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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per studiare la regolazione della traduzione di mRNA nelle cellule infettate da Poxvirus usando il saggio reporter di luciferasi basato sull'RNA trascritto in vitro. Il saggio può essere utilizzato per studiare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elementi di un mRNA, tra cui 5'-non tradotto regione (UTR) e 3'-UTR. Diverse modalità di avvio della traduzione possono anche essere esaminate utilizzando questo metodo.

Abstract

Ogni poxvirus mRNA trascritta dopo la replicazione virale del DNA ha un leader di 5' poli (A) evolutivamente conservato, non-templato nel 5'-UTR. Per dissezionare il ruolo di 5'-poli (a) leader nella traduzione di mRNA durante l'infezione da Poxvirus abbiamo sviluppato un saggio reporter luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Questo saggio reporter comprende quattro fasi principali: (1) PCR per amplificare il modello di DNA per la trascrizione in vitro; (2) trascrizione in vitro per generare mRNA utilizzando T7 RNA polimerasi; (3) trasfezione per introdurre mRNA trascritto in vitro in cellule; (4) rilevazione dell'attività di luciferasi come indicatore della traduzione. Il saggio reporter a base di RNA luciferasi descritto qui aggira i problemi della replicazione plasmide nelle cellule infettate da poxvirus e nella trascrizione criptica dal plasmide. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elements in un mRNA comprendente 5'-UTR e 3'-UTR in sistemi diversi dalle cellule infettate da Poxvirus. Inoltre, è possibile studiare diverse modalità di iniziazione alla traduzione come il CAP-dipendente, il CAP-Independent, la riiniziazione e l'iniziazione interna utilizzando questo metodo.

Introduzione

Secondo il dogma centrale, le informazioni genetiche fluiscono dal DNA all'RNA e poi infine alla proteina1,2. Questo flusso di informazioni genetiche è altamente regolamentato a molti livelli, tra cui la traduzione di mRNA3,4. Lo sviluppo di saggi reporter per misurare la regolazione dell'espressione genica faciliterà la comprensione dei meccanismi normativi coinvolti in questo processo. Qui descriviamo un protocollo per studiare la traduzione di mRNA utilizzando un saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro in cellule affette da Poxvirus.

I poxvirus comprendono molti patogeni umani e animali altamente pericolosi5. Come tutti gli altri virus, i poxvirus si basano esclusivamente su macchine a cellule ospitanti per la sintesi proteica6,7,8. Per sintetizzare efficacemente le proteine virali, i virus hanno sviluppato molte strategie per dirottare la macchina traslazionale cellulare per reindirizzare la traduzione di mRNAs virale7,8. Un meccanismo comunemente impiegato da virus è quello di utilizzare elementi di azione CISnelle loro trascrizioni. Esempi degni di nota includono il sito di ingresso ribosoma interno (IRES) e il potenziatore di traduzione indipendente da Cap (Cite)9,10,11. Questi elementi CISrendono le trascrizioni virali un vantaggio traslazionale attirando macchinari traslazionali attraverso diversi meccanismi12,13,14. Oltre 100 mRNA di poxvirus hanno un elemento di azione CISevolutivamente conservato nella regione 5'-non tradotta (5'-UTR): un 5'-poli (a) leader alle 5' estremità di questi mRNAs15,16. Le lunghezze di questi 5' poli (A) leader sono eterogenei e sono generati dallo slittamento della polimerasi RNA codificata da Poxvirus durante la trascrizione17,18. Noi, e altri, recentemente abbiamo scoperto che il 5' poli (a) leader conferisce un vantaggio di traduzione a un mRNA in cellule infettate con virus vaccinia (VACV), il prototipo membro di poxvirus19,20.

Il saggio reporter luciferasi basato su RNA trascritto in vitro è stato inizialmente sviluppato per comprendere il ruolo del leader 5' poli (a) nella traduzione di mRNA durante l'infezione da Poxvirus19,21. Anche se i saggi del reporter di luciferasi basati sul DNA plasmide sono stati ampiamente utilizzati, ci sono diversi inconvenienti che complicheranno l'interpretazione dei risultati nelle cellule infettate da Poxvirus. In primo luogo, i plasmidi sono in grado di replicare in cellule infettate da VACV22. In secondo luogo, la trascrizione criptica si verifica spesso da plasmide DNA18,23,24. In terzo luogo, la trascrizione basata sul promotore VACV genera poli (A)-leader di lunghezze eterogenee, rendendo quindi difficile controllare la lunghezza del leader Poly (A) in alcuni esperimenti18. Un saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritta in vitro aggira questi problemi e l'interpretazione dei dati è semplice.

Ci sono quattro passaggi chiave in questo metodo: (1) reazione a catena della polimerasi (PCR) per generare il modello di DNA per la trascrizione in vitro; 2) trascrizione in vitro per generare mRNA; 3) trasfezione per consegnare l'mRNA nelle cellule; e (4) rilevazione dell'attività di luciferasi come indicatore della traduzione (Figura 1). Il risultante amplicon PCR contiene i seguenti elementi in 5' a 3' direzione: T7-promoter, poli (A) leader o desiderato 5'-UTR sequenza, lucciola luciferasi aperta cornice di lettura (ORF) seguita da una Poly (A) coda. La PCR amplicon è utilizzata come modello per sintetizzare mRNA mediante trascrizione in vitro utilizzando la T7 polimerasi. Durante la trascrizione in vitro, m7G CAP o altro tappo analogico è incorporato in mRNA recentemente sintetizzato. Le trascrizioni limitate vengono trasfusate in cellule non infette o infette da VACV. Il lisato cellulare viene raccolto al momento desiderato dopo la trasfezione per misurare le attività di luciferasi che indicano la produzione di proteine da mRNA trasfected. Questo saggio reporter può essere utilizzato per studiare il regolamento di traduzione da CIS-element presente in 5'-UTR, 3'-UTR o altre regioni di un mRNA. Inoltre, il saggio in vitro trascritto a base di RNA può essere utilizzato per studiare diversi meccanismi di iniziazione alla traduzione, tra cui l'iniziazione dipendente dalla PAC, l'iniziazione indipendente dal tappo, la riiniziazione e l'iniziazione interna come IRES.

Protocollo

1. preparazione del DNA template per PCR per trascrizione in vitro

  1. Per preparare il modello di DNA da PCR, primer di progettazione. Quando si progetta primer considerare caratteristiche cruciali come lunghezza del primer, temperatura di ricottura (Tm), contenuto di GC, 3' fine con G o C ecc.
    Nota: Discusso in dettaglio in questa letteratura25,26,27.
  2. I primer di progettazione per generare la PCR amplicon contenente i seguenti elementi in 5' a 3' direzione: T7-promoter, poli (A) leader, lucciola luciferasi ORF e una coda Poly (A) di cui qui di seguito come T7_12A-Fluc. Primer di progettazione (avanti e indietro) per includere tutti gli elementi aggiuntivi non presenti nel DNA del modello (Figura 2a).
    Nota: La sequenza di tutti gli elementi è reperibile nella tabella 1.
  3. Includere diversi nucleotidi in avanti primer (5'-3')28, seguita da T7-promoter, poli (A) leader o desiderato 5'-UTR sequenza e circa 20 nucleotidi, regolare sulla base di Tm, corrispondente alla 5' fine del gene reporter Orf. Assicurarsi che la regione corrispondente nel primer sia identica alla ciocca di senso (+ filamento) del gene.
    Nota: Per Long 5'-UTR, sintetizzare due frammenti di DNA: uno con il promotore T7 seguito da Long 5'-UTR e secondo con ORF del gene reporter. Unire questi due frammenti utilizzando l'estensione di sovrapposizione PCR29.
  4. Progettare Reverse Primer (5'-3') per includere poli (A) coda e circa 20 nucleotidi, regolare sulla base di Tm, corrispondente alla 3' fine dell'ORF del gene reporter. Assicurarsi che la regione corrispondente nel primer è identica al filo anti-senso (-Strand) del gene e un codone di arresto in-frame è presente prima della coda Poly (A).
    Nota: La lunghezza desiderata di a in un leader Poly (A) o Poly (A) coda può essere personalizzato nei primer. Ad esempio, per aggiungere 50 a nella coda Poly (A), il primer inverso dovrebbe comportare 50 T. Analogamente, per aggiungere 20 a nel leader Poly (A), il primer in avanti dovrebbe comportare 20 A.
  5. Per il controllo interno, progettare un altro set di primer contenenti i seguenti elementi in 5' a 3' direzione: T7 promoter, una sequenza di codifica casuale 5'-UTR contenente la sequenza di Kozak, Renilla luciferasi ORF e Poly (a) coda di cui qui di seguito come T7_ Kozak-Rluc.
  6. In un tubo PCR, aggiungere i reagenti nel seguente ordine: acqua libera DNase, 2x polimerasi di DNA ad alta fedeltà, primer e DNA modello luciferasi confermata dalla sequenza (tabella 2).
    Nota: Le quantità di singoli componenti nella miscela devono essere regolate in base al volume di reazione.
  7. Utilizzare un ciclo di PCR standard a 3 fasi (denaturazione, ricottura, estensione) per generare un modello di DNA come mostrato nella tabella 3.
    Nota: La temperatura di ricottura X ° c dipende dal set di primer utilizzato e il tempo di estensione T min dipende dalla dimensione della PCR amplicon e dalla DNA polimerasi utilizzata.
  8. Rilevare il prodotto PCR eseguendo 5-10% di reazione PCR in 1% di elettroforesi di gel di agarosio tris-acetato-EDTA (TAE) (contenente 0,1 μg/ml di etidium bromuro) insieme allo standard di peso molecolare disponibile in commercio. Visualizzare il gel sotto un illuminatore UV per determinare le dimensioni del prodotto PCR.
  9. Dopo aver determinato la dimensione corretta del prodotto PCR, ~ 1,7 KB per T7_12A-Fluc e ~ 1,0 KB per T7_Kozak-Rluc, purificarlo utilizzando un kit di purificazione PCR disponibile in commercio. Elute il DNA utilizzando 100 μL di acqua libera nucleasi (Figura 2B).
  10. Una volta purificata, controllare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro e determinare il A260/A280 rapporto (~ 1.8-2.0 è accettabile).
  11. Conservare il DNA purificato a-20 ° c o utilizzare immediatamente la trascrizione in vitro.

2. generare mRNA mediante trascrizione in vitro

  1. Sintetizzare RNA dal prodotto PCR in vitro, utilizzando un kit di trascrizione in vitro (Figura 3A).
    Nota:     i modelli di DNA T7_12A-Fluc e T7_Kozak-rluc sono utilizzati per sintetizzare mRNA 12A-Fluc e Kozak-rluc, rispettivamente.
    1. Per fare questo, prendere un tubo di microcentrifuga e aggiungere i reagenti nel seguente ordine: acqua libera DNase-RNasi, NTP buffer mix, tappo analogico, modello PCR prodotto, T7-RNA polimerasi mix (tabella 4).
      Nota: Altri sistemi di tappatura possono essere utilizzati anche per limitare l'RNA in sequenza dopo la trascrizione in vitro seguendo le istruzioni del fabbricante.
    2. Mescolare accuratamente e incubare a 37 ° c per 2 h.
    3. Procedere alla purificazione dell'RNA sintetizzato utilizzando un kit di purificazione dell'RNA.
  2. Eseguire RNA purificato in 1,5% gel di agarosio Tris-Borato-EDTA (TBE) (contenente 0,5 μg/mL di etidium bromuro) per controllare l'RNA. Visualizzare il gel sotto un illuminatore UV (Figura 3B).
  3. Controllare la concentrazione dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro e determinare il rapporto A260/A280 (~ 1.8-2.0 è accettabile).
  4. Aliquota dell'RNA purificato e conservare a-80 ° c.

3. transfect mRNA alle cellule

  1. Le cellule di seme di HeLa in una piastra 24-Well (per essere circa ~ 80-90% Confluent giorno successivo) e incubare durante la notte in un incubatore a 37 ° c con 5% CO2.
  2. Infettare le cellule di HeLa con il virus vaccinia (VACV) a una molteplicità di infezione (MOI) di 5 o mantenere le cellule HeLa non infettate per il confronto.
    Nota: MOI è il numero di particelle virali infettive per cellula.
  3. MOI di X = {[(numero di celle * X)/virus Titer] * 1000} μl di virus per mezzo di 1 mL.
  4. Dopo l'infezione h post desiderata (HPI) (in questo esperimento a 10-12 HPI), trasfezione mRNA (500 ng di mRNA totale per pozzo di piastre 24 pozzetti) utilizzando un reagente cationico di trasfezione del lipido come mostrato nella Figura 3C.
    1. Per un pozzo di una piastra 24-Well, mescolare 480 NG di 12A sequenza cuscinetto Firefly luciferasi (12A-Fluc) mRNA e 20 ng di Kozak sequenza cuscinetto Renilla luciferasi (Kozak-Rluc) mRNA in un tubo di microcentrifuga. In un'altra provetta per microcentrifuga aggiungere 1,1 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica.
    2. Aggiungere 55 μL di mezzo sierico ridotto in entrambi i tubi. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Dopo 5 minuti di incubazione, aggiungere 55 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica contenente un mezzo sierico ridotto nel tubo contenente mRNA.
    4. Mescolare delicatamente ma accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    5. Durante l'incubazione, rimuovere il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 400 μL di mezzo sierico ridotto per pozzetto di piastre da 24 pozzetti.
    6. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 μL di miscela a goccia e uniformemente a un pozzo di piastre da 24 pozzetti.

4. misura le attività di luciferase

  1. Cinque ore dopo la co-trasfezione di 12a-Fluc e Kozak-rluc mRNA, misurare l'attività di luciferasi utilizzando un sistema di saggio di luciferasi in grado di eseguire due saggi reporter (ad esempio, dual luciferasi reporter Kit saggio).
  2. Rimuovere il mezzo sierico ridotto e lisare le cellule aggiungendo 150 μL di tampone di lisi 1x, un componente del kit di analisi luciferasi.
  3. Dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, raccogliere il lisato scartando le cellule e trasferirla in un tubo di microcentrifuga.
  4. Centrifugare il lisato a 12.000 x g per 10 min a 4 ° c fino ai detriti delle celle a pellet.
  5. Aggiungere 30 μL di supernatante in un piatto di saggio 96 ben bianco con pareti opache con fondo solido.
  6. Misurare la doppia luminescenza utilizzando il kit di analisi luciferasi e un luminometro per lettori di piastre multimodali.
  7. Eseguire la misurazione utilizzando la funzione cinetica (su base per-well) utilizzando le impostazioni descritte nella tabella 5.
    Nota: La lettura può essere presa anche con il luminometro manuale. Aggiungere un volume uguale di lisato e substrato per Fluc in una cuvetta. Attendere 2 s e misurare per 10 s con luminometro. Dopo la misurazione Fluc, estrarre rapidamente la cuvetta dal luminometro e aggiungere un volume uguale del substrato per Rluc manualmente. Ancora una volta, attendere 2 s e misurare per 10 s utilizzando luminometro.
  8. Esporta i dati di lettura luminescenza in un formato di file desiderabile.
  9. Determinare il tasso di traduzione relativa da 12A-Fluc mRNA nelle cellule HeLa infettate e VACV dividendo il valore Fluc per controllo interno Rluc valore.
    Nota: Figura 1 complementare Mostra l'analisi passo-passo dei dati grezzi per ottenere attività Fluc relativa.

Risultati

I quattro passaggi del saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro: PCR per generare il modello di DNA per la trascrizione in vitro, la trascrizione in vitro per generare mRNA, la trasfezione di mRNA e la misurazione della luciferasi, possono essere osservate nel diagramma schematico ( Figura 1). La progettazione di primer per entrambi i modelli di DNA (Fluc e Rluc) e lo schema generale di estensione di sbalzo PCR è illustrata nello schem...

Discussione

Tutti i passaggi a quattro core sono fondamentali per il successo del saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Particolare attenzione deve essere prestata alla progettazione del primer, in particolare per la sequenza di promoter T7. T7 RNA polimerasi inizia la trascrizione dal primo G sottolineato (ggg-5'-UTR-Aug-) in T7 promoter aggiunto prima della sequenza 5'-UTR. Sebbene il sito iniziale di trascrizione (TSS) inizi dal primo G all'estremità 5', diminuendo il numero di G inferiore a tre...

Divulgazioni

Gli autori vorrebbero dichiarare nessun interesse finanziario concorrente.

Riconoscimenti

Il progetto è stato finanziato dagli istituti nazionali di sanità (AI128406 www.nih.gov) a ZY e in parte dal Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) sotto forma di Graduate Student Summer stipend alla PD.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master mixNew England BiolabsM0492High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabsS1411LAnti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplateCorning3693Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1960Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOMEGA BIO-TEKD6492PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate LuminometerPromegaGM2010Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis KitNew England BiolabsE2050SIn Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000Thermo Fisher ScientificND-2000Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Reduced serum media
Purelink RNA Mini KitThermo Fisher Scientific12183018ARNA purification kit
Vaccinia Capping SystemNew England BiolabsM2080Capping system

Riferimenti

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