Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Resumo

A especificidade da sequência é fundamental para a regulação genética. As proteínas reguladoras que reconhecem sequências específicas são importantes para a regulação genética. Definir locais de ligação funcionais para essas proteínas é um problema biológico desafiador. Uma aproximação iterativo para a identificação de um local obrigatório para uma proteína RNA-obrigatória é descrita aqui e é aplicável a todas as proteínas RNA-obrigatórias.

Resumo

O Regulamento genético desempenha um papel importante em todas as células. Os passos transcricional, pós-transcricional (ou processamento de RNA), translacionais e pós-translacionais são usados para regular genes específicos. As proteínas de ligação de ácidos nucleicos específicos de sequência destinam-se a sequências específicas para controlar a expressão genética espacial ou temporal. Os sítios de ligação em ácidos nucleicos são tipicamente caracterizados pela análise mutacional. Entretanto, as proteínas numerosas do interesse não têm nenhum local obrigatório conhecido para tal caracterização. Aqui nós descrevemos uma aproximação para identificar locais previamente desconhecidos da ligação para proteínas RNA-obrigatórias. Envolve a seleção iterativa e a amplificação das seqüências que começam com uma associação aleatorizada da seqüência. Após várias rodadas destes passos-transcrição, ligação e amplificação-as sequências enriquecidas são sequenciadas para identificar um local de ligação preferencial (s). O sucesso dessa abordagem é monitorado por meio de ensaios de ligação in vitro. Posteriormente, ensaios funcionais in vitro e in vivo podem ser utilizados para avaliar a relevância biológica das sequências selecionadas. Esta aproximação permite a identificação e a caracterização de um local (s) obrigatório previamente desconhecido para toda a proteína RNA-obrigatória para que um ensaio para separar RNAs proteína-ligadas e não acoplado existe.

Introdução

Na biologia celular, a regulação gênica desempenha um papel central. Em uma ou várias etapas ao longo da via de expressão gênica, os genes têm o potencial para ser regulado. Estas etapas incluem a transcrição (iniciação, alongamento, e terminação) assim como a emenda, a poliadenilação ou a formação final de 3 ', a exportação do RNA, a tradução do mRNA, e a deterioração/localização de transcritos preliminares. Nestas etapas, as proteínas de ligação ácida nucleico modulam a regulação genética. A identificação de sítios de ligação para essas proteínas é um aspecto importante do estudo do controle genético. A análise mutacional e a comparação da sequência filogenética têm sido usadas para descobrir sequências regulatórias ou sítios de ligação protéica em ácidos nucleicos, como promotores, sítios de emenda, elementos de poliadenilação e sinais translacionais^{1, 2. º , 3. º ,} a ⁴.

A emenda do pre-mRNA é uma etapa integral durante a expressão e a regulação do gene. A maioria dos genes mamíferos, incluindo aqueles em seres humanos, têm introns. Uma grande fração destas transcrições é alternativamente emunida, produzindo o mRNA múltiplo e as isoformas da proteína do mesmo gene ou transcrição preliminar. Essas isoformas têm funções específicas de células e de desenvolvimento na biologia celular. O 5 ' Splice site, o ramo-ponto, e o polypyrimidine-Tract/3 ' Splice site são críticos de emenda de sinais que estão sujeitos a regulamentação. No Regulamento negativo, um local de outra maneira forte da tala é reprimido, visto que no Regulamento positivo um local de outra maneira fraco da tala é ativado. Uma combinação desses eventos produz uma infinidade de isoformas funcionalmente distintas. As proteínas de ligação ao RNA desempenham papéis-chave nestes eventos alternativos de splicing.

As proteínas numerosas são conhecidas cujos os alvos do local (s) ou do RNA da ligação permanecem ser identificados^5,6. Ligar as proteínas reguladoras aos seus alvos biológicos a jusante ou sequências é frequentemente um processo complexo. Para essas proteínas, a identificação de seu RNA alvo ou local de ligação é um passo importante na definição de suas funções biológicas. Uma vez que um local obrigatório é identificado, pode ser caracterizado mais mais usando análises moleculars e bioquímicas padrão.

A abordagem descrita aqui tem duas vantagens. Primeiramente, pode identificar um local previamente desconhecido da ligação para uma proteína do interesse. Em segundo lugar, uma vantagem adicional desta aproximação é que permite simultaneamente a mutagenese da saturação, que de outra maneira seria labor intensivo para obter a informação comparável sobre exigências da seqüência dentro do local obrigatório. Assim, oferece uma ferramenta mais rápida, mais fácil, e menos cara para identificar locais da ligação da proteína no RNA. Originalmente, essa abordagem (SELEX ou evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial) foi utilizada para caracterizar o local de ligação para o bacteriófago T4 DNA polymerase (Gene 43 protein), que se sobrepõe ao local de ligação Ribossome em seu próprio mRNA. O site de vinculação contém uma sequência de loop de 8-base, representando 65.536 variantes aleatórias para análise⁷. Em segundo lugar, a abordagem também foi usada de forma independente para mostrar que locais de ligação específicos ou aptâmeros para diferentes corantes podem ser selecionados a partir de um pool de aproximadamente 10¹³ sequências⁸. Na verdade, essa abordagem tem sido amplamente utilizada em muitos contextos diferentes para identificar aptâmeros (seqüências de RNA ou DNA) para ligar numerosos ligantes, tais como proteínas, pequenas moléculas e células, e para catálise⁹. Como exemplo, um aptâmeros pode discriminar entre dois derivados de xantina, cafeína e Teofilina, que diferem pela presença de um grupo metilo na cafeína¹⁰. Nós usamos extensivamente esta aproximação (Selex ou seleção-amplificação iterativo) para estudar como as proteínas RNA-obrigatórias funcionam na emenda ou na regulação de emenda¹¹, que será a base para a discussão abaixo.

A biblioteca aleatória: nós usamos uma biblioteca aleatória de 31 nucleotides. A consideração de comprimento para a biblioteca aleatória foi vagamente baseada na idéia de que o fator de emenda geral U2AF⁶⁵ vincula a uma seqüência entre a seqüência de ponto de ramificação e o site de Splice 3 '. Em média, o espaçamento entre esses sinais de splicing em metazoanos está na faixa de 20 a 40 nucleotídeos. Uma outra proteína sexo-letal era sabido para ligar a uma seqüência regulamentar mal caracterizada perto do 3 ' local da tala de seu alvo pre-mRNA, transformador. Assim, optou-se por uma região aleatória de 31 nucleotídeos, ladeada por sítios de encadernação com sítios enzimáticos de restrição para permitir a amplificação de PCR e a fixação do promotor de RNA polimerase T7 para transcrição in vitro. O tamanho ou complexidade teórico da biblioteca foi de 4³¹ ou aproximadamente 10¹⁸. Utilizamos uma pequena fração desta biblioteca para preparar nosso pool de RNA aleatório (~ 10¹²-10¹⁵) para os experimentos descritos abaixo.

Protocolo

Nota: a Figura 1 fornece um resumo das etapas principais no processo iterativo de seleção-amplificação (Selex).

1. geração de um modelo de biblioteca aleatório

1. Sintetizar o primer Forward 5 '- Gtaatacgactcactatagggtgatcagattctgatcca-3 ' e o primer reverso 5 '-GcgacGgatccaagcttCA-3 ' por síntese química em um sintetizador de DNA.
   Nota: os primers e a biblioteca aleatória podem ser sintetizados comercialmente.
2. Sintetizar um modelo de oligonucleotide de biblioteca aleatória 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N₁... N₃₁) tgaagcttggatccgtcgc-3 ' por síntese química. Use uma mistura equimolar de quatro fosfatos durante a síntese para as 31 posições aleatórias mostradas acima como N.
   Nota: a sequência do modelo de biblioteca contém 31 nucleotídeos aleatórios (N1 a N31) e sequências de flanqueamento para a ligação dos primers Forward e Reverse. A cartilha de avanço inclui a seqüência de promotor de RNA polimerase T7 (sublinhada) para a transcrição in vitro e um local de restrição Bcl1 (itálico) para a clonagem. A cartilha reversa contém sítios enzimáticos de restrição BamH1 e HindIII (ITALICIZED) para facilitar a clonagem.

2. geração do pool aleatório da biblioteca do ADN

1. Anexar o promotor de RNA polimerase T7 à biblioteca por reacção em cadeia da polimerase (PCR) contendo 1 μM de ADN modelo de biblioteca aleatória, 1 μM de cada primer, 20 mM TRIS (pH 8,0), 1,5 mM MgCl₂, 50 mm kcl, 0,1 μg/μL de albumina sérica de bovinos acetilados, 2 unidades de Taq < /C1 > polymerase, e 200 μm cada um de dNTPs (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deoxycytidine, e triphosphate de deoxitimidina).
2. Use cinco ciclos de desnaturação, recozimento e etapas de extensão (94 ° c por 1 min, 53 ° c por 1 min e 72 ° c por 1 min) de PCR seguidos por um ciclo de extensão (72 ° c por 10 min).

3. síntese da piscina 0 RNA

1. Configurar uma reacção de transcrição de 100 μL¹². Mix T7 buffer de transcrição, 1 μm biblioteca aleatória piscina DNA, 5 mm ditiotreitol (DTT), 2 mm guanosina trifosfato (GTP), 1 mm cada um de adenosina trifosfato (ATP), citidina trifosfato (CTP), e uridina trifosfato (UTP), e 2 unidades/μl T7 RNA polimerase.
   Nota: o RNA pode ser transcrito in vitro utilizando kits comercialmente disponíveis com uma opção do RNA polimerase T7 ou SP6.
2. Incubar a mistura de reacção acima num tubo de microcentrífuga durante 2 h a 37 ° c.
3. O gel purificar o RNA em um gel desnaturação de 10% do poliacrilamida.
4. Identifique a localização das transcrições sobre o gel, manchando-a com azul de metileno ou autoradiografia, incluindo traços de radioatividade (0,5 μL ou menos de α-³²P UTP) na reação de transcrição.
   1. Coloque a fatia de gel em um tubo de centrífuga e quebre em pedaços menores, por exemplo, com uma ponta de homogeneizador. Adicionar proteases K (PK) tampão (100 mm Tris, pH 7,5, 150 mm NaCl, 12,5 mm EDTA, 1% Dodecil sulfato de sódio) para mergulhar as peças de gel. Deixe o tubo em um pulverizador de 2 h a durante a noite na temperatura ambiente.
5. Gire em um microcentrifugador de alta velocidade (14.000 rpm ou 16.873 x g) por 5 minutos na temperatura ambiente para remover os restos do gel e para recuperar a solução do amortecedor.
6. Vortex a amostra duas vezes com um volume igual de fenol-clorofórmio e uma vez com clorofórmio.
7. Misture a fase aquosa de cima com um décimo volume de acetato de sódio (3,0 M, pH 5,2), 10 μg de tRNA ou 20 μg de glicogênio, e etanol (2 – 3 volumes, armazenados a-20 ° c). Deixar os tubos a-80 ° c por 1 h.
8. Gire os tubos contendo a solução por 5 – 10 min a 4 ° c em uma microcentrífuga (14.000 rpm ou 16.873 x g). Descarte o sobrenadante com cuidado. Enxague a pelota do RNA com 70% de etanol e gire por 2 – 5 min. aspirar etanol com cuidado. O ar seca a pelota do RNA.
9. Solubilize a pelota do RNA em 50 μL da água tratada com do pirocarbonato do dietílico (DEPC). Deixe a amostra em-20 ° c para o armazenamento.
   Nota: purify o RNA usando as colunas comercialmente disponíveis da rotação, que são usadas atualmente mais geralmente para remover a radioactividade não incorporada e para serir como uma alternativa rápida e mais conveniente para a purificação do RNA.
   PRECAUÇÃO: Utilize um escudo de vidro acrílico, luvas e outras precauções para proteger da radioactividade.

4. reação de ligação à proteína e separação do RNA ligado

1. Realize a ligação da proteína e do RNA em Tris-HCl de 10 milímetros, pH 7,5 em um volume de 100 μL adicionando os seguintes ingredientes a estas concentrações finais: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0, 9 μg/μL de albumina sérica bovina, 0,5 unidades/μL de Rnasina, 0,15 μg/μL de tRNA , EDTA de 1 mM e 30 μL de concentração de proteína recombinante adequada (PTB). Adicione o RNA do pool apropriado.
   Nota: o fator de emenda U2AF⁶⁵ liga tipicamente aos locais da tala de polypyrimidine-Tract/3 ' de íntrons modelo com uma afinidade obrigatória (constante da dissociação do equilíbrio ou K_d) de aproximadamente 1 – 10 nanômetro. Portanto, as duas primeiras rodadas de ligação utilizada concentração proteica 10 vezes acima do K_d para U2AF⁶⁵; para as proteínas de SXL e de PTB, a concentração começando nesta escala era somente nossa melhor suposição. Isto assegurou que as espécies desejadas do RNA que poderiam se ligar, embora umas mais baixas seqüências da afinidade igualmente acopladas potencialmente. Nas rodadas 3 e 4 (transcrição, encadernação e amplificação), a concentração proteica foi reduzida em três vezes (etapa 4,1). Isso foi feito para eliminar sucessivamente as espécies de RNA de baixa afinidade.
2. Coloque os tubos contendo as reacções de ligação durante cerca de 30 min a 25 ° c num bloco de temperatura (ou no gelo).
3. Fractionate o RNA acoplado do RNA não acoplado para os primeiros 4 círculos da seleção-amplificação usando as seguintes etapas.
   1. Filtre a amostra (100 μL) à temperatura ambiente através de um filtro de nitrocelulose anexado a um colector de vácuo.
      Nota: o complexo RNA-proteína, mas não o RNA não acoplado, permanece no filtro.
   2. Pique o filtro com o RNA retido em fragmentos com uma lâmina de barbear estéril; inseri-los em um tubo de centrífuga. Recupere o RNA por caindo o tubo delicadamente por um mínimo de 3 h (ou durante a noite) com as partes do filtro imersas no amortecedor do proteinase K (PK).
   3. Deproteinize a amostra do RNA vortexing a na presença de um volume igual de phenol-clorofórmio (1:1) e então do clorofórmio. Recupere a fase aquosa cada vez centrifugar a amostra na alta velocidade por 5 minutos na temperatura ambiente.
   4. Misture com acetato de sódio (0,1 volume de 3,0 M, pH 5,2) e etanol (2 – 3 volumes de etanol absoluto, 200 prova). Deixe o tubo em um congelador de-80 ° c por 30 minutos, centrifugue-o na alta velocidade por 10 minutos, e, seguindo as etapas de lavagem e de secagem (etapa 3,8), solubilizar o RNA na água tratada com o DEPC. Estas etapas são descritas acima (etapas 3,6 a 3,9).
4. Separe as frações de RNA ligadas à proteína das frações não acopladas para as últimas 2 rodadas (rodadas 5 e 6; transcrição, encadernação e amplificação) da seguinte maneira. Reduza a concentração de proteínas na reação de ligação (etapa 4,1) por mais três vezes para a pressão de seleção adicional para enriquecer sequências de ligação de alta afinidade e remover preferencialmente sequências de baixa afinidade.
   1. Pre-Cast um gel nativo do poliacrilamida (5% com 60:1 acrylamide: relação do BIS-acrylamide) no amortecedor de 0.5 x TBE (Tris-borato-EDTA) antes de configurar o RNA acima: reação da proteína-ligação (etapa 4,1). Electrophorese este gel em uma sala fria (4 ° c) aplicando 250 V por 15 min.
   2. Pipeta o RNA acima: reações de ligação da proteína (etapa 4,1) em poços diferentes deste gel.
      Nota: a proteína é armazenada a-80 ° c e diluída antes do uso em 20 mm 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-etanoesulfonic Acid (HEPES), pH 8,0, 20% glicerol, 0,2 mm ácido etilenodiaminotraacético (EDTA), 0, 5% NP-40 e 1 mm ditiotreitol (DTT). A adição de 0,5 – 1,0 mM de inibidor de protease fenilmetano sulfonilo fluoreto (PMSF) é opcional. Na reação de ligação, este tampão contribui sobre o glicerol de 6%, que permite o carregamento direto das amostras nos poços sem a necessidade para misturá-los com um amortecedor separado do gel-carregamento.
   3. Fractionate o RNA acoplado do RNA não acoplado usando a electroforese do gel em uma sala fria (4 ° c) em 250 V para 1 a 2 h. Este processo é sabido igualmente como o ensaio da mudança da mobilidade do gel.
      Nota: a duração da eletroforese varia dependendo das características do RNA e da proteína usada para a ligação.
   4. Expor o gel a uma película de raio X e identificar a posição do RNA acoplado usando o autoradiography. Corte a fatia do gel com o RNA encadernado e insira-o em um tubo.
   5. Incubar a fatia esmagada do gel no amortecedor do PK usado para a eluição para 3 h ou durante a noite.
   6. Repita as etapas 3,5 a 3,9 descritas acima. Momentaneamente, vortex a amostra eluída do RNA vigorosamente primeiramente com phenol-clorofórmio e então com clorofórmio.
   7. Misture o acetato de sódio e etanol com a fase aquosa após a extração de clorofórmio. Após a incubação no congelador de-80 ° c, gire em 4 ° c por 5 – 10 minutos para recolher a pelota do RNA. Lave a pelota de RNA com etanol e seque-a com ar deixando a tampa do tubo aberta. Dissolver o RNA em água tratada com DEPC.
      Nota: mudar para o ensaio de deslocamento de mobilidade de gel para fraccionamento permite a eliminação de espécies de RNA indesejáveis que podem ter sido enriquecidas para ligação, por exemplo, ao filtro de nitrocelulose aqui (ou qualquer matriz) utilizado nas rodadas iniciais para fraccionamento.

5. transcrição reversa e amplificação de PCR

1. Sintetizar cDNA do RNA dissolvido utilizando transcriptase reversa e a cartilha reversa ao incuar a reação de 20 μL (2 μL de tampão 10x RT, 2 μL de transcriptase reversa de AMV, primer reverso de 1 μM, 10 μL de RNA, inibidor de RNase opcional) a 42 ° c por 60 min.
2. Amplificar o cDNA usando 20 – 25 ciclos de PCR conforme descrito na etapa 2,1.

6. transcrição e ligação de proteínas

1. Repita o processo de síntese de RNA, ligação de proteínas, separação de proteínas ligadas e fração não acoplada, conforme descrito na seção 3 – 5 acima.

7. análise das interações RNA-proteína

1. Use o ensaio de deslocamento de mobilidade de gel (etapa 4,4) ou o ensaio de ligação do filtro (etapa 4,3) para determinar a afinidade e a especificidade vinculativas para pools selecionados ou sequências individuais dentro de cada pool (consulte a etapa 8,3).
2. Use autoradiografia ou um Imager de fósforo para detectar e quantificar bandas na fração acoplada e fração não acoplada.

8. clonagem e sequenciamento

1. Digerir o produto final do ADN do PCR com enzimas Bcl1 e HindIII da limitação para 1 – 2 h, ligadura com o pGEM3 apropriadamente digerido ou outros plasmídeos que carreg os locais da limitação de 2 h à noite, transformam o produto da ligadura em pilhas bacterianas competentes por choque térmico ou Electroporation usando procedimentos padrão da biologia molecular¹³.
2. Cresça as bactérias durante a noite, galvanizando as células transformadas em placas de agar com Luria-Bertani (LB) médio e ampicilina (50 μg/mL) a 37 ° c. Escolha colônias para inocular tubos de cultura contendo meio líquido LB com ampicilina e cresça a 37 ° c em uma incubadora de agitação durante a noite. Purify DNAs plasmídeo contendo inserções de DNA usando um protocolo de isolamento plasmídeo padrão¹³.
   Nota: os kits comerciais estão disponíveis para purificação de plasmídeo.
3. Sequencia os plasmíos com inserções de DNA usando o protocolo de sequenciamento de terminação de cadeia método, seguindo as instruções do fabricante para sequenciamento¹⁴.
   Nota: o sequenciamento pode ser realizado em casa ou feito comercialmente.

9. alinhamento da sequência

1. Alinhar sequências e obter um site (s) de ligação de consenso usando ferramentas de alinhamento on-line disponíveis
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

Resultados

As seguintes observações demonstram a seleção-amplificação bem sucedida (SELEX). Em primeiro lugar, analisamos o pool 0 e as sequências selecionadas para ligação à proteína utilizada para a abordagem iterativa de amplificação de seleção. A Figura 2 mostra que a proteína de ligação de polipirimidina-trato de mamíferos (PTB) mostra ligação mal detectável à seqüência de 0 de pool, mas alta afinidade para o pool de sequências selecionado...

Discussão

As proteínas de ligação de ácidos nucleicos são importantes reguladores do desenvolvimento animal e vegetal. Um requisito fundamental para o procedimento SELEX é o desenvolvimento de um ensaio que pode ser usado para separar frações de RNA ligadas à proteína e não acopladas. Em princípio, este ensaio pode ser um ensaio de ligação in vitro, como o ensaio de ligação de filtro, o ensaio de deslocamento de mobilidade em gel ou um ensaio de ligação matricial¹⁹ para proteínas recombin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard