウイルス19,20のプロトタイプメンバーである。

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染19,21の間の mRNA 翻訳における 5 '-ポリ (A) リーダーの役割を理解するために最初に発達しました。プラスミド DNA 系ルシフェラーゼのレポーターアッセイは広く使用されていますが、ポックスウイルスに感染した細胞では結果の解釈が複雑になる欠点がいくつかあります。まず、プラスミドは、VACV 感染細胞22で複製することができる。第2に、不可解な転写は、しばしばプラスミド DNA18、23、24から生じる。第3に、VACV プロモーター駆動転写は、不均一な長さのポリ (A) −リーダーを生成し、その結果、いくつかの実験18においてポリ (a) −リーダーの長さを制御することを困難にする。インビトロ転写された RNA ベースのルシフェラーゼは、これらの問題を回避し、データの解釈は簡単です。

この方法には、(1) ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の4つの主要なステップがあり、in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成します。(2) mRNA を生成するインビトロ転写;(3) 細胞内に mRNA を送達するトランスフェクションおよび (4) 変換の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出 (図 1)。得られた PCR アンプリコンは、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の元素を含有する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、または所望の 5 '-UTR 配列は、ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレーム (ORF) に続いて、ポリ (A) テールを有する。PCR アンプリコンは、T7 ポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって mRNA を合成する鋳型として使用される。In vitro 転写の間、m7G キャップまたは他のキャップアナログは、新たに合成された mRNA に組み込まれる。証明された転写物は未感染または VACV 感染細胞にトランスフェクトします。.細胞溶解物をトランスフェクション後の所望の時間に収集し、トランスフェクトされた mRNA からのタンパク質産生を示すルシフェラーゼ活性を測定します。このレポーターアッセイは、5 '-UTR、3 '-UTR、またはその他の mRNA の領域に存在するシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。さらに、in vitro 転写された RNA ベースのアッセイは、キャップ依存性の開始、キャップ非依存の開始、再開始および IRES のような内部開始を含む翻訳開始の異なるメカニズムを研究するために使用することができる。

プロトコル

1. PCR による In Vitro転写用 DNA テンプレートの作成

  1. PCR によって DNA テンプレートを調製するために、設計プライマー。プライマーの設計に際しては、プライマー長、アニーリング温度 (Tm)、GC 含有量、G や C などの 3 ' 末端などの重要な特性を考慮してください。
    注:これらの文献25、26、27に詳細に論じた。
  2. 設計プライマーは、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の元素を含む PCR アンプリコンを生成する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、ホタルルシフェラーゼ ORF およびポリ (A) 尾を T7_12A-Fluc として以下に記す。鋳型 DNA に存在しないすべての追加要素を包含するようにプライマー (前方および後方) を設計する (図 2a)。
    注:すべての要素の順序は表1で見つけることができます。
  3. いくつかの余分なヌクレオチドを前方プライマー (5 '-3 ')28に含み、続いて T7 プロモーター、ポリ (A) リーダーまたは所望の 5 '-UTR 配列および約20ヌクレオチドを、Tmに基づいて調整し、レポーター遺伝子の 5 ' 末端に対応するOrf。プライマー内の対応する領域が遺伝子のセンス鎖 (+ 鎖) と同一であることを確認します。
    注:長い 5 '-UTR の場合、2つの DNA 断片を合成します: T7 プロモーターを持つ1つは長い 5 '-UTR、レポーター遺伝子の ORF と2番目です。オーバーラップ拡張 PCR29を使用してこれらの2つのフラグメントを結合します。
  4. 設計逆プライマー (5 ' − 3 ') は、ポリ (A) 尾と約20ヌクレオチドを含むように、Tmに基づいて調整し、レポーター遺伝子の ORF の 3 ' 末端に対応する。プライマー内の対応する領域が遺伝子のアンチセンス鎖 (−ストランド) と同一であること、およびフレーム内停止コドンがポリ (A) テールの前に存在していることを確認する。
    注:ポリ (A) リーダーまたはポリ (A) テールにおける A の所望の長さは、プライマーにおいてカスタマイズすることができる。例えば、ポリ (A) テールに 50 A のを追加するには、リバースプライマーは 50 T を伴うべきです。同様に、ポリ (A) リーダーに 20 A を追加するには、フォワードプライマーは 20 A を伴う必要があります。
  5. 内部制御のために、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の要素を含む別のプライマーのセットを設計する: T7 プロモーター、Kozak 配列を含むランダム 5 '-UTR コード配列、レニラルシフェリンルシフェラーゼ ORF およびポリ (a) 尾として以下に記す T7_Kozak-Rluc。
  6. PCR チューブでは、試薬を次の順序で追加します: DNase の自由な水、2x 高忠実度の DNA ポリメラーゼ、プライマー、および配列確認されたルシフェラーゼテンプレート DNA (表 2)。
    注:混合物中の個々の成分の量は、反応量に応じて調整されるべきである。
  7. 表 3に示すように、標準の3ステップ (変性、アニーリング、エクステンション) PCR サイクルを使用して、DNA テンプレートを生成します。
    注:アニーリング温度 X ° c は、使用されているプライマーセットによって異なり、延長時間 T min は PCR アンプリコンサイズおよび使用される DNA ポリメラーゼによって異なります。
  8. Pcr 反応の 5-10% を、市販の分子量標準とともに 1% のアガローストリス-アセテート-EDTA (エチジウム) ゲル電気泳動 (0.1 μ g/ml の臭化) で実行することによって検出します。UV イルミネータの下でゲルを視覚化して、PCR 産物のサイズを決定します。
  9. PCR 産物の正しいサイズを決定した後、T7_12A-Fluc のための〜 1.7 kb、T7_Kozak-Rluc のための〜 1.0 kb、市販の PCR 精製キットを使用してそれを精製する。100μ l のヌクレアーゼ自由水を使用して DNA を溶出します (図 2b)。
  10. 一旦精製した後、分光光度計を用いて DNA の濃度を確認し、A260/A280 比 (〜 1.8-2.0 が許容される) を決定する。
  11. 精製された DNA を-20 ° c で保存するか、またはインビトロ転写に使用してください。

2. インビトロ転写による mRNA の生成

  1. PCR 産物からインビトロで RNA を合成し、in vitro 転写キット (図 3a) を使用する。
    注:     T7_12A-Fluc および T7_Kozak-RLUC DNA テンプレートは、それぞれ 12a-Fluc および Kozak-Rluc mRNAs を合成するために使用されます。
    1. これを行うには、マイクロ遠心チューブを取り、次の順序で試薬を加えてください: DNase 自由水、NTP バッファミックス、キャップアナログ、テンプレート PCR 産物、T7 RNA ポリメラーゼ混合物 (表 4)。
      注:他のキャッピングシステムはまた、製造業者の指示に従ってインビトロ転写後に RNA を順次キャップするために使用することができる。
    2. 十分に混合し、2 h のための37° c で孵化しなさい。
    3. RNA 精製キットを用いて合成された RNA の精製に進みます。
  2. 精製された RNA を 1.5% のアガローストリス-ホウ酸-EDTA (TBE) ゲル (0.5 μ g/mL エチジウムを含む) で泳動し、RNA を検査します。UV 照明器の下のゲルを視覚化します (図 3b)。
  3. 分光光度計を使用して RNA の濃度を確認し、A260/A280 比 (〜 1.8-2.0 が許容される) を決定します。
  4. 精製 RNA をアリコート、-80 ° c で保存します。

3. 細胞への mRNA のトランスフェクト

  1. 種子 HeLa 細胞を24ウェルプレートに (約 80-90% コンフルエントである次の日)、5% の CO2で37° c のインキュベーター内で一晩インキュベートします。
  2. 複数の感染の多重度 (MOI) でのワクシニアウイルス (VACV) を細胞に感染するか、または感染していない HeLa 細胞を比較します。
    注:MOI は、細胞当たりの感染性ウイルス粒子の数です。
  3. の MOI X = {[(細胞数× X)/ウイルス力価] * 1000} μ l 1 mL 培地あたり。
  4. 所望の h ポスト感染 (hpi) (本実験では 10-12 hpi) の後、トランスフェクト mRNA (24 ウェルプレートの1ウェルあたりの全 mRNA の 500 ng) をカチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いて図 3cに示す。
    1. 24ウェルプレートの1つのウェルについて、1つの Rluc チューブ中に 480 ng の12A 配列の Fluc (12A-2-2) mRNA および 20 ng の Kozak 配列レニラルシフェリンルシフェラーゼ (Kozak-マイクロ遠心) mrna を混合する。別のマイクロ遠心チューブで、カチオン性脂質トランスフェクション試薬の1.1 μ l を添加する。
    2. 両方の管の減らされた血清の媒体の55μ l を加えなさい。混合し、室温で5分間インキュベートします。
    3. 5分間のインキュベーションの後、チューブを含有する mRNA 中に減少した血清培地を含む55μ l カチオン性脂質トランスフェクション試薬を加える。
    4. 優しく、十分に混合し、室温で15分間インキュベートします。
    5. インキュベーションの間、細胞培養培地を除去し、24ウェルプレートのウェルあたりの減少した血清培地400μ l を加えた。
    6. インキュベートした後、24ウェルプレートの1つのウェルに滴下して均等に100μ l の混合物を加えます。

4. ルシフェラーゼ活性の測定

  1. 12A-Fluc および Kozak-Rluc mRNA の5時間の再トランスフェクションは、2つのレポーターアッセイ (例えば、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイキット) を行うことができるルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼ活性を測定します。
  2. 減少した血清培地を除去し、150μ l 1x 溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、ルシフェラーゼ測定キットの成分とする。
  3. 室温で10分間インキュベートした後、細胞を廃棄することによって溶解物を回収し、マイクロ遠心管に移す。
  4. 溶解液を4° c で10分間 12000 x gで遠心分離し、細胞デブリをペレットにします。
  5. 不透明な壁の96に30μ l の上澄みを加え、しっかりとした底を有する白色アッセイプレート。
  6. ルシフェラーゼアッセイキットとマルチモードプレートリーダールミノメーターを使用して、二重発光を測定します。
  7. 表 5に記載されている設定を使用して、動力学関数 (ウェル単位) を使用して測定を実行します。
    注:読書はまた手動ルミノメーターを使用して取ることができる。キュヴェットの Fluc のための等量の溶解物および基質を加えなさい。2秒待ってから、ルミノメーターを使用して10秒間測定します。Fluc 測定の後、すぐにルミノメーターからキュベットを取り出し、手動で Rluc のために同じ体積の基板を追加します。もう一度、2秒待って、ルミノメーターを使用して 10 s のために測定して下さい。
  8. 発光読み取りデータを望ましいファイル形式にエクスポートします。
  9. 非感染および VACV に感染した HeLa 細胞において、Fluc 値を内部制御 Rluc 値で割ることにより、Fluc mRNA からの相対移動率を求めます。
    注:補足図 1は、相対的な Fluc アクティビティを取得するための生データのステップごとの分析を示しています。

結果

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼの4つのステップは、レポーターアッセイ: in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成するために、インビトロで、mRNA を生成する転写、mRNA トランスフェクション、およびルシフェラーゼ測定、スケマティックダイアグラムで見ることができます (図 1)。DNA テンプレート (Fluc および Rluc) の両方のた...

ディスカッション

全ての4コアステップは、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイの成功にとって重要である。プライマーの設計、特に T7 プロモーター配列には特別な注意が払われるべきである。T7 RNA ポリメラーゼは、5 '-UTR 配列の前に追加された T7 プロモーターにおいて下線が付いた最初の G (gGG-5'-UTR-AUG-) からの転写を開始する。転写開始部位 (TSS) は、5 ' 末端で最初の G ?...

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言したいと思います。

謝辞

このプロジェクトは、国立衛生研究所 (AI128406 www.nih.gov) が ZY に、また一部はジョンソンがん研究センター (http://cancer.k-state.edu) によって、大学院生の夏期給付の形で PD に資金を提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master mixNew England BiolabsM0492High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabsS1411LAnti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplateCorning3693Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1960Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOMEGA BIO-TEKD6492PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate LuminometerPromegaGM2010Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis KitNew England BiolabsE2050SIn-Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Reduced serum media
Purelink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific12183018ARNA purification kit
Vaccinia Capping SystemNew England BiolabsM2080Capping system

参考文献

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