Explorar el espacio de secuencia para identificar sitios de unión para proteínas reguladoras que unen el ARN

Resumen

La especificidad de la secuencia es fundamental para la regulación genética. Las proteínas reguladoras que reconocen secuencias específicas son importantes para la regulación genética. Definir sitios de unión funcional para tales proteínas es un problema biológico desafiante. Aquí se describe un enfoque iterativo para la identificación de un sitio de unión para una proteína de unión al ARN y es aplicable a todas las proteínas de unión al ARN.

Resumen

La regulación genética desempeña un papel importante en todas las células. Los pasos transcripcionales, post-transcripcionales (o procesamiento de ARN), traslacionales y post-traduccionales se utilizan para regular genes específicos. Las proteínas de unión a ácido nucleico específicas de la secuencia se dirigen a secuencias específicas para controlar la expresión génica espacial o temporal. Los sitios de unión en los ácidos nucleicos se caracterizan típicamente por el análisis mutacional. Sin embargo, numerosas proteínas de interés no tienen un sitio de unión conocido para tal caracterización. Aquí describimos un enfoque para identificar sitios de unión previamente desconocidos para proteínas de unión al ARN. Implica la selección iterativa y la amplificación de secuencias a partir de un grupo de secuencias aleatorio. Después de varias rondas de estos pasos de transcripción, enlace y amplificación, las secuencias enriquecidas se secuencian para identificar un sitio o sitios de enlace preferidos. El éxito de este enfoque se supervisa mediante ensayos de unión in vitro. Posteriormente, se pueden utilizar ensayos funcionales in vitro e in vivo para evaluar la relevancia biológica de las secuencias seleccionadas. Este enfoque permite la identificación y caracterización de un sitio o sitios de unión previamente desconocidos para cualquier proteína de unión al ARN para la cual existe un ensayo para separar los ARN unidos a proteínas y sin unir.

Introducción

En la biología celular, la regulación genética juega un papel central. En uno o varios pasos a lo largo de la vía de expresión génica, los genes tienen el potencial de ser regulados. Estos pasos incluyen transcripción (iniciación, alargamiento y terminación), así como empalme, poliadenilación o formación final de 3', exportación de ARN, traducción de ARNm y decaimiento/localización de transcripciones primarias. En estos pasos, las proteínas de unión a ácido nucleico modulan la regulación genética. La identificación de sitios de unión para tales proteínas es un aspecto importante del estudio del control genético. El análisis mutacional y la comparación de secuencias filogenéticas se han utilizado para descubrir secuencias reguladoras o sitios de unión a proteínas en ácidos nucleicos, como promotores, sitios de empalme, elementos de poliadenilación y señales traslacionales^{1, 2 , 3 , 4}.

El empalme pre-mRNA es un paso integral durante la expresión y regulación del gen. La mayoría de los genes de mamíferos, incluidos los de los seres humanos, tienen intrones. Una gran fracción de estas transcripciones se empalma alternativamente, produciendo múltiples isoformas de ARNm y proteínas del mismo gen o transcripción primaria. Estas isoformas tienen funciones específicas de la célula y del desarrollo en la biología celular. El sitio de empalme de 5', el punto de bifurcación y el sitio de empalme polypyrimidine-tract/3' son señales de empalme críticas que están sujetas a regulación. En la regulación negativa, se reprime un sitio de empalme fuerte, mientras que en la regulación positiva se activa un sitio de empalme débil. Una combinación de estos eventos produce una plétora de isoformas funcionalmente distintas. Las proteínas de unión al ARN desempeñan un papel clave en estos eventos de empalme alternativo.

Numerosas proteínas se conocen cuyos sitios de unión o dianas de ARN permanecen por identificar^5,6. Vincular las proteínas reguladoras a sus objetivos biológicos o secuencias aguas abajo es a menudo un proceso complejo. Para estas proteínas, la identificación de su ARN objetivo o sitio de unión es un paso importante en la definición de sus funciones biológicas. Una vez que se identifica un sitio de unión, se puede caracterizar mediante análisis moleculares y bioquímicos estándar.

El enfoque descrito aquí tiene dos ventajas. En primer lugar, puede identificar un sitio de unión previamente desconocido para una proteína de interés. En segundo lugar, una ventaja añadida de este enfoque es que simultáneamente permite la mutagénesis de saturación, que de otro modo sería laboriosa para obtener información comparable sobre los requisitos de secuencia dentro del sitio de enlace. Por lo tanto, ofrece una herramienta más rápida, fácil y menos costosa para identificar sitios de unión a proteínas en el ARN. Originalmente, este enfoque (SELEX o Evolución Sistemática de los Ligandos por enriquecimiento EXponential) se utilizó para caracterizar el sitio de unión para la bacteriófago T4 ADN polimerasa (proteína gen 43), que se superpone con el sitio de unión ribosoma en su propio ARNm. El sitio de enlace contiene una secuencia de bucle de 8 bases, que representa 65.536 variantes aleatorias para el análisis^7. En segundo lugar, el enfoque también se utilizó de forma independiente para mostrar que se pueden seleccionar sitios deenlace o aptámeros específicos para diferentes colorantes de un grupo de aproximadamente 10¹³ secuencias 8. De hecho, este enfoque se ha utilizado ampliamente en muchos contextos diferentes para identificar aptámeros (secuencias de ARN o ADN) para unirnumerosos ligandos, como proteínas, moléculas pequeñas y células, y para la catálisis 9. Por ejemplo, un aptámero puede discriminar entre dos derivados de la xantina, la cafeína y la teofilina, que difieren por la presencia de un grupo metilo en la cafeína^10. Hemos utilizado ampliamente este enfoque (SELEX o selección iterativa-amplificación) para estudiar cómo funcionan las proteínas de unión al ARN en la regulación¹¹de empalme o empalme, que será la base de la discusión a continuación.

La biblioteca aleatoria: Usamos una biblioteca aleatoria de 31 nucleótidos. La consideración de longitud para la biblioteca aleatoria se basó libremente en la idea de que el factor de empalme general U2AF⁶⁵ se une a una secuencia entre la secuencia de punto de bifurcación y el sitio de empalme de 3'. En promedio, el espaciado entre estas señales de empalme en metazoos está en el rango de 20 a 40 nucleótidos. Otra proteína Sex-lethal era conocido por unirse a una secuencia reguladora mal caracterizada cerca del sitio de empalme de 3' de su objetivo pre-mRNA, transformador. Por lo tanto, elegimos una región aleatoria de 31 nucleótidos, flanqueados por sitios de unión de imprimación con sitios de enzimas de restricción para permitir la amplificación de PCR y la unión del promotor de la polimerasa de ARN T7 para la transcripción in vitro. El tamaño o la complejidad de la biblioteca teórica era de 4³¹ o aproximadamente 10^18. Usamos una pequeña fracción de esta biblioteca para preparar nuestra piscina de ARN aleatoria (10¹²-10¹⁵) para los experimentos que se describen a continuación.

Protocolo

NOTA: La Figura 1 proporciona un resumen de los pasos clave en el proceso de selección-amplificación iterativa (SELEX).

1. Generación de una plantilla de biblioteca aleatoria

1. Sintetizar la imprimación delantera 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' y la imprimación inversa 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' por síntesis química en un sintetizador de ADN.
   NOTA: Las imprimaciones y la biblioteca aleatoria se pueden sintetizar comercialmente.
2. Sintetizar una plantilla de oligonucleótido biblioteca aleatoria 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N₁... N₃₁)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' por síntesis química. Utilice una mezcla equimolar de cuatro fosforamiditas durante la síntesis para las 31 posiciones aleatorias mostradas anteriormente como N.
   NOTA: La secuencia de la plantilla de biblioteca contiene 31 nucleótidos aleatorios (N1 a N31) y secuencias de flanqueo para la unión de las imprimaciones delantera sano e inversa. La imprimación directa incluye la secuencia promotora de la polimerasa de ARN T7 (subrayada) para la transcripción in vitro y un sitio de restricción Bcl1 (en cursiva) para la clonación. La imprimación inversa contiene los sitios de enzimas de restricción BamH1 y HindIII (en cursiva) para facilitar la clonación.

2. Generación de la piscina de bibliotecas aleatorias de ADN

1. Adjunte el promotor de la polimerasa de ARN T7 a la biblioteca por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que contenga una plantilla de biblioteca aleatoria de ADN de 1 m, 1 M de cada imprimación, Tris de 20 mM (pH 8,0), MgCl₂de 1,5 mM, KCl de 50 mM, albúmina de suero bovino aceilado de 0,1 g/L, 2 unidades de Taq< /c1> polimerasa, y 200 m cada uno de dNtPs (desoxiguanosina, desoxiadenosina, desoxicitotidina y trifosfato de desoxitimidina).
2. Utilizar cinco ciclos de desnaturalización, recocido y pasos de extensión (94 oC durante 1 min, 53 oC durante 1 min y 72 oC durante 1 min) de PCR seguidos de un ciclo de extensión (72 oC durante 10 min).

3. Síntesis del ARN de la piscina 0

1. Configure una reacción de transcripción de 100 l¹². Mezclar tampón de transcripción T7, 1 M de ADN de la piscina de biblioteca aleatoria, ditiothreitol de 5 mM (TDT), trifosfato de guanosina de 2 mM (GTP), 1 mM cada uno de trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de citidina (CTP) y trifosfato de uridina (UTP) y 2 unidades/L T7 de ARNpoliasa.
   NOTA: El ARN se puede transcribir in vitro utilizando kits disponibles comercialmente con una opción de la polimerasa de ARN T7 o SP6.
2. Incubar la mezcla de reacción anterior en un tubo de microcentrífuga durante 2 h a 37 oC.
3. Gel purifica el ARN en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10%.
4. Identificar la ubicación de las transcripciones en el gel tintándolo con azul de metileno o autoradiografía incluyendo rastros de radiactividad (0,5 l o menos de UTP de³²P) en la reacción de transcripción.
   1. Coloque la rodaja de gel en un tubo centrífugo y rompa en trozos más pequeños, por ejemplo, con una punta homogeneizadora. Añadir tampón de proteinasa K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% sulfato de dodecilo sódico) para sumergir las piezas de gel. Deje el tubo en un nutator de 2 h hasta pernoctar a temperatura ambiente.
5. Girar en una microcentrífuga de alta velocidad (14.000 rpm o 16.873 x g) durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos de gel y recuperar la solución tampón.
6. Vortex la muestra dos veces con un volumen igual de fenol-cloroformo y una vez con cloroformo.
7. Mezclar la fase acuosa desde arriba con un décima parte de acetato de sodio (3,0 M, pH 5,2), 10 g de ARNm o 20 g de glucógeno, y etanol (2-3 volúmenes, almacenados a -20 oC). Dejar los tubos a -80oC durante 1 h.
8. Girar los tubos que contienen la solución durante 5-10 min a 4 oC en una microcentrífuga (14.000 rpm o 16.873 x g). Deseche el sobrenadante cuidadosamente. Enjuague el pellet de ARN con 70% de etanol y gire durante 2-5 min. Aspirar el etanol con cuidado. Seque al aire el pellet de ARN.
9. Solubilizar el pellet de ARN en 50 l de agua tratada con pircarbonato dietílico (DEPC). Deje la muestra a -20 oC para el almacenamiento.
   NOTA: Purificar el ARN utilizando columnas de espín disponibles comercialmente, que actualmente se utilizan más comúnmente para eliminar la radiactividad no incorporada y servir como una alternativa rápida y más conveniente para la purificación del ARN.
   ADVERTENCIA: Utilice un escudo de vidrio acrílico, guantes y otras precauciones para protegerse de la radiactividad.

4. Reacción de unión a proteínas y separación del ARN unido

1. Llevar a cabo la unión de proteínas y ARN en 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 en un volumen de 100 l añadiendo los siguientes ingredientes a estas concentraciones finales: 50 mM KCl, 1 mM de TDT, 0,09 g/L de albúmina de suero bovino, 0,5 unidades/L de RNasin, 0,15 g/L de tRNA , 1 mM de EDTA y 30 ml de concentración adecuada de proteína recombinante (PTB). Agregue el ARN de la piscina apropiada.
   NOTA: El factor de empalme U2AF⁶⁵ normalmente se une a los sitios de empalme de polipirimidina-tracto/3' de los intrones del modelo con una afinidad de unión (constante de disociación de equilibrio o K_d) de aproximadamente 1–10 nM. Por lo tanto, las dos primeras rondas de unión utilizaron la concentración de proteína 10 veces por encima de la K_d para U2AF⁶⁵; para las proteínas SXL y PTB, la concentración inicial en este rango fue sólo nuestra mejor conjetura. Esto aseguró que las especies de ARN deseadas que pudieran unirse, aunque las secuencias de afinidad más bajas también podrían estar potencialmente unidas. En las rondas 3 y 4 (transcripción, unión y amplificación), la concentración de proteínas se redujo tres veces (Paso 4.1). Esto se hizo para eliminar sucesivamente las especies de ARN de baja afinidad.
2. Colocar los tubos que contienen las reacciones de unión durante unos 30 minutos a 25 oC en un bloque de temperatura (o sobre hielo).
3. Fraccionar el ARN enlazado del ARN no enlazado durante las primeras 4 rondas de selección-amplificación siguiendo los siguientes pasos.
   1. Filtrar la muestra (100 l) a temperatura ambiente a través de un filtro de nitrocelulosa unido a un colector de vacío.
      NOTA: El complejo de proteína de ARN, pero no el ARN no enlazado, permanece en el filtro.
   2. Cortar el filtro con ARN retenido en fragmentos con una cuchilla de afeitar estéril; insertarlos en un tubo de centrífuga. Recuperar el ARN cayendo el tubo suavemente durante un mínimo de 3 h (o durante la noche) con piezas de filtro sumergidas en el tampón de proteinasa K (PK).
   3. Desproteinizar la muestra de ARN vórtina en presencia de un volumen igual de fenol-cloroformo (1:1) y luego de cloroformo. Recupere la fase acuosa cada vez centrifugando la muestra a alta velocidad durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   4. Mezclar con acetato de sodio (0,1 volumen de 3,0 M, pH 5,2) y etanol (2-3 volúmenes de etanol absoluto, a prueba de 200). Dejar el tubo en un congelador de -80 oC durante 30 minutos, centrifugarlo a alta velocidad durante 10 minutos y, siguiendo los pasos de lavado y secado (paso 3.8), solubilizar el ARN en agua tratada con DEPC. Estos pasos se describen anteriormente (pasos 3.6 a 3.9).
4. Separe las fracciones de ARN ligadas a proteínas de las fracciones no enlazadas para las últimas 2 rondas (rondas 5 y 6; transcripción, unión y amplificación) de la siguiente manera. Reduzca la concentración de proteínas en la reacción de unión (paso 4.1) por tres veces más para una presión de selección adicional para enriquecer las secuencias de unión de alta afinidad y eliminar preferentemente las secuencias de baja afinidad.
   1. Pre-fundó un gel de poliacrilamida nativo (5% con 60:1 relación acrilamida:bis-acrilamida) en un tampón TBE de 0,5x (Tris-Borate-EDTA) antes de configurar la reacción de ARN:proteína-unión anterior (paso 4.1). Electroforrese este gel en una cámara frigorífica (4oC) aplicando 250 V durante 15 min.
   2. Pipetear las reacciones de unión de proteínas:ARN anteriores (paso 4.1) en diferentes pozos de este gel.
      NOTA: La proteína se almacena a -80 oC y se diluye antes de su uso en 20 mM 4-(2-Hidroxietilo)piperazina-1-ácido etanesulfónico (HEPES), pH 8,0, 20% glicerol, 0,2 mM ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), 0,05% NP-40 y 1 mM de dithiothreititita( DTT). La adición de 0.5–1.0 mM inhibidor de la proteasa fenilmetano fluoruro de sulfonil (PMSF) es opcional. En la reacción de unión, este tampón aporta alrededor del 6% de glicerol, lo que permite la carga directa de muestras en los pozos sin necesidad de mezclarlas con un tampón de carga de gel separado.
   3. Fraccionar el ARN unido del ARN no unido utilizando electroforesis de gel en una cámara fría (4 oC) a 250 V durante 1 a 2 h. Este proceso también se conoce como ensayo de cambio de movilidad en gel.
      NOTA: La duración de la electroforesis varía en función de las características del ARN y la proteína utilizada para la unión.
   4. Exponga el gel a una película de rayos X e identifique la ubicación del ARN enlazado mediante autoradiografía. Corte la rebanada de gel con el ARN unido e insértela en un tubo.
   5. Incubar la rodaja de gel triturada en el tampón PK utilizado para la elución durante 3 h o durante la noche.
   6. Repita los pasos 3.5 a 3.9 descritos anteriormente. Brevemente, vórtice la muestra de ARN eluida vigorosamente primero con fenol-cloroformo y luego con cloroformo.
   7. Mezclar acetato de sodio y etanol con la fase acuosa después de la extracción de cloroformo. Después de la incubación en el congelador de -80 oC, girar a 4 oC durante 5-10 min para recoger el pellet de ARN. Lave el pellet de ARN con etanol y séquelo al aire dejando la tapa del tubo abierta. Disolver el ARN en agua tratada con DEPC.
      NOTA: Cambiar al ensayo de cambio de movilidad de gel para fraccionamiento permite la eliminación de especies de ARN no deseados que podrían haber sido enriquecidas para unirse, por ejemplo, al filtro de nitrocelulosa aquí (o a cualquier matriz) utilizado en las rondas iniciales para el fraccionamiento.

5. Transcripción inversa y amplificación de PCR

1. Sintete el ADNc a partir del ARN disuelto utilizando la transcriptasa inversa y la imprimación inversa incubando la reacción de 20 l (2 l de tampón RT de 10x, 2 ml de transcriptasa inversa AMV, imprimación inversa de 1 M, 10 ml de ARN, inhibidor de la rnalosa opcional) a 42 oC durante 60 min.
2. Amplifique el ADNc utilizando ciclos de PCR de 20 a 25, como se describe en el paso 2.1.

6. Transcripción y unión a proteínas

1. Repetir el proceso de síntesis de ARN, unión a proteínas, separación de proteína sin unir y fracción no unida, como se describe en la sección 3–5 anterior.

7. Análisis de las interacciones ARN-proteína

1. Utilice el ensayo de desplazamiento de movilidad de gel (paso 4.4) o el ensayo de unión de filtro (paso 4.3) para determinar la afinidad y especificidad de unión para agrupaciones seleccionadas o secuencias individuales dentro de cada grupo (consulte el paso 8.3).
2. Utilice la autoradiografía o un imager de fósforo para detectar y cuantificar las bandas en la fracción enlazada y la fracción no enlazada.

8. Clonación y secuenciación

1. Digerir el producto final de ADN PCR con enzimas de restricción Bcl1 y HindIII durante 1–2 h, ligada con el pGEM3 adecuadamente digerido u otros plásmidos que transportan los sitios de restricción de 2 h a la noche, transformar el producto de ligación en células bacterianas competentes por choque de calor o electroporación utilizando procedimientos de biología molecular estándar¹³.
2. Cultivar las bacterias durante la noche enchapando las células transformadas en placas de agar con medio luria-bertani (LB) y ampicilina (50 g/ml) a 37 oC. Recoger colonias para inocular tubos de cultivo que contengan medio líquido LB con ampicilina y crecer a 37 oC en una incubadora de temblores durante la noche. Purificar los ADN plásmidos que contienen inserciones de ADN utilizando un protocolo de aislamiento plásmido estándar¹³.
   NOTA: Los kits comerciales están disponibles para purificación de plásmidos.
3. Secuenciar los plásmidos con inserciones de ADN utilizando el protocolo de secuenciación de terminación de cadena dideoxi, siguiendo las instrucciones del fabricante para la secuenciación¹⁴.
   NOTA: La secuenciación se puede realizar en casa o hacer comercialmente.

9. Alineación de la secuencia

1. Alinee las secuencias y obtenga un sitio o sitios de enlace de consenso utilizando las herramientas de alineación en línea disponibles
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

Resultados

Las siguientes observaciones demuestran una selección-amplificación exitosa (SELEX). En primer lugar, analizamos la agrupación 0 y las secuencias seleccionadas para unirse a la proteína utilizada para el enfoque iterativo de selección-amplificación. La Figura 2 muestra que la proteína de unión de tracto de polipirimidina (PTB) de mamíferos muestra una unión apenas detectable a la secuencia del grupo 0, pero una alta afinidad para el grupo de secuenc...

Discusión

Las proteínas de unión a ácido sulfúrico son reguladores importantes del desarrollo animal y vegetal. Un requisito clave para el procedimiento SELEX es el desarrollo de un ensayo que se puede utilizar para separar las fracciones de ARN unidas a proteínas y no unidas. En principio, este ensayo puede ser un ensayo de unión in vitro, como el ensayo de unión al filtro, el ensayo de cambio de movilidad de gel o un ensayo de unión de matriz¹⁹ para proteínas recombinantes, proteínas purificadas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard