Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков

Резюме

Специфика последовательности имеет решающее значение для регуляции генов. Регуляторные белки, распознающие определенные последовательности, важны для регуляции генов. Определение функциональных связывающих участков для таких белков является сложной биологической проблемой. Итеративный подход к идентификации связывающего участка для РНК-связывающего белка описан здесь и применим ко всем БЕЛКАм-связывающим РНК.

Аннотация

Регуляция генов играет важную роль во всех клетках. Транскрипционные, посттранскрипционные (или РНК обработки), переводные и пост-трансляционные шаги используются для регулирования конкретных генов. Последовательность конкретных нуклеиновых кислот-связывающих белков целевой конкретных последовательностей для контроля пространственной или временной экспрессии генов. Места связывания нуклеиновых кислот, как правило, характеризуются мутационным анализом. Тем не менее, многочисленные белки, представляющие интерес не имеют известного места связывания для такой характеристики. Здесь мы описываем подход к выявлению ранее неизвестных мест связывания РНК-связывающих белков. Она включает в себя итеративный отбор и усиление последовательностей, начиная с рандомизированного пула последовательности. После нескольких раундов этих шагов-транскрипции, связывания и усиления-обогащенных последовательностей секвенируются для определения предпочтительного места связывания (ы). Успех этого подхода контролируется с помощью анализов привязки in vitro. Впоследствии, in vitro и in vivo функциональные анализы могут быть использованы для оценки биологической значимости выбранных последовательностей. Этот подход позволяет идентифицировать и характеристики ранее неизвестного места связывания (ы) для любого РНК-связывающего белка, для которого существует анализ на отделение белковых и несвязанных РНК.

Введение

В клеточной биологии центральную роль играет регуляция генов. На одном или нескольких шагах вдоль пути экспрессии генов гены могут регулироваться. Эти шаги включают транскрипцию (инициация, удлинение и прекращение), а также сплайсинг, полиаденилацию или 3' конечную формацию, экспорт РНК, перевод мРНК и распад/локализацию первичных транскриптов. На этих этапах нуклеиновые кислотно-связывающие белки модулируют регуляцию генов. Определение связывающих участков для таких белков является важным аспектом изучения генного контроля. Мутационный анализ и сравнение филогенетической последовательности были использованы для обнаружения регулятивных последовательностей или белково-связывающих сайтов в нуклеиновых кислот, таких как промоутеры, сращивания сайтов, полиаденелизационных элементов, и трансляционные сигналы^{1, 2 , 3 , 4}.

Предварительное сращивание является неотъемлемым шагом при экспрессии и регуляции генов. Большинство генов млекопитающих, в том числе у людей, имеют интроны. Большая часть этих транскриптов альтернативно сращиваются, производя несколько мРНК и белковых изоформ из одного и того же гена или первичного транскрипта. Эти изоформы имеют клеточную и развитую роль в клеточной биологии. 5' сращивания сайта, ветвь-точка, и полипиримидин тракта / 3 ' сращивания сайт критических сигналов сращивания, которые подлежат регулированию. В отрицательном регулировании, в противном случае сильное место сращивания репрессировано, тогда как в положительном регулировании в противном случае слабое место сращивания активировано. Сочетание этих событий производит множество функционально различных изоформ. РНК-связывающие белки играют ключевую роль в этих альтернативных событиях сращивания.

Многочисленные белки известны, чьи цели связывания (ы)или РНК-мишени остаются идентифицированными 5,⁶. Связывание регулятивных белков с их биологическими целями или последовательностями вниз по течению часто является сложным процессом. Для таких белков определение их целевой РНК или места связывания является важным шагом в определении их биологических функций. Как только место связывания идентифицировано, его можно дополнительно охарактеризовать с помощью стандартных молекулярных и биохимических анализов.

Описанный здесь подход имеет два преимущества. Во-первых, он может определить ранее неизвестный сайт связывания для белка, представляющих интерес. Во-вторых, дополнительным преимуществом этого подхода является то, что он одновременно позволяет мутагенеза насыщения, который в противном случае был бы трудоемким для получения сопоставимой информации о требованиях последовательности в пределах связывающего сайта. Таким образом, он предлагает более быстрый, простой и менее дорогостоящий инструмент для определения мест связывания белка в РНК. Первоначально этот подход (SELEX или систематическая эволюция лигандов eXponential обогащения) был использован для характеристики связывающего места для бактериофага T4 ДНК полимераза (ген 43 белка), который перекрывается с рибосомой связывания сайта в своей собственной мРНК. Обязательный сайт содержит 8-базовую последовательность цикла, представляющую 65 536 рандомизированных вариантов для анализа⁷. Во-вторых, этот подход также независимо использовался для того, чтобы показать, что из пула примерно 10¹³ последовательностей^можновыбрать определенные места связывания или аптамеров для различных красителей. В самом деле, этот подход был широко используется во многих различных контекстах для выявления aptamers (РНК или последовательности ДНК) для связывания многочисленных лигандов, таких как белки, маленькие молекулы и клетки, и для катализа⁹. Например, аптамер может различать два производных ксантина, кофеин и теофиллин, которые отличаются наличием одной метиловой группы в кофеине¹⁰. Мы широко использовали этот подход (SELEX или итеративный отбор-усиление) для изучения того, как РНК-связывающие белки функционируют в сращивании или сращивании регулирования¹¹, который будет основой для обсуждения ниже.

Случайная библиотека: Мы использовали случайную библиотеку из 31 нуклеотидов. Рассмотрение длины случайной библиотеки было слабо основано на идее, что общий коэффициент сращивания U2AF⁶⁵ связывается с последовательностью между последовательностью ветвя- точек и 3' сращивания сайта. В среднем расстояние между этими сплайсинг-сигналами у метазоанов составляет от 20 до 40 нуклеотидов. Другой белок Секс-смертельный, как известно, связываются с плохо характеризуется нормативной последовательности вблизи 3' сращивания сайте своей цели до мРНК, трансформатор. Таким образом, мы выбрали случайную область из 31 нуклеотидов, в окружении грунтовых связывающих участков с местами ограничения фермента, чтобы обеспечить усиление ПЦР и крепление промоторизатора T7 РНК-полимераза для транскрипции in vitro. Теоретический размер или сложность библиотеки составили 4³¹ или приблизительно 10^18. Мы использовали небольшую часть этой библиотеки, чтобы подготовить наш случайный пул РНК (10¹²-10¹⁵) для экспериментов, описанных ниже.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлено резюме ключевых шагов в процессе итеративного отбора (SELEX).

1. Генерация случайного шаблона библиотеки

1. Синтезировать переднюю грунтовку 5'- GTAATACGACTACTACTATAGGGTGATCAGATTCA GATTCTGATCTGATCA-3' и обратный грунт 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' путем химического синтеза на синтезаторе ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: праймеры и случайная библиотека могут быть синтезированы на коммерческой уровне.
2. Синтезировать случайные библиотеки олигонуклеотид шаблон 5'- GGTGATCAGATCtGATCTGATCCA (N₁... N₃₁)TGAAGCTTGGATCCGTCGCCC-3' по химическому синтезу. Используйте эквимолярную смесь из четырех фосфорамититов во время синтеза для 31 рандомизированных позиций, показанных выше как N.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность шаблона библиотеки содержит 31 случайный нуклеотидов (N1 к N31) и фланговые последовательности для связывания передних и обратных грунтовок. Передняя грунтовка включает в себя T7 РНК полимераза промоутер последовательности (подчеркнуто) для транскрипции в пробирке и ограничение сайта Bcl1 (курсив) для клонирования. Обратный грунт содержит места ограничения фермента BamH1 и HindIII (курсивом) для облегчения клонирования.

2. Поколение случайного пула библиотеки ДНК

1. Прикрепите промоутер Полимеразы T7 РНК к библиотеке путем полимеразной цепной реакции (PCR), содержащей 1 шаблон случайной библиотеки ДНК, 1 мкм каждой грунтовки, 20 мМ Трис (pH 8.0), 1,5 мМ MgCl₂, 50 мм KCl, 0,1 мкг/мл acetylated бычья сывороточная альбомие (кв. м. полимераза) и 200 мКМ каждый из dNTPs (деоксигуанозин, дезоксиаденозин, дезоксицитидин и дезокситимин трифосфат).
2. Используйте пять циклов денатурации, аннулирования и расширения шагов (94 кв. м в течение 1 мин, 53 кв. c в течение 1 мин, и 72 КК в течение 1 мин) ПЦР с последующим одним циклом расширения (72 кв. м в течение 10 мин).

3. Синтез пула 0 РНК

1. Настройка 100 реакции транскрипции¹². Смешайте буфер транскрипции T7, 1 ММ случайный библиотечный пул ДНК, 5 мМ дитиотрийтол (DTT), 2 мМ гуанозин трифосфат (GTP), 1 мМ каждый из аденозинтрифосфата (АТФ), цитидин трифосфат (CTP), и уридин трифосфат (UTP), и 2 единицы/
   ПРИМЕЧАНИЕ: РНК может быть транскрибирована в пробирке с использованием коммерчески доступных комплектов с опцией T7 или SP6 РНК-полимераза.
2. Инкубировать вышеупомянутую реакционную смесь в микроцентрифуговой трубке в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
3. Гель очищает РНК в 10% денатурируя полиакриламидгель.
4. Определите расположение транскриптов на геле, окрашивая его метиленовым синим или ауторадиографией, включив в транскрипционную реакцию следы радиоактивности (0,5 л или менее q-³²P UTP).
   1. Поместите ломтик геля в центрифугу трубки и разбить на более мелкие кусочки, например, с гомогенизатором кончиком. Добавьте буфер протеиназа K (PK) (100 мм Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 12,5 мМ EDTA, 1% сульфат натрия додецил), чтобы погрузить кусочки геля. Оставьте трубку на nutator от 2 ч до ночи при комнатной температуре.
5. Спин в высокоскоростной микроцентрифуге (14 000 об/мин или 16 873 х г) в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы удалить гель мусора и восстановить буферный раствор.
6. Vortex образца два раза с равным объемом фенол-хлороформ и один раз с хлороформом.
7. Смешайте аквистную фазу сверху с одной десятой объемом ацетата натрия (3,0 М, рН 5,2), 10 мкг трна кв. или 20 мкг гликогена и этанола (2-3 тома, хранящегося при -20 градусах Цельсия). Оставьте трубки при -80 градусах по Цельсию на 1 ч.
8. Спин трубки, содержащие раствор в течение 5-10 мин при 4 c в микроцентрифуге (14000 об/мин или 16 873 х г). Откажитесь от супернатанта осторожно. Промыть РНК гранулы с 70% этанола и спина в течение 2-5 мин. Аспир этанол тщательно. Воздух высушивает гранулы РНК.
9. Растворить гранулы РНК в 50 л воды, обработанной диэтил-пирокарбонатом (DEPC). Оставьте образец на уровне -20 градусов для хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка РНК с помощью коммерчески доступных спиновых столбцов, которые в настоящее время чаще используются для удаления неинкорпорированной радиоактивности и служат быстрой и более удобной альтернативой для очистки РНК.
   ВНИМАНИЕ: Используйте акриловый стеклянный щит, перчатки и другие меры предосторожности для защиты от радиоактивности.

4. Белковая связывающая реакция и разделение связанной РНК

1. Провести связывание белка и РНК в 10 мм Tris-HCl, рН 7,5 в объеме 100 л, добавив следующие ингредиенты к этим конечным концентрациям: 50 мМ ККЛ, 1 мМ ДТТ, 0,09 мкг/л бычьей сыворотки альбумина, 0,5 единиц/Л. , 1 мМ EDTA, и 30 л соответствующей рекомбинантного белка (ПТБ) концентрации. Добавьте РНК из соответствующего пула.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фактор сплайсинга U2AF⁶⁵ обычно связывается с полипиримидином тракта/3' сращивания сайтов моделей интронов с связывающей близостью (равновесная диссоциация константа или K_d) примерно 1-10 нм. Таким образом, в первых двух раундах связывания использовалась концентрация белка в 10 раз выше K_d для U2AF^65; для белков SXL и PTB, начальная концентрация в этом диапазоне была только нашей лучшей догадкой. Это обеспечило что пожеланные виды RNA которые смогли связать, хотя более низкие последовательности сродства также потенциально связаны. В раундах 3 и 4 (транскрипция, связывание и усиление) концентрация белка была снижена в три раза (шаг 4.1). Это было сделано для последовательного устранения низкого сродства РНК видов.
2. Поместите трубки, содержащие связывающие реакции в течение примерно 30 мин при температурном блоке (или на льду).
3. Фракция связанной РНК из несвязанной РНК в течение первых 4 раундов отбора-усиления с помощью следующих шагов.
   1. Фильтр образец (100 л) при комнатной температуре через фильтр нитроцеллюлозы, прикрепленный к вакуумному многообразию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-белковый комплекс, но не несвязанная РНК, остается на фильтре.
   2. Нарезать фильтр с сохраненной РНК на фрагменты стерильным лезвием бритвы; вставьте их в центрифугу трубки. Восстановление РНК, акробатика трубки мягко в течение как минимум 3 ч (или на ночь) с фильтром штук погружен в proteinase K (PK) буфера.
   3. Депротеинизация образца РНК путем вихря его в присутствии равного объема фенол-хлороформ (1:1), а затем хлороформа. Восстановление водной фазы каждый раз, центрифугировании образца на высокой скорости в течение 5 минут при комнатной температуре.
   4. Смешайте его с ацетатом натрия (0,1 тома 3,0 М, рН 5,2) и этанолом (2-3 тома абсолютного этанола, 200 доказательств). Оставьте трубку в морозильной камере -80 градусов в течение 30 минут, центрифуги его на высокой скорости в течение 10 минут, и, после стирки и сушки шаги (шаг 3.8), улавливать РНК в воде, обработанной DEPC. Эти шаги изложены выше (шаги от 3,6 до 3,9).
4. Отделите белковые фракции РНК от несвязанных фракций за последние 2 раунда (раунды 5 и 6; транскрипция, связывание и усиление) следующим образом. Уменьшите концентрацию белка в связывающей реакции (шаг 4.1) еще в три раза для дополнительного давления отбора, чтобы обогатить высокосродность связывающих последовательностей и преференциально удалить с низким содержанием последовательности.
   1. Предварительно отливайте родной полиакриламидный гель (5% с коэффициентом 60:1 акриламида:bis-acrylamide) в 0,5-x буфере TBE (Tris-Borate-EDTA) до создания вышеуказанной реакции РНК:белково-связывающей (шаг 4.1). Электрофоризирующий этот гель в холодной комнате (4 градуса По Цельсию), применяя 250 В в течение 15 мин.
   2. Pipette выше RNA: реакции связывания протеина (шаг 4.1) в по-разному наилучшим образом этого геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок хранится при -80 градусах Цельсия и разбавляется перед использованием в 20 мМ 4-(2-Гидроксиэтил)пиперазин-1-этанесульфоновая кислота (HEPES), pH 8.0, 20% глицерола, 0,2 мм этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), 0,05% НП-40 и 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ). Добавление 0,5-1,0 мм ингибитор протеазы фенилметана сульфонил фтора (PMSF) является необязательным. В связывающей реакции, этот буфер способствует около 6% глицерола, что позволяет прямой загрузки образцов в скважины без необходимости смешивания их с отдельным буфером гель-загрузки.
   3. Фракция связанной РНК от несвязанной РНК с помощью геля электрофореза в холодной комнате (4 КК) при 250 В для 1 до 2 ч. Этот процесс также известен как гель мобильности сдвиг асссе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность электрофореза варьируется в зависимости от особенностей РНК и белка, используемого для связывания.
   4. Выставить гель на рентгеновскую пленку и определить местоположение связанной РНК с помощью авториграфии. Вырежьте ломтик геля с связанной РНК и вставьте его в трубку.
   5. Инкубировать измельченный ломтик геля в буфере PK, используемом для elution в течение 3 ч или на ночь.
   6. Повторите шаги от 3,5 до 3,9, изложенные выше. Короче говоря, вихрь eluted РНК образца энергично сначала с фенол-хлороформ, а затем с хлороформом.
   7. Смешайте ацетат натрия и этанол с водной фазой после извлечения хлороформа. После инкубации в морозильной камере -80 градусов, вращайтесь при 4 градусах по Цельсию в течение 5-10 мин, чтобы собрать гранулы РНК. Вымойте РНК гранулы с этанолом и просушить воздух, оставив крышку трубки открытой. Растворите РНК в воде, обработанной DEPC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переход на анализ смещения подвижности геля для фракционирования позволяет ликвидировать нежелательные виды РНК, которые могли бы быть обогащены для связывания, например, с фильтром нитроцеллюлозы здесь (или любой матрицы), используемой в первоначальных раундах для фракционирования.

5. Обратная транскрипция и усиление ПЦР

1. Синтезировать кДНК из растворенного РНК с помощью обратной транскриптазы и обратной грунтовки путем инкубации 20 qL реакции (2 зл 10x RT Buffer, 2 Зл амВ обратной транскриптазы, 1 ММ обратной грунтовки, 10 зЛ РНК, ингибитор RNase факультативно) при 42 градусах по Цельсию за 60 минут.
2. Усиль кДНК с помощью 20-25 циклов ПЦР, как описано в шаге 2.1.

6. Транскрипция и связывание белка

1. Повторите процесс синтеза РНК, связывания белка, разделения белкового связанного и несвязанной фракции, как описано в разделе 3-5 выше.

7. Анализ взаимодействий РНК-белка

1. Используйте ассс используйте асссид переноса подвижности геля (шаг 4.4) или переплет фильтра (шаг 4.3), чтобы определить связывающую близость и специфичность для выбранных пулов или отдельных последовательностей в каждом пуле (см. шаг 8.3).
2. Используйте авторадиографию или фосфорный образщик для обнаружения и количественной оценки полос в связанной фракции и несвязанной фракции.

8. Клонирование и секвенирование

1. Дайджест конечного продукта ПЦР ДНК с ограничения ферментов Bcl1 и HindIII для 1-2 ч, ligate с надлежащим образом переваренных pGEM3 или других плазмидов проведения места ограничения от 2 ч до ночи, превратить перевязочный продукт в бактериальных клеток тепловым шоком или электропорированием с использованием стандартных процедур молекулярной биологии¹³.
2. Выращивайте бактерии на ночь, нанося трансформированные клетки на агар-пластинах со средним и ампициллином (50 мкг/мл) при 37 градусах Цельсия. Выберите колонии, чтобы привить культуры труб, содержащих LB жидкой среде с ампициллин и расти при 37 градусов по Цельсию в трясущейся инкубатора в одночасье. Очистите плазмидные ДНК, содержащие днк-вставки с помощью стандартного протокола плазмидной изоляции¹³.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие комплекты доступны для плазмидной очистки.
3. Последовательность плазмиды с ДНК вставки с использованием протокола секвенирования цепи дидезации, следуя инструкциям производителя для секвенирования¹⁴.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование может быть выполнено в доме или сделано на коммерческой уровне.

9. Выравнивание последовательности

1. Выравнивание последовательностей и получение консенсусного обязательного сайта (ы) с использованием доступных инструментов выравнивания в Интернете
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

Результаты

Следующие наблюдения демонстрируют успешное селекционное усиление (SELEX). Во-первых, мы проанализировали пул 0 и выбранные последовательности для привязки к белку, используемому для итеративного подхода к отбору-усилификации. На рисунке 2 показано, что ?...

Обсуждение

Нуклеиновые кислотно-связывающие белки являются важными регуляторами развития животных и растений. Ключевым требованием для процедуры SELEX является разработка анализа, который может быть использован для разделения белковых и несвязанных рнковых фракций. В принципе, это анализ может б...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard