Esplorare lo spazio di sequenza per identificare i siti di legame per le proteine di legame dell'RNA regolamentare

Riepilogo

La specificità della sequenza è fondamentale per la regolazione genica. Le proteine regolatorie che riconoscono sequenze specifiche sono importanti per la regolazione genica. La definizione di siti di legame funzionale per tali proteine è un problema biologico impegnativo. Un approccio iterativo per l'identificazione di un sito di legame per una proteina legante l'RNA è descritto qui ed è applicabile a tutte le proteine che legano l'RNA.

Abstract

La regolazione genica svolge un ruolo importante in tutte le cellule. Le fasi trascrizionali, post-trascrizionali (o elaborazione dell'RNA), traslazionali e post-traduzionale vengono utilizzate per regolare geni specifici. Le proteine geneagene-leganti specifiche della sequenza prendono di mira sequenze specifiche per controllare l'espressione genica spaziale o temporale. I siti di legame negli acidi nucleici sono tipicamente caratterizzati da analisi mutazionali. Tuttavia, numerose proteine di interesse non hanno un sito di legame noto per tale caratterizzazione. Qui descriviamo un approccio per identificare siti di legame precedentemente sconosciuti per le proteine che legano l'RNA. Si tratta di selezione iterativa e amplificazione delle sequenze a partire da un pool di sequenze randomizzato. Seguendo diversi cicli di questi passaggi-trascrizione, rilegatura e amplificazione- le sequenze arricchite sono sequenziati per identificare un sito di associazione preferito. Il successo di questo approccio è monitorato utilizzando saggi vincolanti in vitro. Successivamente, per valutare la rilevanza biologica delle sequenze selezionate è possibile utilizzare analisi funzionali in vitro e in vivo. Questo approccio consente l'identificazione e la caratterizzazione di uno o più siti di legame precedentemente sconosciuti per qualsiasi proteina legante all'RNA per la quale esiste un saggio per separare gli RNA legati alle proteine e non associati.

Introduzione

Nella biologia cellulare, la regolazione genica svolge un ruolo centrale. A uno o più passaggi lungo il percorso di espressione genica, i geni hanno il potenziale per essere regolati. Questi passaggi includono la trascrizione (iniazione, allungamento e terminazione) così come lo splicing, la poliadenilazione o la formazione finale di 3' , l'esportazione dell'RNA, la traduzione di mRNA e il decadimento/localizzazione delle trascrizioni primarie. In questi passaggi, le proteine che legano l'acido nucleico modulano la regolazione genica. L'identificazione dei siti di legame per tali proteine è un aspetto importante dello studio del controllo genico. L'analisi mutazionale e il confronto della sequenza filogenetica sono stati utilizzati per scoprire sequenze normative o siti di legame proteico in acidi nucleici, come promotori, siti di giunzione, elementi di poliadenilazione e segnali traslazionali^{1, 2 Il} nome del sistema ^{, 3} (COM del nome ^{, 4}.

Lo splicing pre-mRNA è un passo fondamentale durante l'espressione e la regolazione genica. La maggior parte dei geni dei mammiferi, compresi quelli negli esseri umani, hanno introni. Una grande frazione di queste trascrizioni è alternativamente spliced, producendo più isoforme mRNA e proteine dallo stesso gene o trascrizione primaria. Queste isoforme hanno ruoli specifici delle cellule e di sviluppo nella biologia cellulare. Il sito di giunzione da 5' , il punto di rammarico e il sito di giunzione polipirina/3' sono segnali critici di giunzione che sono soggetti a regolamentazione. Nella regolazione negativa, un sito di giunzione altrimenti forte viene represso, mentre nella regolamentazione positiva viene attivato un sito di giunzione altrimenti debole. Una combinazione di questi eventi produce una pletora di isoforme funzionalmente distinte. Le proteine che legano l'RNA svolgono un ruolo chiave in questi eventi alternativi di giunzione.

Sono note numerose proteine i cui siti di legame o bersagli di RNA devono ancora essere identificati^5,6. Collegare le proteine regolatorie ai loro bersagli o sequenze biologiche a valle è spesso un processo complesso. Per tali proteine, l'identificazione dell'RNA bersaglio o del sito di legame è un passo importante nella definizione delle loro funzioni biologiche. Una volta identificato, un sito di legame può essere ulteriormente caratterizzato utilizzando analisi molecolari e biochimiche standard.

L'approccio qui descritto presenta due vantaggi. In primo luogo, può identificare un sito di legame precedentemente sconosciuto per una proteina di interesse. In secondo luogo, un ulteriore vantaggio di questo approccio è che consente contemporaneamente la mutagenesi della saturazione, che altrimenti richiederebbe molta manodopera per ottenere informazioni comparabili sui requisiti di sequenza all'interno del sito di rilegatura. Così, offre uno strumento più veloce, più facile e meno costoso per identificare i siti di legame proteico nell'RNA. Originariamente, questo approccio (SELEX o evoluzione sistematica dei ligandi da arricchimento EXponential) è stato utilizzato per caratterizzare il sito di legame per la polioamerasi del DNA batteriophage T4 (proteina genica 43), che si sovrappone al sito di legame del ribosoma nel proprio mRNA. Il sito di associazione contiene una sequenza di loop a 8 basi, che rappresenta 65.536 varianti randomizzate per l'analisi⁷. In secondo luogo, l'approccio è stato utilizzato anche in modo indipendente per dimostrare che specifici siti di legame o aptamers per diversi coloranti possono essere selezionati da un pool di circa 10¹³ sequenze⁸. Infatti, questo approccio è stato ampiamente utilizzato in molti contesti diversi per identificare gli aptamers (sequenze di RNA o DNA) per legare numerosi ligandi, come proteine, piccole molecole e cellule, e per la catalisi⁹. Ad esempio, un aptamer può discriminare tra due derivati xanthine, caffeina e teofillina, che differiscono per la presenza di un gruppo metilico nella caffeina¹⁰. Abbiamo ampiamente usato questo approccio (SELEX o selezione iterativa-amplificazione) per studiare come funzionano le proteine che legano l'RNA nella regolazione dello splicing o dello splicing¹¹, che sarà la base per la discussione qui sotto.

La libreria casuale: Abbiamo usato una libreria casuale di 31 nucleotidi. La considerazione della lunghezza per la libreria casuale era vagamente basata sull'idea che il fattore di giunzione generale U2AF⁶⁵ si lega a una sequenza tra la sequenza di branch-point e il sito di giunzione 3'. In media, la spaziatura tra questi segnali di splicing nei metazoi è compresa tra 20-40 nucleotidi. Un'altra proteina Sex-lethal era nota per legarsi a una sequenza regolatore mal caratterizzata vicino al sito di giunzione 3' del suo pre-mRNA bersaglio, trasformatore. Così, abbiamo scelto una regione casuale di 31 nucleotidi, affiancata da siti di legame primer con siti di enzimi di restrizione per consentire l'amplificazione PCR e l'attaccamento del promotore di polimerasi t7 RNA per la trascrizione in vitro. La dimensione teorica della biblioteca o la complessità era di 4³¹ o di circa 10¹⁸. Abbiamo usato una piccola frazione di questa libreria per preparare ilnostro pool di RNA casuale (10¹²-15 dollari) per gli esperimenti descritti di seguito.

Protocollo

NOTA: nella Figura 1 viene fornito un riepilogo dei passaggi chiave del processo iterativo di selezione-amplificazione (SELEX).

1. Generazione di un modello di libreria casuale

1. Sintetizzare l'avanzata 5'- GTAATACGACTCACTCACTATAGGGTGATCAGATTGATCCA-3' e il primer inverso 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' con la sintesi chimica su un sintetizzatore di DNA.
   NOTA: I primer e la libreria casuale possono essere sintetizzati commercialmente.
2. Sintetizzare una libreria casuale oligonucleotide modello 5' - GGTGATCAGATTGATCTGATCCA(N₁... N₃₁)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' per sintesi chimica. Utilizzare una miscela equimolare di quattro fosforamiditi durante la sintesi per le 31 posizioni randomizzate mostrate sopra come N.
   NOTA: la sequenza del modello di libreria contiene 31 nucleotidi casuali (da N1 a N31) e sequenze di fianco per l'associazione dei primer in avanti e inverso. Il primer in avanti include la sequenza promotrice di polimerasi dell'RNA T7 (sottolineata) per la trascrizione in vitro e un sito di restrizione Bcl1 (corsivo) per la clonazione. Il primer inverso contiene siti di enzimi di restrizione BamH1 e HindIII (corsivo) per facilitare la clonazione.

2. Generazione del pool della libreria casuale del DNA

1. Attaccare il promotore di polimerasi T7 RNA alla libreria mediante reazione a catena di polimerasi (PCR) contenente 1 modello di libreria casuale di DNA M, 1 M di ogni primer, 20 mM Tris (pH 8.0), 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,1 g/sacetylated bovine serumin, 2 unità di Taq /c1> polimerasi, e 200 M ciascuno dei dNTP (deoxyguanosine, deoxyadenosine, deossicitidina e trefosfato deossithymidine).
2. Utilizzare cinque cicli di denaturazione, annessione ed estensione (94 gradi centigradi per 1 min, 53 gradi centigradi per 1 min e 72 gradi centigradi per 1 min) di PCR seguiti da un ciclo di estensione (72 gradi centigradi per 10 minuti).

3. Sintesi della piscina 0 RNA

1. Impostare una reazione di trascrizione di 100^l112. Mix T7 buffer di trascrizione, 1 M di pool di libreria casuale DNA, 5 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM guanosine tripofoshate (GTP), 1 mM ciascuno di adenosina trifosfato (ATP), trefosdo citidino (CTP), e urdine triposphate (UTP), e 2 unità/
   NOTA: l'RNA può essere trascritto in vitro utilizzando kit disponibili in commercio con un'opzione della polimerasi dell'RNA T7 o SP6.
2. Incubare la miscela di reazione di cui sopra in un tubo di microcentrifuga per 2 h a 37 .
3. Gel purifica l'RNA in un gel di poliacrilammide denatura al 10%.
4. Identificare la posizione delle trascrizioni sul gel macchiandolo con blu di metilene o autoradiografia includendo tracce di radioattività (0,5 o meno di³²P UTP) nella reazione di trascrizione.
   1. Mettere la fetta di gel in un tubo di centrifuga e rompersi in pezzi più piccoli, ad esempio, con una punta omogenea. Aggiungere il buffer di proteine K (PK) (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% solfato di sodismo di sodio) per immergere i pezzi di gel. Lasciare il tubo su un nutatore da 2 h a una notte a temperatura ambiente.
5. Girare in una microcentrifuga ad alta velocità (14.000 rpm o 16.873 x g) per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere i detriti gel e recuperare la soluzione buffer.
6. Vorticare il campione due volte con un volume uguale di fenolo-cloroformio e una volta con cloroformio.
7. Mescolare la fase acquosa dall'alto con un decimo di volume di acetato di sodio (3,0 M, pH 5,2), 10 g di tRNA o 20 g di glicogeno ed etanolo (2–3 volumi, conservati a -20 gradi centigradi). Lasciare i tubi a -80 gradi centigradi per 1 ora.
8. Girare i tubi contenenti la soluzione per 5-10 min a 4 gradi centigradi in una microcentrifuga (14.000 giri/m o 16.873 x g). Scartate il super-natante con attenzione. Sciacquare accuratamente il pellet di RNA con il 70% di etanolo e spin per 2-5 min. Asciugare all'aria il pellet di RNA.
9. Solubilizzare il pellet di RNA in 50 o l di acqua trattata con pirocarbonato dietilio (DEPC). Lasciare il campione a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio.
   NOTA: Purificare l'RNA utilizzando colonne di spin disponibili in commercio, che sono attualmente più comunemente utilizzate per rimuovere la radioattività non incorporata e fungono da alternativa rapida e più conveniente per la purificazione dell'RNA.
   UTILITÀ: utilizzare uno scudo di vetro acrilico, guanti e altre precauzioni per proteggersi dalla radioattività.

4. Reazione di legame proteico e separazione dell'RNA legato

1. Eseguire il legame di proteine e RNA in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 in un volume di 100 gradi aggiungendo i seguenti ingredienti a queste concentrazioni finali: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 g di albumina di siero bovine, 0,5 unità/L RNasin, 0,15 g/tRNA , 1 mM EDTA, e 30 - L di adeguata concentrazione di proteine ricombinanti (PTB). Aggiungere l'RNA dalla piscina appropriata.
   NOTA: Il fattore di giunzione U2AF⁶⁵ si lega tipicamente ai siti di giunzione polipirina-tratto/3' degli introni del modello con un'affinità di legame (costante di dissociazione di equilibrio o K_d) di circa 1–10 nM. Pertanto, i primi due cicli di legame hanno usato la concentrazione di proteine di 10 volte sopra il K_d per U2AF⁶⁵; per le proteine SXL e PTB, la concentrazione iniziale in questa gamma era solo la nostra ipotesi migliore. Ciò ha garantito che le specie di RNA desiderate potessero legarsi, anche se anche le sequenze di affinità inferiore potrebbero essere potenzialmente legate. Nei round 3 e 4 (trascrizione, legame e amplificazione), la concentrazione proteica è stata ridotta di tre volte (Passo 4.1). Questo è stato fatto per eliminare successivamente le specie di RNA a bassa affinità.
2. Posizionare i tubi contenenti le reazioni di legame per circa 30 min a 25 gradi centigradi in un blocco di temperatura (o sul ghiaccio).
3. Frazionare l'RNA legato dall'RNA non legato per i primi 4 cicli di selezione-amplificazione utilizzando i seguenti passaggi.
   1. Filtrare il campione (100 ) a temperatura ambiente attraverso un filtro di nitrocellulosa attaccato a un collettore sottovuoto.
      NOTA: Il complesso RNA-proteina, ma non l'RNA non legato, rimane sul filtro.
   2. Tritare il filtro con RNA trattenuto in frammenti con una lama sterile di rasoio; inserirli in un tubo di centrifuga. Recuperare l'RNA facendo cadere delicatamente il tubo per un minimo di 3 h (o durante la notte) con i pezzi di filtro immersi nel buffer della proteinasi K (PK).
   3. Deproteinezza recibes se demintocare in presenza di un volume uguale di fenolo-cloroformio (1:1) e poi di cloroformio. Recuperare la fase acquosa ogni volta centrifugando il campione ad alta velocità per 5 min a temperatura ambiente.
   4. Mescolare con acetato di sodio (0,1 volume di 3,0 M, pH 5,2) e etanolo (2-3 volumi di etanolo assoluto, 200 prova). Lasciare il tubo in un congelatore a -80 gradi centigradi per 30 min, centrifugarlo ad alta velocità per 10 min e, seguendo le fasi di lavaggio e asciugatura (passaggio 3.8), solluvirizzare l'RNA in acqua trattata con DEPC. Questi passaggi sono descritti in precedenza (passaggi da 3.6 a 3.9).
4. Separare le frazioni di RNA legate alle proteine dalle frazioni non legate per gli ultimi 2 turni (arrotondamenti 5 e 6; trascrizione, legame e amplificazione) come segue. Ridurre la concentrazione proteica nella reazione di legame (passo 4.1) di altre tre volte per aggiungere una pressione di selezione per arricchire le sequenze di legame ad alta affinità e rimuovere preferibilmente le sequenze a bassa affinità.
   1. Pre-cast di un gel di poliacrilamide nativo (5% con 60:1 acrilamide:bis-acrilamide ratio) in buffer TBE 0,5x (Tris-Borate-EDTA) prima di impostare la precedente reazione RNA:protein-binding (passaggio 4.1). Elettrophorese questo gel in una stanza fredda (4 gradi centigradi) applicando 250 V per 15 min.
   2. Pipette le reazioni di legame RNA:proteindi cui sopra (passaggio 4.1) in diversi pozzi di questo gel.
      NOTA: La proteina viene immagazzinata a -80 gradi centigradi e diluita prima dell'uso in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES), pH 8.0, 20% glicerolo, 0,2 mM di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA), 0,05% NP-40 e 1 mM dithiothreitol (DTT). L'aggiunta di 0,5–1,0 mM di inibitore del fenilmetano alito (PMSF) è opzionale. Nella reazione di rilegatura, questo buffer contribuisce circa 6% glicerolo, che consente il caricamento diretto di campioni nei pozzi senza la necessità di mescolarli con un buffer di caricamento gel separato.
   3. Frazionare l'RNA legato dall'RNA non legato utilizzando l'elettroforesi gel in una stanza fredda (4 gradi centigradi) a 250 V per 1 a 2 h. Questo processo è noto anche come analisi del cambio di mobilità del gel.
      NOTA: La durata dell'elettroforesi varia a seconda delle caratteristiche dell'RNA e delle proteine utilizzate per il legame.
   4. Esporre il gel su una pellicola a raggi X e identificare la posizione dell'RNA legato utilizzando l'autoradiografia. Tagliare la fetta di gel con l'RNA legato e inserirla in un tubo.
   5. Incubare la fetta di gel schiacciato nel buffer PK utilizzato per l'eluizione per 3 h o durante la notte.
   6. Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.9 descritti in precedenza. In breve, vortice il campione di RNA eluito vigorosamente prima con fenolo-cloroformio e poi con cloroformina.
   7. Mescolare l'acetato di sodio e l'etanolo con la fase acquosa dopo l'estrazione del cloroformio. Dopo l'incubazione nel congelatore a -80 gradi centigradi, girare a 4 gradi centigradi per 5-10 min per raccogliere il pellet di RNA. Lavare il pellet di RNA con etanolo e asciugarlo all'aria lasciando il coperchio del tubo aperto. Sciogliere l'RNA in acqua trattata con DEPC.
      NOTA: il passaggio all'analisi del cambio di mobilità del gel per la frazione consente l'eliminazione di specie di RNA indesiderate che potrebbero essere state arricchite per legarsi, ad esempio, al filtro di nitrocellulosa qui (o a qualsiasi matrice) utilizzato nei turni iniziali per la frazione.

5. Trascrizione inversa e amplificazione PCR

1. Sintetizza cDNA dall'RNA disciolto utilizzando la trascrizione inversa e l'innintore inverso incubando la reazione di 20 -L (2 -L di 10x RT Buffer, 2 -L di trascrizione inversa AMV, 1M inverso primer, 10 L di RNA, inibitore di RNase opzionale) a 42 gradi centigradi per 60 min.
2. Amplificare il cDNA utilizzando 20-25 cicli PCR come descritto nel passaggio 2.1.

6. Trascrizione e rilegatura delle proteine

1. Ripetere il processo di sintesi dell'RNA, legame proteico, separazione della proteina legata e frazione non legata, come descritto nella sezione 3-5 sopra.

7. Analisi delle interazioni RNA-proteina

1. Utilizzare l'analisi del cambio di mobilità gel (passaggio 4.4) o l'analisi di associazione del filtro (passaggio 4.3) per determinare l'affinità e la specificità di legame per pool selezionati o singole sequenze all'interno di ogni pool (vedere il passaggio 8.3).
2. Utilizzare l'autoradiografia o un imager fosforo per rilevare e quantificare le bande nella frazione legata e non associata.

8. Clonazione e sequenziamento

1. Digerire il prodotto finale del DNA PCR con enzimi di restrizione Bcl1 e HindIII per 1–2 h, ligati con il pGEM3 opportunamente digerito o altri plasmidi che trasportano i siti di restrizione da 2 h a una notte, trasformare il prodotto di legazione in cellule batteriche competenti da shock termico o elettroporazione utilizzando procedure di biologia molecolare standard¹³.
2. Coltiva i batteri durante la notte placcando le cellule trasformate su piastre di agar con il mezzo Luria-Bertani (LB) e l'ampicillina (50 g/mL) a 37 gradi centigradi. Raccogliere le colonie per inoculare i tubi di coltura contenenti il mezzo liquido LB con ampicillina e crescere a 37 gradi centigradi in un incubatore tremante durante la notte. Purificare i DNA plasmide contenenti inserti di DNA utilizzando un protocollo di isolamento plasmide standard¹³.
   NOTA: sono disponibili kit commerciali per la purificazione plasmida.
3. Sequenziare i plasmidi con inserti di DNA utilizzando il protocollo di dideossia di terminazione della catena, seguendo le istruzioni del produttore per il sequenziamento¹⁴.
   NOTA: Il sequenziamento può essere eseguito in casa o in commercio.

9. Allineamento della sequenza

1. Allineare le sequenze e ottenere uno o più siti di associazione del consenso utilizzando gli strumenti di allineamento online disponibili
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

Risultati

Le seguenti osservazioni dimostrano il successo della selezione-amplificazione (SELEX). In primo luogo, abbiamo analizzato la piscina 0 e le sequenze selezionate per il legame alla proteina utilizzata per l'approccio iterativo di selezione-amplificazione. La figura 2 mostra che la proteina legante polipirimidina-tratto mammifero (PTB) mostra un legame appena rilevabile alla sequenza 0 della piscina, ma un'elevata affinità per il pool di sequenze selezionato....

Discussione

Le proteine che legano gli acidi nucleici sono importanti regolatori dello sviluppo animale e vegetale. Un requisito fondamentale per la procedura SELEX è lo sviluppo di un saggio che può essere utilizzato per separare le frazioni di RNA legate alle proteine e non legate. In linea di principio, questo saggio può essere un saggio in vitro vincolante come l'analisi di legame filtrante, l'analisi del cambio di mobilità del gel o un saggio di legame di matrice¹⁹ per proteine ricombinanti, proteine...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard