סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Summary

הספציפיות לרצף היא קריטית. לתקנות הגנים חלבונים רגולטוריות המכירים רצפים ספציפיים חשובים עבור רגולציה גנטית. הגדרת אתרי קשירה פונקציונליים עבור חלבונים כאלה היא בעיה ביולוגית מאתגרת. גישה איטראטיבית לזיהוי של אתר מחייב עבור חלבון של איגוד RNA מתוארת כאן וישימה לכל החלבונים מבוססי RNA.

Abstract

רגולציה של ג'ין ממלאת תפקיד חשוב בכל התאים. ההמרה, לאחר ההמרה (או עיבוד RNA), הטרנסלtional והשלבים שלאחר ההעברה משמשים לוויסות גנים ספציפיים. ספציפי לרצף חומצות גרעין-מחייב חלבונים היעד רצפים ספציפיים לשלוט ביטוי גנים מרחביים או זמני. אתרי הכריכה בחומצות גרעין מאופיינים בדרך כלל בניתוחי מבצעים. עם זאת, לחלבונים רבים של עניין אין אתר מחייב ידוע לאפיון כזה. כאן אנו מתארים גישה כדי לזהות אתרי איגוד לא ידועים בעבר עבור חלבונים כריכת RNA. היא כוללת בחירה איטרטיבית והגברה של רצפים החל במאגר רצף אקראי. בעקבות מספר סיבובים של צעדים אלה-תמלול, כריכה והגברה-הרצפים המועשרת מנצנצים כדי לזהות אתרי איגוד מועדפים. הצלחה בגישה זו מפוקחת על ידי שימוש באיגוד מתורבת. לאחר מכן, בתוך מבחנה ובvivo פונקציונלי ניתן להשתמש כדי להעריך את הרלוונטיות הביולוגית של הרצפים שנבחרו. גישה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של אתר מחייב שאינו ידוע בעבר עבור כל חלבון של איגוד RNA שעבורו קיים שיטה להפריד בין מאוגד לחלבון וללא מאוגד.

Introduction

בביולוגיה של התאים, רגולציה. גנטית ממלאת תפקיד מרכזי באחד או מספר שלבים לאורך מסלול ביטוי הגן, גנים יש את הפוטנציאל להיות מוסדר. שלבים אלה כוללים תמלול (ייזום, התארכות וסיום), כמו גם שחבור, פוליאדלציה או 3 ' היווצרות בסוף, RNA ייצוא, התרגום mRNA, ו ריקבון/לוקליזציה של תעתיקים העיקרי. בשלבים אלה, חומצות גרעין מחייב חלבונים לווסת את רגולציה גנים. זיהוי של אתרי איגוד עבור חלבונים כאלה הוא היבט חשוב של לימוד בקרת גנים. ניתוח מועד והשוואת הרצף פילוגנטי שימשו כדי לגלות רצפי רגולציה או מחייב חלבונים אתרים בחומצות גרעין, כגון היזמים, אחוי אתרים, מרכיבים פוליאדלציה, ואותות טרנסלtional^1, מיכל השני ^, מיכל שלוש ^{, ד}.

שחבור טרום-mRNA הוא צעד אינטגרלי במהלך ביטוי גנים ורגולציה. רוב הגנים המיונקים, כולל אלה בבני האדם, יש היפוגנים. חלק גדול של התעתיקים האלה הוא לחילופין משולב, הפקת מספר mrna ו איזופורמים חלבון מאותו גן או תעתיק ראשוני. איזוטפסים אלה הם בעלי תפקידים ספציפיים לתאים והתפתחותיים בביולוגיה של התא. האתר של 5 ' אחוי, נקודת ההסתעפות, והאתר הנמצא במערכת העיכול/3, מהווה אותות קריטיים הכפופים לרגולציה. בתקנה שלילית, האתר החזק ביותר במקום הוא מודחק, ואילו בתקנה חיובית האתר מופעל בצורה אחרת. שילוב של אירועים אלה מייצר שפע של איזוטפסים ברורים מבחינה פונקציונלית. כריכת ה-RNA חלבונים לשחק תפקידים מרכזיים אלה שחבור האירועים החלופיים.

חלבונים רבים ידועים כאשר האתרים המחייבים (s) או יעדי RNA נשארים להיות מזוהים^5,6. קישור חלבונים רגולטוריות למטרות ביולוגיות שלהם במטה או רצפים הוא לעתים קרובות תהליך מורכב. עבור חלבונים כאלה, זיהוי של היעד שלהם RNA או מחייב אתר הוא צעד חשוב בהגדרת פונקציות ביולוגיות שלהם. לאחר מזוהה אתר מחייב, זה יכול להיות מאופיין עוד באמצעות ניתוחים מולקולריים סטנדרטיים ביוכימיים.

לגישה המתוארת כאן יש שני יתרונות. ראשית, הוא יכול לזהות אתר מחייב לא ידוע בעבר עבור חלבון של עניין. שנית, יתרון נוסף של גישה זו הוא שהוא מאפשר בו זמנית מוטזיס רוויה, שאחרת תהיה עבודה אינטנסיבית להשגת מידע דומה על דרישות הרצף בתוך אתר האיגוד. כך, הוא מציע כלי מהיר, קל יותר, פחות יקר לזהות אתרי כריכת חלבון ב-RNA. במקור, גישה זו (SELEX או האבולוציה שיטתית של ליגנדס על ידי העשרה מעריכית) שימש כדי לאפיין את האתר מחייב עבור בקטיוגה T4 DNA פולימראז (הגן 43 חלבון), אשר חופף עם האתר המחייב הריבוכמה ב-mRNA שלה. אתר הכריכה מכיל רצף לולאה של 8 בסיסים, המייצג 65,536 גרסאות אקראיים לניתוח⁷. שנית, הגישה השתמשה גם באופן עצמאי כדי להראות כי אתרים מסוימים מחייב או aptamers עבור צבעים שונים ניתן לבחור מתוך בריכה של כ 10¹³ רצפים⁸. למעשה, גישה זו היתה בשימוש נרחב בהקשרים שונים רבים כדי לזהות aptamers (RNA או רצפי DNA) עבור כריכת ליגנדס רבים, כגון חלבונים, מולקולות קטנות, תאים, ועבור מזרז⁹. כדוגמה, aptamer אלף יכול להפלות בין שתי הנגזרות האלה, קפאין ו-הפסלין, אשר שונים על ידי נוכחות של קבוצת מתיל אחד בקפאין¹⁰. השתמשנו בהרחבה בגישה זו (SELEX או הגברה בחירה איטראטיבית) כדי ללמוד כיצד להשתמש בחלבונים מבוססי RNA הפועלים באמצעות שחבור או בתקנה¹¹, אשר יהיה הבסיס לדיון להלן.

הספרייה האקראית: השתמשנו בספריה אקראית של 31 נוקלאוטידים. השיקול האורך עבור הספרייה האקראית היה מבוסס באופן רופף על הרעיון כי הU2AF הכללית גורם השחבור⁶⁵ נקשר לרצף בין רצף נקודת ההסתעפות לבין 3 ' אחוי האתר. בממוצע, המרווח בין האותות האלה במטזואים הוא בטווח של 20 עד 40 נוקלאוטידים. חלבון אחר סקס-קטלני היה ידוע לאגד רצף הרגולציה מאופיין גרוע ליד 3 ' אחוי האתר של היעד שלה pre-mRNA, שנאי. כך, בחרנו אזור אקראי של 31 נוקלאוטידים, מוקף באתרי כריכה פריימר עם אתרי אנזים הגבלה כדי לאפשר הגברה PCR והחזקה של היזם T7 RNA פולימראז עבור שעתוק מבחנה. גודל הספרייה התיאורטית או המורכבות היה 4³¹ או כ-10¹⁸. השתמשנו בחלק קטן של הספרייה הזאת כדי להכין את בריכת ה-RNA האקראית שלנו (~ 10-¹²-10¹⁵) עבור הניסויים המתוארים להלן.

Protocol

הערה: איור 1 מספק סיכום של שלבי מפתח בתהליך הגברה בחירה איטראטיבי (selex).

1. יצירת תבנית ספריה אקראית

1. לסנתז את פריימר קדימה 5 '- Gtaאטקגנולג ' טtgatcaGATTCTGATCCA-3 ' ואת פריימר הפוכה 5 '-GCGACGgatccaagcttca-3 ' על ידי סינתזה כימית על סינתיסייזר DNA.
   הערה: התחל והספרייה האקראית יכולות להיות מעוצבות באופן מסחרי.
2. סינתזה של ספריה אקראית לאחר התבנית 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N₁... N₃₁) מוצרים לפי סינתזה כימית. השתמש תערובת שווה של ארבעה זרחעות במהלך סינתזה עבור 31 מיקומים אקראיים המוצגת לעיל כ N.
   הערה: הרצף של תבנית הספריה מכיל 31 נוקלאוטידים אקראיים (N1 to N31) ורצפים מאגפים עבור איגוד התחל הקדמי והאחורי. התחל הקדמי כולל את הרצף T7 RNA פולימראז (מסומן בקו תחתון) עבור תמלול והגבלה באתר Bcl1 (נטוי) עבור שיבוט. ההילוך ההפוך מכיל אתרי אנזים הגבלה BamH1 ו hindiii (נטוי) כדי להקל על השיבוט.

2. הדור של בריכת הספרייה האקראית DNA

1. לצרף את T7 RNA פולימראז היזם לספרייה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) המכיל 1 μM DNA תבנית ספרייה אקראית, 1 μM של כל פריימר, 20 מ"מ טריס (pH 8.0), 1.5 mM MgCl₂, 50 Mm-kcl, 0.1 μg/μl acetylated, 2 יחידות של taq < /c1 > פולימראז, ו-200 μM כל אחד dNTPs (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deאוקסיציטוטידין, ו deoxyadenosine triphosphate).
2. השתמש בחמישה מחזורים של דנטורציה, ריפוי ושלבי הרחבה (94 ° c עבור 1 דקות, 53 ° c במשך 1 דקות, ו-72 ° c עבור 1 דקות) של ה-PCR ואחריו מחזור אחד של הארכה (72 ° c עבור 10 דקות).

3. סינתזה של בריכה 0 RNA

1. הגדרת תגובת תמלול של 100 μL¹². לערבב T7 מאגר תמלול, 1 μm ספרייה אקראית בריכה DNA, 5 מ"מ dithiotiol (dtt), 2 מ"מ guanosine טריפוספט (gtp), 1 מ"מ כל אחד אדנוזין טריפוספט (ATP), cytidine טריפוספט (ctp), ו uridine טריפוספט (utp), ו 2 יחידות/μl T7 RNA פולימו.
   הערה: ניתן להשתמש ב-RNA בציוד מסחרי באמצעות ערכות מסחריות הזמינות עם אפשרות של T7 או SP6 RNA.
2. מודטה את תערובת התגובה לעיל בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 h ב 37 ° c.
3. ג'ל לטהר את ה-RNA ב -10% מתוך ג'ל פוליאקרילמיד.
4. לזהות את המיקום של התעתיקים על ג'ל ידי צביעת אותו עם מתילן כחול או אוטומטי על ידי כולל עקבות של רדיואקטיביות (0.5 μL או פחות של α-³²P utp) בתגובת תמלול.
   1. הניחו את פרוסת הג בצינור הצנטריפוגה והתפרסו לחתיכות קטנות יותר, לדוגמה, בעזרת טיפ הומוגניצר. הוסף מאגר פרוטטינואז K (PK) (100 mM טריס, pH 7.5, 150 mM הנאל, 12.5 mM EDTA, 1% נתרן dodecyl סולפט) כדי לטבול את חתיכות ג'ל. השאירו את השפופרת על מרחק של 2 שעות עד הלילה בטמפרטורת החדר.
5. ספין בתוך מיקרוצנטריפוגה במהירות גבוהה (14,000 rpm או 16,873 x g) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את פסולת ג'ל ולשחזר את פתרון המאגר.
6. מערבולת המדגם פעמיים עם נפח שווה של פנול-כלורופורם ופעם אחת עם כלורופורם.
7. לערבב את השלב מימית מלמעלה עם כמות אחת בעשירית של סודיום אצטט (3.0 M, pH 5.2), 10 μg של tRNA או 20 μg של הגליקוגן, ו אתנול (2 – 3 כרכים, מאוחסנים ב-20 ° c). השאירו את הצינורות ב-80 ° c בשביל 1 h.
8. ספין את הצינורות המכילים את הפתרון עבור 5 – 10 דקות ב 4 ° c ב מיקרוצנטריפוגה (14,000 rpm או 16,873 x g). הסר את הסופרנטנט בזהירות. לשטוף את הגלולה RNA עם 70% אתנול וספין עבור 2 – 5 דקות.. ומכה את האתנול בזהירות האוויר יבש את הגלולה RNA.
9. מסיסות הגלולה RNA ב 50 μL של מים שטופלו באמצעות דיאתיל פירוקרבונט (DEPC). השאירו את הדגימה ב-20 ° c לאחסון.
   הערה: לטהר את ה-RNA באמצעות עמודות הספין הזמינות מסחרית, אשר משמשות כיום יותר להסרת רדיואקטיביות משולב ולשמש חלופה מהירה ונוחה יותר לטיהור RNA.
   התראה: השתמש במגן זכוכית אקרילי, בכפפות ובאמצעי זהירות אחרים להגנה מפני רדיואקטיביות.

4. התגובה של איגוד החלבונים והפרדת ה-RNA המאוגד

1. לבצע את הכריכה של חלבון רנ א ב 10 mM טריס-HCl, pH 7.5 בנפח של 100 μL על ידי הוספת המרכיבים הבאים לריכוזים סופיים אלה: 50 mM KCl, 1 מ"מ DTT, 0.09 μg/μL סרום בקון, ב0.5 יחידות/μl RNasin, 0.15 μg/μL , 1 מ"מ EDTA, ו 30 μL של רקומביננטי חלבון מתאים (PTB) ריכוז. הוסף RNA מהבריכה המתאימה.
   הערה: ה65 U2AF הגורם בדרך כלל מאגד את המערכת הבין-ממדית של מערכת העיכול/3-בדרכי הייצור של מודל introns מדגם עם זיקה מחייבת (קבוע שיווי משקל או K_d) של כ 1 – 10 ננומטר. לכן, שני סיבובים הראשונים של כריכה השתמשו בריכוז חלבון 10 מתקפל מעל K_d עבור U2AF⁶⁵; עבור חלבונים SXL ו PTB, הריכוז ההתחלתי בטווח זה היה רק הניחוש הטוב ביותר שלנו. זה מובטחת כי מינים הרצוי RNA כי יכול לאגד, למרות רצפי זיקה נמוכה גם כרוך בפוטנציאל. בסיבובים 3 ו-4 (תמלול, כריכה והגברה), ריכוז החלבון הופחת בשלושה קיפולים (שלב 4.1). הדבר נעשה כדי למנוע ברציפות מינים בעלי זיקה נמוכה של RNA.
2. מניחים את הצינורות המכילים את תגובות הכריכה כ -30 דקות ב -25 ° c בבלוק טמפרטורה (או על הקרח).
3. אנגיופלסטיקה את ה-RNA המאוגד מ-RNA הלא מאוגד עבור 4 הסיבובים הראשונים של הגברה בחירה באמצעות השלבים הבאים.
   1. לסנן את המדגם (100 μL) בטמפרטורת החדר דרך מסנן ניטרוצלולוזה מחובר סעפת ואקום.
      הערה: מתחם ה-RNA-חלבון, אך לא ה-RNA הלא מאוגד, נשאר על הפילטר.
   2. קוצצים את המסנן באמצעות RNA שנשמר לרסיסים בעזרת להב גילוח סטרילי; נכניס את זה. לצינור הצנטריפוגה לשחזר את ה-RNA על ידי הנופל בעדינות את הצינור למינימום של 3 h (או לילה) עם חתיכות מסנן שקוע ב-מאגר פרוטטינואז K (PK).
   3. Deproteinize ה-RNA לדוגמה על ידי vortexing אותו בנוכחות של נפח שווה של פנול-כלורופורם (1:1) ולאחר מכן של כלורופורם. לשחזר את השלב מימית בכל פעם על ידי תפרידו את המדגם במהירות גבוהה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. מערבבים עם סודיום אצטט (0.1 נפח של 3.0 M, pH 5.2) ו אתנול (2 – 3 כרכים של אתנול מוחלט, 200 הוכחה). להשאיר את הצינור ב-80 מקפיא ° c במשך 30 דקות, צנטריפוגה אותו במהירות גבוהה עבור 10 דקות, ו, בעקבות שטיפת כביסה וייבוש (שלב 3.8), מסיסות RNA במים שטופלו DEPC. שלבים אלה מתוארים לעיל (שלבים 3.6 עד 3.9).
4. הפרד את שברי ה-RNA המאוגדים בחלבון משברים לא מאוגדים עבור 2 הסיבובים האחרונים (סיבובים 5 ו -6; תמלול, כריכה והגברה) כדלקמן. הפחת את ריכוז החלבון בתגובת האיגוד (שלב 4.1) באמצעות שלושה מקפלים נוספים לקבלת לחץ נוסף בבחירה כדי להעשיר רצפי קשירה בעלי אהדה גבוהה ומעדיפים להסיר רצפים בעלי זיקה נמוכה.
   1. הטלת מראש מקורית פוליאקרילמיד ג'ל (5% עם 60:1 אקרילאמיד: bis-אקרילי) במאגר של 0.5 x TBE (טריס-Borate-EDTA) לפני הגדרת RNA לעיל: כריכת חלבון (שלב 4.1) התגובה. אלקטרופורז ג'ל זה בחדר קר (4 ° c) על ידי החלת 250 V במשך 15 דקות.
   2. פיפטה לעיל RNA: תגובות כריכת חלבון (צעד 4.1) לתוך בארות שונות של ג'ל זה.
      הערה: החלבון מאוחסן ב-80 ° c ומדולל לפני השימוש ב -20 מ"מ 4-(2-הידרוקסיל) פיפראזין-1-חומצה אתאנסולתית (HEPES), pH 8.0, 20% גליצרול, 0.2 מ"מ מילימטר ethilenediamגנול חומצה (EDTA), 0.05% NP-40, ו 1 מ"מ dithioitol (DTT). תוספת של 0.5 – 1.0 מעכב פרוטאז מילימטר פנילתאן פלואור (PMSF) הוא אופציונלי. בתגובת הקשירה, מאגר זה תורם כ-6% גליצרול, המאפשר העמסה ישירה של דגימות בבארות ללא צורך בערבוב של מאגר העמסה-ג'ל נפרד.
   3. אנגיופלסטיקה ה-RNA המאוגד מרנ א לא מאוגד באמצעות אלקטרופורזה בג בחדר קר (4 ° c) ב-250 V עבור 1 עד 2 שעות. תהליך זה ידוע גם בשם השינוי הניידות של ג'ל.
      הערה: משך האלקטרופורזה משתנה בהתאם לתכונות ה-RNA והחלבון המשמש לכריכה.
   4. לחשוף את ג'ל לסרט רנטגן ולזהות את המיקום של RNA מאוגד באמצעות אדיגרפיה אוטומטית. חותכים את הפרוסה ג'ל עם RNA מאוגד ולהכניס אותו לתוך צינור.
   5. מודטה את הפרוסה ג'ל מעוך במאגר PK המשמש הימנעות עבור 3 שעות או לילה.
   6. חזור על שלבים 3.5 עד 3.9 המתוארים לעיל. בקצרה, ומערבולת הדגם ה-RNA לדוגמה במרץ הראשון עם פנול-כלורופורם ולאחר מכן עם כלורופורם.
   7. לערבב אצטט נתרן אתנול עם השלב מימית לאחר הוצאת כלורופורם. בעקבות דגירה ב-80 ° c מקפיא, ספין ב 4 ° צ' עבור 5 – 10 דקות כדי לאסוף את הגלולה RNA. לשטוף את הגלולה RNA עם אתנול ואוויר יבש אותו על ידי עזיבת המכסה של הצינור פתוח. לפזר את ה-RNA במים שטופלו ב-DEPC.
      הערה: מעבר לעקידת התנועה של הג עבור שבירה מאפשר חיסול של מינים לא רצויים של RNA שייתכן שהיו מועשרים לכריכה, לדוגמה, למסנן הניטרוצלולוזה כאן (או לכל מטריצה) הנמצאת בשימוש בסיבובים הראשוניים לצורך שבירה.

5. תעתיק הפוך והגברה הPCR

1. לסנתז cDNA מן ה-RNA מומס באמצעות היפוך הטרנססקריפט ואת פריימר הפוכה על-ידי מארג התגובה 20 μL (2 μL של 10x RT מאגר, 2 μL של היפוך הפוכה AMV, 1 μM לאחור פריימר, 10 μL של RNA, RNase מעכבי אופציונלי) ב 42 ° c עבור 60 דקות
2. להגביר את cDNA באמצעות 20-25 PCR מחזורי כפי שמתואר בשלב 2.1.

6. תמלול וכריכת חלבון

1. חזור על התהליך של סינתזה RNA, כריכת חלבון, הפרדת החלבון כרוך ושבריר לא מאוגד, כמתואר בסעיף 3 – 5 לעיל.

7. ניתוח של אינטראקציות רנ א-חלבון

1. השתמש בערך התזוזה של הג (שלב 4.4) או בקביעת הכריכה (שלב 4.3) כדי לקבוע זיקה וספציפיות של איגוד עבור בריכות נבחרות או רצפים בודדים בתוך כל מאגר (ראה שלב 8.3).
2. השתמש באדיגרפיה אוטומטית או ב-פוספור צמידה כדי לזהות ולכמת להקות בשבר המאוגד ובשבר לא מאוגד.

8. השכפול והרצף

1. לעכל את המוצר הסופי של ה-DNA של PCR עם אנזימים הגבלה Bcl1 ו-hindiii עבור 1 – 2 h, פסיקים עם pGEM3 מתעכל כראוי או מ אחרים הנושאים את אתרי ההגבלה מ 2 h אל הלילה, להפוך את המוצר הקשר לתוך תאים חיידקיים המוסמכת בהלם חום או אלקטרופורציה באמצעות נהלים ביולוגיים סטנדרטיים מולקולריים¹³.
2. לגדל חיידקים לילה על ידי ציפוי התאים שעברו שינוי על צלחות אגר עם לוריא ברטני (LB) בינונית ואמפיצילין (50 μg/mL) ב 37 ° c. בחר מושבות כדי לחסן צינורות תרבות המכילים LB נוזל בינוני עם אמפיצילין ולגדול ב 37 ° c בחממה רועדת לילה. באמצעות פרוטוקול בידוד. סטנדרטי מסוג¹³
   הערה: ערכות מסחריות זמינות לטיהור פלמיד.
3. רצף את הפלמידים עם מוסיף DNA באמצעות פרוטוקול הפסקת רצפי שרשרת dideoxy, בעקבות הוראות היצרן עבור רצף¹⁴.
   הערה: ניתן לבצע רצף בבית או לעשות באופן מסחרי.

9. יישור רצף

1. יישור רצפים והשגת אתר של איגוד בקונצנזוס באמצעות כלי יישור מקוונים זמינים
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

תוצאות

התצפיות הבאות מדגימות הגברה מוצלחת של בחירה (SELEX). ראשית, ניתחנו את המאגר 0 ואת הרצפים שנבחרו לכריכה לחלבון המשמש את הגישה האיטרטיבית לבחירה. איור 2 מראה כי מערכת החלבונים (ptb) של היונקים המ, מראה כריכה מחייבת בקושי לגילוי 0, אך הזיקה גבוהה למאגר הרצף הנבחר. בק?...

Discussion

חומצות גרעין מחייב חלבונים הם הרגולטורים חשובים של בעלי חיים ופיתוח הצמח. דרישה מרכזית עבור הליך SELEX היא התפתחות של מעשה שניתן להשתמש בו כדי להפריד שברים RNA בעלי מאוגד חלבון ובלתי מאוגד. בעיקרון, היכולת הזאת יכולה להיות בתוך שיטת מחייב מחוץ לחוק, כגון השילוב של איגוד המסננים, שיטת התזוזה של ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard