Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Özet

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Özet

Gen regülasyonu tüm hücrelerde önemli bir rol oynar. Transkripsiyonel, transkripsiyon sonrası (veya RNA işleme), çevirive çeviri sonrası adımlar belirli genleri düzenlemek için kullanılır. Diziye özgü nükleik asit bağlayıcı proteinler, mekansal veya zamansal gen ekspresyonunu kontrol etmek için belirli dizileri hedef ler. Nükleik asitlerdeki bağlanma alanları tipik olarak mutasyonel analiz ile karakterizedir. Ancak, ilgi çok sayıda protein bu tür karakterizasyon için bilinen bir bağlayıcı site var. Burada RNA bağlayıcı proteinler için daha önce bilinmeyen bağlayıcı siteleri tanımlamak için bir yaklaşım açıklar. Randomize sıralı bir havuzla başlayan dizilerin yinelemeli seçimi ve amplifikasyonunu içerir. Bu adım-transkripsiyon, bağlama ve amplifikasyon-zenginleştirilmiş dizileri birkaç tur sonra tercih edilen bir bağlama site (ler) tanımlamak için sıralanır. Bu yaklaşımın başarısı in vitro bağlayıcı tahliller kullanılarak izlenir. Daha sonra, in vitro ve in vivo fonksiyonel tahliller seçilen dizilerin biyolojik alaka değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, proteine bağlı ve bağlı olmayan RNA'ları ayırmak için bir tizin bulunduğu herhangi bir RNA bağlayıcı protein için önceden bilinmeyen bir bağlayıcı sitenin(ler) tanımlanmasını ve karakterizasyonuna olanak tanır.

Giriş

Hücre biyolojisinde gen regülasyonu merkezi bir rol oynar. Gen ekspresyonu yolu boyunca bir veya birden fazla adımda genler düzenlenme potansiyeline sahiptir. Bu adımlar transkripsiyon (başlatma, uzama ve sonlandırma) yanı sıra birleştirme, poliadenilasyon veya 3' bitiş oluşumu, RNA ihracat, mRNA çeviri ve birincil transkript çürüme / lokalizasyon içerir. Bu adımlarda, nükleik asit bağlayıcı proteinler gen regülasyonlarını modüle eder. Bu tür proteinler için bağlayıcı alanların belirlenmesi gen kontrolü eğitiminin önemli bir yönüdür. Mutasyonel analiz ve filogenetik dizi karşılaştırması, promotörler, splice siteleri, poliadenilasyon elemanları ve çeviri sinyalleri 1 gibi nükleik asitlerdeki düzenleyici dizileri veya protein bağlayıcı alanları keşfetmek için kullanılmıştır^{1, 2.000 , 3.2.2 , 4 .}

Pre-mRNA birleştirme gen ekspresyonu ve regülasyonu sırasında ayrılmaz bir adımdır. Memeli genlerinin çoğunda, insanlarda da dahil olmak üzere, intronlar vardır. Bu transkriptlerin büyük bir kısmı alternatif olarak birleştirilmiş olup, aynı gen veya primer transkriptten birden fazla mRNA ve protein isoformları üretilir. Bu isoformların hücre biyolojisinde hücreye özgü ve gelişimsel rolleri bulunur. 5' splice sitesi, şube noktası ve polipirimidin-yolu/3' splice sitesi, yönetmeliğe tabi kritik birleştirme sinyalleridir. Olumsuz düzenlemede, başka bir şekilde güçlü bir splice sitesi bastırılır, olumlu düzenlemede ise zayıf bir splice sitesi etkinleştirilir. Bu olayların bir kombinasyonu işlevsel olarak farklı isoforms bir bolluk üretir. RNA bağlayıcı proteinler bu alternatif birleştirme olaylarında kilit rol oynarlar.

Çok sayıda protein olan bağlayıcı site (ler) veya RNA hedefleri^5,6tespit edilecektir bilinmektedir. Düzenleyici proteinleri aşağı biyolojik hedeflerine veya dizilerine bağlamak genellikle karmaşık bir süreçtir. Bu tür proteinler için, hedef RNA veya bağlayıcı sitenin belirlenmesi biyolojik fonksiyonlarını tanımlamada önemli bir adımdır. Bağlayıcı bir bölge tanımlandıktan sonra, standart moleküler ve biyokimyasal analizler kullanılarak daha da karakterize edilebilir.

Burada açıklanan yaklaşımın iki avantajı vardır. İlk olarak, ilgi bir protein için daha önce bilinmeyen bir bağlayıcı site belirleyebilirsiniz. İkinci olarak, bu yaklaşımın bir avantajı da aynı anda doygunluk mutagenezi sağlar, aksi takdirde ciltleme site içinde dizi gereksinimleri hakkında karşılaştırılabilir bilgi elde etmek için emek yoğun olacaktır. Böylece, RNA protein bağlayıcı siteleri tanımlamak için daha hızlı, daha kolay ve daha az maliyetli bir araç sunuyor. Başlangıçta, bu yaklaşım (EXponential zenginleştirme ile Ligands Sistematik Evrimi) bakteriyofaj T4 DNA polimeraz (gen 43 protein), kendi mRNA ribozom bağlayıcı site ile örtüşen bağlayıcı site için bağlayıcı site karakterize etmek için kullanılmıştır. Bağlama sitesi,^analiz7 için 65.536 randomize varyantı temsil eden 8-baz döngü dizisi içerir. İkinci olarak, yaklaşım da bağımsız olarak farklı boyalar için belirli bağlama siteleri veya aptamers yaklaşık 10¹³ dizileri⁸bir havuzdan seçilebilir göstermek için kullanılmıştır. Aslında, bu yaklaşım geniş birçok farklı bağlamlarda aptamers tanımlamak için kullanılmıştır (RNA veya DNA dizileri) proteinler gibi çok sayıda ligands bağlamak için, küçük moleküller, ve hücreler, ve kataliz için⁹. Örnek olarak, bir aptamer kafein 10 bir metil grubunun varlığı ile farklı iki ksantin türevleri,kafein ve teofilin arasında ayrım yapabilirsiniz. Bu yaklaşımı (SELEX veya yinelemeli seçilim-amplifikasyon) aşağıdaki tartışmanın temelini oluşturacak olan RNA bağlayıcıproteinlerin 11'i birleştirme veya birleştirme düzenlemesinde nasıl işlediğini incelemek için yoğun olarak kullandık.

Rasgele kütüphane: Biz 31 nükleotit rasgele bir kütüphane kullanılır. Rasgele kitaplık için uzunluk dikkate gevşek genel birleştirme faktörü U2AF⁶⁵ dal noktası sırası ve 3 'splice site arasında bir dizi bağlanır fikrine dayanıyordu. Ortalama olarak, metazoanlarda bu birleştirme sinyalleri arasındaki boşluk 20 ila 40 nükleotit aralığındadır. Başka bir protein Sex-lethal hedef öncesi mRNA, transformatör3 'splice site yakınında kötü karakterize düzenleyici dizi bağlamak için biliniyordu . Böylece, PCR amplifikasyonu ve in vitro transkripsiyon için T7 RNA polimeraz organizatörü ek için izin vermek için restriksiyon enzim siteleri ile astar bağlama siteleri ile çevrili 31 nükleotit, rasgele bir bölge seçti. Teorik kütüphane boyutu veya karmaşıklığı 4³¹ veya yaklaşık 10¹⁸idi. Biz aşağıda açıklanan deneyler için rasgele RNA havuzu (~ 10¹²-10¹⁵⁾hazırlamak için bu kütüphanenin küçük bir kısmını kullandı.

Protokol

NOT: Şekil 1 yinelemeli seçim-amplifikasyon (SELEX) sürecindeki önemli adımların bir özetini sağlar.

1. Rasgele kitaplık şablonu oluşturma

1. İleri astar 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' ve ters astar 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' bir DNA sentezleyicisi üzerinde kimyasal sentez ile sentezleyin.
   NOT: Astarlar ve rasgele kitaplık ticari olarak sentezlenebilir.
2. Synthesize rasgele kütüphane oligonükleotid şablon u 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N₁... N₃₁)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' kimyasal sentezile. Yukarıda N olarak gösterilen 31 randomize pozisyon için sentez sırasında dört fosforamiditin equimolar karışımını kullanın.
   NOT: Kitaplık şablonunun sırası, ileri ve geri astarların bağlanması için 31 rasgele nükleotit (N1-N31) ve yan diziler içerir. İleri astar, in vitro transkripsiyon için T7 RNA polimeraz promotör dizisini (altı çizili) ve klonlama için Bcl1 (italikleştirilmiş) bir kısıtlama sitesini içerir. Ters astar klonlama kolaylaştırmak için restriksiyon enzim siteleri BamH1 ve HindIII (italik) içerir.

2. DNA rastgele kütüphane havuzunun üretimi

1. T7 RNA polimeraz promotörünün 1 μM DNA rasgele kitaplık şablonu, 1 μM'lik her astar, 20 mM Tris (pH 8.0), 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.1 μg/μL asettylated büyükbaş hayvan serum albumini, 2 adet Taq] içeren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kütüphaneye takın. /c1> polimeraz ve 200 μM her dNTPs (deoksiguanozin, deoksiadenozin, deoksisitin ve deoksitimidin trifosfat).
2. Beş devir denatürasyon, annealing ve uzatma adımlarını (1 dk için 94 °C, 1 dk için 53 °C ve 1 dk için 72 °C) pcr'yi bir uzatma döngüsü (10 dk için 72 °C) kullanın.

3. Havuz 0 RNA sentezi

1. 100 μL transkripsiyon reaksiyonu¹²ayarlayın. Mix T7 transkripsiyon tamponu, 1 μM rastgele kütüphane havuzu DNA, 5 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM guanozin trifosfat (GTP), 1 mM her adenozin trifosfat (ATP), sitidin trifosfat (CTP) ve uridin trifosfat (UTP) ve 2 adet/μL T7 RNA polimerpolimeraz.
   NOT: RNA, T7 veya SP6 RNA polimeraz seçeneği ile ticari olarak kullanılabilen kitleri kullanarak in vitro olarak yazılabilir.
2. Yukarıdaki reaksiyon karışımını mikrosentrifuge tüpünde 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
3. Jel% 10 denaturing poliakrilamid jel RNA arındırMak.
4. Transkripsiyon reaksiyonuna radyoaktivite (0,5 μL veya daha az α-³²P UTP) ekleyerek jel üzerindeki transkriptlerin yerini metilen mavisi veya otoradyografi ile boyayarak belirleyin.
   1. Bir santrifüj tüp içinde jel dilim yerleştirin ve daha küçük parçalara kırmak, örneğin, bir homogenizer ucu ile. Jel parçalarını batırmak için proteinaz K (PK) tamponunu (100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 12.5 mM EDTA, %1 Sodyum dodecyl sülfat) ekleyin. Oda sıcaklığında geceleme için 2 saat bir nutator üzerinde tüp bırakın.
5. Jel enkaz kaldırmak ve tampon çözeltisi kurtarmak için oda sıcaklığında 5 dakika için yüksek hızlı mikrocentrifuge (14.000 rpm veya 16.873 x g) spin.
6. Feol-kloroform eşit hacimli ve kloroform ile bir kez örnek girdap iki kez.
7. Yukarıdan gelen sulu fazı onda bir sodyum asetat (3,0 M, pH 5,2), 10 μg tRNA veya 20 g glikojen ve etanol (-20 °C'de depolanan 2-3 cilt) ile karıştırın. Tüpleri -80 °C'de 1 saat bekletin.
8. Çözeltiyi içeren tüpleri 4 °C'de mikrosentrifuge (14.000 rpm veya 16.873 x g) döndürün. Supernatant'ı dikkatlice atın. RNA peletini %70 etanol ile durula ve 2-5 dakika boyunca spin. Etanol etanolünü dikkatlice durula. RNA peletini hava kurutun.
9. Metil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış 50 μL suda RNA peletini çözün. Numuneyi depolama için -20 °C'de bırakın.
   NOT: RNA'yı, şu anda daha yaygın olarak anonim radyoaktiviteyi kaldırmak ve RNA arınması için hızlı ve daha uygun bir alternatif olarak kullanılan ticari olarak kullanılabilen spin sütunları kullanarak arındırın.
   DİkKAT: Radyoaktiviteden korunmak için akrilik cam kalkan, eldiven ve diğer önlemleri kullanın.

4. Protein bağlayıcı reaksiyon ve bağlı RNA ayrılması

1. Protein ve RNA'nın 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 hacminde 100 μL'lik bir hacimde bağlanmasını gerçekleştirin ve bu son konsantrasyonlara aşağıdaki maddeleri ekleyerek gerçekleştirin: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.09 μg/μL sığır serum albumini, 0.5 birim/μL RNasin, 0.15 μg/μL tNA , 1 mM EDTA ve uygun rekombinant protein (PTB) konsantrasyonu 30 μL. Uygun havuzdan RNA ekleyin.
   NOT: Birleştirme faktörü U2AF⁶⁵ genellikle yaklaşık 1-10 nM'lik bağlayıcı bir yakınlığa sahip model intronlarin polipimiridin-yolu/3' splice bölgelerine bağlanır. Bu nedenle, bağlayıcı ilk iki tur kullanılan protein konsantrasyonu 10 kat Üzerinde K_d U2AF⁶⁵için; SXL ve PTB proteinleri için, bu aralıktaki başlangıç konsantrasyonu sadece en iyi tahminimizdi. Bu, daha düşük yakınlık dizileri de potansiyel olarak bağlı olmasına rağmen, bağlanabilen istenilen RNA türlerini sağlamıştır. 3 ve 4. Bu art arda düşük yakınlık RNA türlerini ortadan kaldırmak için yapıldı.
2. 25 °C'de yaklaşık 30 dakika boyunca bağlayıcı reaksiyonlar içeren tüpleri bir sıcaklık bloğuna (veya buz üzerinde) yerleştirin.
3. Aşağıdaki adımları kullanarak seçim-amplifikasyon ilk 4 tur için bağlı RNA bağlı RNA fraksiyona.
   1. Numuneyi (100 μL) oda sıcaklığında vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreden süzün.
      NOT: RNA-protein kompleksi, ancak bağlı olmayan RNA, filtre üzerinde kalır.
   2. Tutulan RNA ile filtreyi steril bir jiletle parçalar halinde doğrayın; bunları bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Proteinaz K (PK) tamponuna batırılmış filtre parçalarıyla tüpü en az 3 saat (veya bir gecede) hafifçe yuvarlayarak RNA'yı kurtarın.
   3. RNA örneğini eşit hacimde fenol-kloroform (1:1) ve ardından kloroform un varlığında girdaplayarak deproteinize edin. Oda sıcaklığında 5 dakika yüksek hızda numunesantrifikasyon her zaman sulu faz kurtarın.
   4. Sodyum asetat (0,1 hacim 3,0 M, pH 5.2) ve etanol (2-3 hacim mutlak etanol, 200 kanıtı) ile karıştırın. Tüpü -80 °C'lik bir dondurucuda 30 dakika bekletin, 10 dakika yüksek hızda santrifüj edin ve yıkama ve kurutma adımlarını (3.8 adım) izleyerek, DEPC ile arıtılmış suda RNA'yı çözündürün. Bu adımlar yukarıda özetlenmiştir (3,6 ila 3,9 adımları).
4. Proteine bağlı RNA fraksiyonlarını son 2 turiçin bağlanmamış fraksiyonlardan (5 ve 6. Yüksek afinite bağlama dizilerini zenginleştirmek ve tercihen düşük afinite dizilerini kaldırmak için ek seçim basıncı için bağlayıcı reaksiyondaki protein konsantrasyonu (adım 4.1) üç kat daha azaltın.
   1. Yukarıdaki RNA:protein bağlama (adım 4.1) reaksiyonunu ayarlamadan önce 0.5x TBE tamponunda (Tris-Borate-EDTA) yerli poliakrilamid jeli (%5 ile 60:1 akrilamid:bis-akrilamid oranı) önceden atın. Bu jeli soğuk bir odada (4 °C) 15 dk için 250 V uygulayarak elektrofore edin.
   2. Pipet yukarıdaki RNA:protein bağlama reaksiyonları (adım 4.1) bu jel farklı kuyulara.
      NOT: Protein -80 °C'de depolanır ve 20 mM 4-(2-Hidroksietil)piperazin-1-etanesülfonik asit (HEPES), pH 8.0, %20 gliserol, 0.2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), %0.05 NP-40 ve 1 mM dithiothreitol (DTT). 0.5-1.0 mM proteaz inhibitörü fenilmetan sülfonil florür (PMSF) eklenmesi isteğe bağlıdır. Bağlayıcı reaksiyonda, Bu tampon yaklaşık katkıda 6% gliserol, ayrı bir jel yükleme tampon ile karıştırma gerek kalmadan kuyulara numunelerin doğrudan yüklenmesi sağlar.
   3. 250 V'de 250 V'de 1 ila 2 saat boyunca soğuk bir odada (4 °C) jel elektroforezkullanarak bağlanmamış RNA'dan bağlı RNA'yı kesirler. Bu süreç aynı zamanda jel hareketlilik vardiya sataşma olarak da bilinir.
      NOT: Elektroforez süresi RNA'nın özelliklerine ve bağlanmada kullanılan proteine bağlı olarak değişir.
   4. Jeli bir X-Ray filmine maruz bırakVe otoradyografi kullanarak bağlı RNA'nın yerini belirleyin. Bağlı RNA ile jel dilimikesi kesin ve bir tüp içine takın.
   5. 3 saat veya bir gecede elüsyon için kullanılan PK tampon ezilmiş jel dilim kuluçka.
   6. Yukarıda özetlenen 3,5 ile 3,9 adımlarını tekrarlayın. Kısaca, girdap eluted RNA örnek şiddetle önce fenol-kloroform ve daha sonra kloroform ile.
   7. Kloroform ekstraksiyonundan sonra sodyum asetat ve etanol ile sulu fazı karıştırın. -80 °C'lik dondurucuda kuluçkadan sonra, RNA peletini toplamak için 4 °C'de 5-10 dk döndürün. RNA peletini etanolle yıkayın ve tüpün kapağını açık bırakarak hava kurutun. RNA'yı DEPC ile arıtılmış suda çözün.
      NOT: Fraksiyoniçin jel mobilite kayması tadına geçiş, örneğin, ilk turda kullanılan nitroselüloz filtresine (veya herhangi bir matrise) bağlanmak için zenginleştirilmiş olabilecek istenmeyen RNA türlerinin ortadan kaldırılmasını sağlar.

5. Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu

1. 42 °C'de 20 μL reaksiyonu (2 μL 10x RT Tampon, 2 μL AMV ters transkriptaz, 1 μL ters astar, 10 μL RNA, RNa inhibitörü isteğe bağlı) kuluçkaya yatırarak ters transkriptaz ve ters astar kullanarak çözünmüş RNA'dan cDNA sentezin.
2. 2.1 adımda açıklandığı gibi 20-25 PCR döngüleri kullanarak cDNA'yı yükseltin.

6. Transkripsiyon ve protein bağlanması

1. Yukarıdaki bölüm 3-5'te açıklandığı gibi RNA sentezi, protein bağlanması, protein bağlı ve bağlı olmayan fraksiyonun ayrılması işlemini tekrarlayın.

7. RNA-protein etkileşimlerinin analizi

1. Her havuzda seçili havuzlar veya tek tek diziler için bağlayıcı yakınlık ve özgüllüğü belirlemek için jel mobilite kayması tayı (adım 4.4) veya filtre bağlama tayı (adım 4.3) kullanın (bkz. adım 8.3).
2. Bağlı kesir ve bağlı olmayan fraksiyondaki bantları tespit etmek ve ölçmek için otoradyografografi veya fosfor görüntüleyici kullanın.

8. Klonlama ve sıralama

1. Restriksiyon enzimleri Bcl1 ve HindIII ile son PCR DNA ürünlerini 1-2 saat sindirin, uygun şekilde sindirilmiş pGEM3 veya kısıtlama bölgelerini taşıyan diğer plazmidleri 2 saat ten geceye kadar sindirin, ligasyon ürünlerini yetkili bakteri hücrelerine dönüştürün standart moleküler biyoloji prosedürleri kullanılarak ısı şoku veya elektroporasyon¹³.
2. Luria-Bertani (LB) orta ve ampisilin (50 μg/mL) ile agar plakaları üzerinde dönüştürülmüş hücreleri 37 °C'de kaplama kalarak bakterileri bir gecede büyütün. LB sıvı orta ve ampisilin içeren kültür tüplerini aşılamak için kolonileri seçin ve bir gecede sallayarak bir kuluçka makinesinde 37 °C'de büyüyün. Standart plazmid izolasyon protokolü¹³kullanarak DNA kesici uçları içeren plazmid DNA'ları arındırın.
   NOT: Plazmid arınması için ticari kitler mevcuttur.
3. Dideoxy zincir sonlandırma protokolünü kullanarak, üreticinin¹⁴sıralama talimatını izleyerek plazmidleri DNA kesici uçlarla sırala.
   NOT: Sıralama evde yapılabilir veya ticari olarak yapılabilir.

9. Sıra hizalama

1. Mevcut çevrimiçi hizalama araçlarını kullanarak dizileri hizala ve konsensüs bağlama sitesi(ler) edinin
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

Sonuçlar

Aşağıdaki gözlemler başarılı seçim-amplifikasyon (SELEX) göstermektedir. İlk olarak, tekrarlayıcı seçilim-amplifikasyon yaklaşımı için kullanılan proteine bağlanmak için havuz 0 ve seçilen dizileri analiz ettik. Şekil 2, memeli polipirimidin yolu bağlayıcı proteininin (PTB) havuz 0 dizisine zar zor saptanabilir bir bağlanma gösterdiğini, ancak seçilen dizi havuzuna olan yakınlığın yüksek olduğunu göstermektedir. Seçilen ha...

Tartışmalar

Nükleik asit bağlayıcı proteinler hayvan ve bitki gelişiminin önemli düzenleyicileridir. SELEX prosedürü için önemli bir gereklilik protein bağlı ve bağlı olmayan RNA fraksiyonları ayırmak için kullanılabilecek bir titregeliştirilmesidir. Prensip olarak, bu töz filtre bağlayıcı tayoz, jel hareketlilik kayması tsay veya rekombinant proteinler, saflaştırılmış proteinler veya protein kompleksleri için bir matris bağlayıcı tsay¹⁹ gibi bir in vitro bağlayıcı tsay ol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard