探索序列空间,识别调节RNA结合蛋白的结合位点

摘要

序列特异性对基因调控至关重要。识别特定序列的调控蛋白对基因调控非常重要。为这种蛋白质定义功能结合位点是一个具有挑战性的生物学问题。此处描述了一种用于识别RNA结合蛋白结合位点的迭代方法,适用于所有RNA结合蛋白。

摘要

基因调节在所有细胞中起着重要的作用。转录、转录后(或RNA处理)、翻译和翻译后步骤用于调节特定基因。序列特异性核酸结合蛋白针对特定序列来控制空间或时间基因表达。核酸中的结合位点通常以突变分析为特征。然而,许多感兴趣的蛋白质没有已知的结合位点进行这种表征。在这里,我们描述了一种识别RNA结合蛋白以前未知的结合位点的方法。它涉及从随机序列池开始的序列的迭代选择和放大。经过几轮这些步骤的转录、绑定和扩增,富集序列被序列为识别首选的绑定位点。使用体外结合测定法对这种方法的成功进行监测。随后,体外和体内功能测定可用于评估所选序列的生物相关性。这种方法允许识别和表征任何RNA结合蛋白的先前未知的结合位点,而该蛋白存在分离蛋白质结合和未结合RNA的测定。

引言

在细胞生物学中,基因调控起着核心作用。在基因表达途径的一个或多个步骤中,基因具有被调节的潜力。这些步骤包括转录(启动、伸长和终止)以及拼接、多化或3'端形成、RNA导出、mRNA翻译和初级转录的衰变/定位。在这些步骤中,核酸结合蛋白调节基因调控。识别这种蛋白质的结合位点是研究基因控制的一个重要方面。突变分析和遗传序列比较已用于发现核酸中的调控序列或蛋白质结合位点,如启动子、拼接位点、聚化元素和转化信号^1。2,3,4.

前mRNA拼接是基因表达和调控过程中不可或缺的一步。大多数哺乳动物的基因,包括人类的基因,都有内源基因。这些转录本的很大一部分是交替拼接的,从同一基因或主转录本产生多个mRNA和蛋白质异构体。这些等体在细胞生物学中具有细胞特异性和发育作用。5' 拼接位点、分支点和聚苯乙烯-3'拼接位点是受监管的关键拼接信号。在负调节中,否则强接头位被抑制,而在正调节中,否则弱拼接位点被激活。这些事件的组合会产生大量功能上不同的异形。RNA结合蛋白在这些替代拼接事件中起关键作用。

许多蛋白质是已知的,其结合位点或RNA靶点仍有待确定5,6。将调节蛋白与其下游生物靶点或序列联系起来通常是一个复杂的过程。对于此类蛋白质,识别其靶向RNA或结合位点是确定其生物功能的重要一步。一旦确定结合位点,可以使用标准的分子和生化分析进一步描述它。

此处描述的方法有两个优点。首先,它可以识别一个以前未知的结合位点,用于感兴趣的蛋白质。其次,这种方法的一个附加优势是,它同时允许饱和突变,否则,为了获得绑定站点中序列要求的可比信息,这将会是劳动密集型的。因此,它提供了一个更快,更容易,成本更低的工具,以确定RNA中的蛋白质结合位点。最初,这种方法(SELEX或通过易解体扩能对利坦的系统性进化)用于表征噬菌体T4DNA聚合酶(基因43蛋白)的结合位点,该结合位点与核糖体结合位点在其自己的mRNA中重叠。绑定站点包含一个 8 基循环序列,表示用于分析⁷的 65,536 个随机变体。其次,该方法还被独立用于表明,可以从大约10^个13个^序列8的池中选择不同染料的特定结合位点或贴合剂。事实上,这种方法已经在许多不同的环境中广泛使用,用于识别用于结合许多配体(如蛋白质、小分子和细胞)的贴合剂(RNA或DNA序列),以及催化9。例如,一个贴皮剂可以区分两种黄烷衍生物,咖啡因和茶碱,它们因^咖啡因10中一个甲基组的存在而不同。我们广泛使用这种方法(SELEX或迭代选择-放大)来研究RNA结合蛋白在拼接或拼接^调节11中的作用,这将是下面讨论的基础。

随机库:我们使用31个核苷酸的随机库。随机库的长度考虑松散地基于一种理念,即一般拼接因子 U2AF⁶⁵绑定到分支点序列和 3' 拼接站点之间的序列。平均而言,元群中这些拼接信号之间的间距在20至40个核苷酸范围内。另一种蛋白质性致命已知结合一个不良特征的调节序列附近的3'拼接位,其目标前mRNA,变压器。因此,我们选择了31个核苷酸的随机区域,两侧是具有限制性酶位点的引物结合位点,以允许PCR扩增和附件T7RNA聚合酶启动子进行体外转录。理论库大小或复杂性为4³¹或约1018。我们使用这个库的一小部分来准备我们的随机RNA池(#10 12-10¹⁵⁾用于下面描述的实验。

研究方案

注:图1概述了迭代选择-放大(SELEX)过程中的关键步骤。

1. 生成随机库模板

1. 合成前引物5'- GTAATACGACTACTATAGGGTGATCAATATCCA-3'和反向引物5'- GCGACGGATCCAGCTT CA-3',通过在DNA合成器上的化学合成。
   注:引信和随机库可以进行商业合成。
2. 合成随机库寡核苷酸模板 5'- GGTAtATATCTAtCTCTCTCTCTCTCTCTCCA(N₁...N₃₁)通过化学合成,TGAAGCTATGCGC-3'。在合成过程中,对上述31个随机位置(如N)使用四磷酰胺的模样混合物。
   注: 库模板序列包含 31 个随机核苷酸(N1 到 N31)和侧翼序列,用于向前和反向引基进行结合。前进引物包括用于体外转录的T7 RNA聚合酶启动子序列(下划线)和用于克隆的限制性位点Bcl1(斜体)。反向引物含有限制性酶位点BamH1和HindIII(斜体),以促进克隆。

2. DNA随机库池的生成

1. 通过聚合酶链反应 (PCR) 将 T7 RNA 聚合酶启动子连接到库中,其中包含 1 μM DNA 随机库模板、每个引物 1 μM、20 mM Tris(pH8.0)、1.5 mM MgCl 2、50 mM KCl、0.1 μg/μL 乙酸牛血清白蛋白、2 单位Taq_/c1+ 聚合酶和 200 μM dNTP(脱氧腺苷、脱氧腺苷、脱氧血氨酸和三磷酸氧氧乙酰胺)。
2. 使用五个周期的变性、退火和延长步骤(94 °C 1 分钟,53°C 1 分钟,72 °C 1 分钟),然后是一个延长周期(72 °C 10 分钟)。

3. 池 0 RNA 的合成

1. 设置100μL转录反应12。混合T7转录缓冲液,1 μM随机库池DNA,5 mM二硫磷酸醇(DTT),2 mM三磷酸二磷酸(GTP),1 mM每个三磷酸腺苷(ATP),三磷酸三磷酸球苷(CTP)和尿氨酸三磷酸(UTP),以及2个单位/μL T7RNA聚合酶。
   注:RNA可在体外转录,使用市售试剂盒,可选有T7或SP6 RNA聚合酶。
2. 在37°C下在微离心管中孵育上述反应混合物2小时。
3. 凝胶在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中纯化RNA。
4. 通过在转录反应中包括放射性痕迹(0.5 μL 或更少的β-32 P UTP),用亚甲蓝色或自径成像染色,确定凝胶上转录本的位置。
   1. 将凝胶片放入离心管中,然后切成小块,例如,用同质器尖端。添加蛋白酶 K (PK) 缓冲液 (100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 12.5 mM EDTA, 1% 硫酸钠) 浸入凝胶片中。在室温下,将管子放在螺母上2小时至过夜。
5. 在高速微离心机(14,000 rpm 或 16,873 x g)中旋转 5 分钟,在室温下清除凝胶碎屑并回收缓冲液。
6. 用同等体积的苯酚氯仿和一次氯仿涡状样品两次。
7. 将以上水相与十分之一体积的醋酸钠(3.0 M,pH 5.2)、10 μg tRNA 或 20 μg 糖原和乙醇(2~3卷,储存在-20°C) 混合。将管保持至 -80°C 1 小时。
8. 在微离心机(14,000 rpm 或 16,873 x g) 中,在 4°C 下旋转含有溶液的管 5-10 分钟。小心丢弃上清液。用70%乙醇冲洗RNA颗粒,旋转2~5分钟。空气干燥RNA颗粒。
9. 在用二乙酰热盐(DEPC)处理的50μL水中溶解RNA颗粒。将样品留在-20°C存放。
   注:使用市售的旋转柱净化RNA,目前这些旋转柱更常用去除未结合的放射性,并作为RNA纯化的快速和更方便的替代品。
   注意:使用丙烯酸玻璃护罩、手套和其他预防措施,以防止放射性。

4. 蛋白质结合反应和结合RNA的分离

1. 在10mM Tris-HCl中进行蛋白质和RNA结合,pH 7.5体积为100μL,向这些最终浓度中加入以下成分:50 mM KCl,1 mM DTT,0.09 μg/μL牛血清白蛋白,0.5单位/μL RNasin,0.15 μg/μL tRNA,1 mM EDTA 和 30 μL 的适当重组蛋白 (PTB) 浓度。从适当的池中添加RNA。
   注: 拼接因子 U2AF⁶⁵通常绑定到模型内子的聚苯乙烯-tract/3' 拼接位点,其结合亲和力(平衡解离常数或K_d)约为 1–10 nM。因此,前两轮结合使用的蛋白质浓度比K _d为U2AF65高10倍;对于SXL和PTB蛋白,这个范围内的起始浓度只是我们最好的猜测。这确保了所需的RNA物种可以结合,虽然较低的亲和序列也有可能结合。在第3轮和第4轮(转录、结合和扩增)中,蛋白质浓度降低了三倍(步骤4.1)。这样做是为了连续消除低亲和力RNA物种。
2. 将含有结合反应的管子在25°C下置于温度块(或冰上)约30分钟。
3. 使用以下步骤,在前 4 轮选择扩增中,从未结合的 RNA 中对结合RNA 进行分馏。
   1. 在室温下通过连接到真空歧管的硝化纤维素过滤器过滤样品(100 μL)。
      注:RNA-蛋白复合物(但不是未结合的RNA)仍留在过滤器上。
   2. 用无菌剃刀刀片将带有保留的RNA的过滤器切成碎片;将它们插入离心管中。将过滤器片段浸入蛋白酶 K (PK) 缓冲液中,轻轻翻滚管至少 3 小时(或过夜),以恢复 RNA。
   3. 在苯酚氯仿(1:1)和氯仿等体积下涡旋RNA样品,使其脱蛋白。每次通过在室温下高速离心样品5分钟来恢复水相。
   4. 与醋酸钠(0.1体积3.0 M,pH 5.2)和乙醇(2~3卷绝对乙醇,200证明)混合。将管子放入-80°C冷冻室30分钟,高速离心10分钟,然后按照洗涤和干燥步骤(步骤3.8),在DEPC处理的水中溶解RNA。这些步骤概述在上面(步骤 3.6 到 3.9)。
4. 将蛋白质结合的RNA分数从最近2轮(第5轮和第6轮;转录、结合和扩增)的未结合分数中分离出来,如下所示。将结合反应(步骤 4.1)中的蛋白质浓度进一步降低三倍,以增加选择压力,以丰富高亲和力结合序列并优先去除低亲和力序列。
   1. 在设置上述RNA:蛋白结合(步骤4.1)反应之前,在0.5xTBE缓冲液(Tris-Borate-EDTA)中预铸原生聚丙烯酰胺凝胶(5%,60:1丙烯酰胺:乙酰胺比)。在冷室(4°C)中电液,应用250 V15分钟。
   2. 将上述RNA:蛋白结合反应(步骤4.1)移入该凝胶的不同井中。
      注:该蛋白质储存在-80°C,在使用前稀释在20mM 4-(2-Hydroxyhyl)管电-1-乙酸乙酸(HEPES),pH 8.0,20%甘油,0.2m二甲二甲酸酯酸(EDTA),0.05%NP-40和1mM二硫乙醇(Dthiothiitol)。添加 0.5~1.0 mM 蛋白酶抑制剂苯基甲烷硫酸盐 (PMSF) 是可选的。在结合反应中,该缓冲液可贡献约6%的甘油,允许将样品直接装载到井中,而无需将其与单独的凝胶加载缓冲液混合。
   3. 在250 V的冷室(4°C)使用凝胶电泳从未结合的RNA中分馏结合RNA,1至2小时。这个过程也被称为凝胶移动转移测定。
      注:电泳的持续时间因RNA和用于结合的蛋白质的特性而异。
   4. 将凝胶暴露在X射线膜中,并使用自辐射法识别结合RNA的位置。用结合的RNA切出凝胶片,并将其插入管中。
   5. 在PK缓冲液中孵育粉碎的凝胶切片,用于洗脱3小时或过夜。
   6. 重复上述步骤 3.5 至 3.9。简单地说,涡旋洗脱的RNA样品首先用苯酚氯仿,然后用氯仿。
   7. 氯仿提取后,将醋酸钠和乙醇与水相混合。在-80°C冷冻箱中孵育后,在4°C下旋转5-10分钟,收集RNA颗粒。用乙醇清洗RNA颗粒,通过打开管盖将其晾干。将RNA溶解在用DEPC处理的水中。
      注: 切换到凝胶流动性转移分析进行分馏,可以消除可能富集用于结合的不需要的RNA物种,例如,此处与基硝基纤维素过滤器(或任何基质)用于分馏的初始轮数。

5. 逆转录和PCR扩增

1. 使用逆转录酶和反向引基从溶解RNA合成cDNA,在42°C下孵育20μL反应(2μL的10xRT缓冲液,2μL的AMV逆转录酶,1μM反向引基,10μL的RNA,可选的RN酶抑制剂)在42°C下孵育60分钟。
2. 如步骤 2.1 所述,使用 20-25 PCR 周期放大 cDNA。

6. 转录和蛋白质结合

1. 重复RNA合成、蛋白质结合、蛋白质结合分离和未结合分数的分离过程,如上文第3~5节所述。

7. RNA-蛋白质相互作用分析

1. 使用凝胶移动移位测定(步骤 4.4)或过滤器结合测定(步骤 4.3)来确定选定池或每个池内单个序列的绑定相关性和特异性(参见步骤 8.3)。
2. 使用自辐射成像或荧光粉成像仪检测和量化结合分数和未绑定分数中的波段。

8. 克隆和测序

1. 用限制性酶Bcl1和HindIII消化最终PCRDNA产物1⁄2小时,用适当消化的pGEM3或其他带限制部位的质粒从2小时到一夜之间,将结扎产物转化为合格的细菌细胞通过热冲击或电穿孔使用标准分子生物学^程序13。
2. 在37°C下用Luria-Bertani(LB)介质和阿霉素(50微克/mL)在琼层藻板上电镀转化的细胞,一夜之间滋生细菌。挑选菌落,为含有LB液体介质的培养管接种,并生长在37°C的摇动培养箱过夜。使用标准质粒分离^方案13纯化含有DNA插入物的质粒DNA。
   注:商用试剂盒可用于质粒纯化。
3. 按照制造商的测序^说明14,使用DNA插入物对质粒进行测序。
   注:测序可以在内部执行,也可以进行商业化。

9. 序列对齐

1. 使用可用的在线对齐工具对齐序列并获得共识绑定站点
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)。

结果

以下观察结果表明选择放大(SELEX)是成功的。首先,我们分析了池0和选定的序列,以便与用于迭代选择-扩增方法的蛋白质结合。图2显示,哺乳动物聚丙胺-结合蛋白(PTB)几乎不能检测到结合到池0序列,但与所选序列池的亲和力较高。当我们使用比所选池相比,蛋白质浓度高出约 300 倍时,几乎无法检测到对池 0 的结合。因此,随机池或起始池与所选池之间的蛋?...

讨论

核酸结合蛋白是动植物发育的重要调节剂。SELEX 程序的一个关键要求是开发可用于分离蛋白质结合和未结合的 RNA 馏分的测定。原则上,此测定可以是体外结合测定,如滤芯结合测定、凝胶移动转移测定或重组蛋白、纯化蛋白或蛋白质复合物的基质结合^测定19。测定也可以是酶测定,其中前体和产品(或中间体)可以根据大小或其他某种方式^分离20。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard