調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

要約

配列特異性は遺伝子調節に不可欠です。特定の配列を認識する調節タンパク質は、遺伝子調節にとって重要です。このようなタンパク質に対する機能的結合部位の定義は、困難な生物学的問題である。RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための反復的アプローチをここに説明し、すべてのRNA結合タンパク質に適用可能である。

要約

遺伝子調節はすべての細胞で重要な役割を果たしています。転写、転写後(またはRNA処理)、翻訳、および翻訳後のステップは、特定の遺伝子を調節するために使用されます。配列特異的な核酸結合タンパク質は、空間的または時間的遺伝子発現を制御する特定の配列を標的とする。核酸中の結合部位は、典型的には変異分析によって特徴付けられる。しかしながら、目的の多数のタンパク質は、そのような特徴付けのための既知の結合部位を有していない。ここでは、RNA結合タンパク質に対する未知の結合部位を同定するアプローチについて説明する。これは、ランダム化されたシーケンスプールから始まるシーケンスの反復的な選択と増幅を含みます。これらのステップ転写、結合、増幅のいくつかのラウンドに続いて、濃縮された配列は、好ましい結合部位を識別するために配列される。このアプローチの成功は、インビトロ結合アッセイを用いてモニターされる。続いて、インビトロおよびインビボ機能アッセイを用いて、選択した配列の生物学的関連性を評価することができる。このアプローチにより、タンパク質結合型および非結合RNAを分離するアッセイが存在するRNA結合タンパク質に対して、以前に未知の結合部位の同定と特徴付けが可能になります。

概要

細胞生物学では、遺伝子調節が中心的な役割を果たします。遺伝子発現経路に沿った1つまたは複数のステップで、遺伝子は調節される可能性を持つ。これらのステップには、転写(開始、伸び、終了)、スプライシング、ポリアデニル化または3'エンド形成、RNAエクスポート、mRNA翻訳、および一次転写の減衰/局在化が含まれます。これらのステップでは、核酸結合タンパク質は遺伝子調節を調節する。このようなタンパク質に対する結合部位の同定は、遺伝子制御を研究する上で重要な側面である。突然変異解析と系統配列比較は、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化元素、および翻訳シグナル1などの核酸における調節配列またはタンパク質結合部位を発見するために使用されてきた。^2,3,4.

プレmRNAスプライシングは、遺伝子発現および調節中に不可欠なステップです。ヒトの哺乳類遺伝子を含む哺乳類の遺伝子の大半は、イントロンを持っています。これらの転写物の大部分は、代わりにスプライスされ、同じ遺伝子または一次転写産物から複数のmRNAおよびタンパク質アイソフォームを産生する。これらのアイソフォームは、細胞生物学において細胞特異的および発達的役割を持つ。5'スプライス部位、分岐点、およびポリピリミジン管/3'スプライス部位は、規制の対象となる重要なスプライシング信号です。否定的な規制では、そうでなければ強いスプライス部位が抑圧され、正の調節では弱いスプライス部位が活性化される。これらのイベントの組み合わせは、機能的に異なるアイソフォームの多くを生成します。RNA結合タンパク質は、これらの代替スプライシングイベントにおいて重要な役割を果たします。

多数のタンパク質が知られており、その結合部位またはRNA標的は5、6を同定されたままである。調節タンパク質を下流の生物学的標的または配列にリンクすることは、多くの場合、複雑なプロセスです。このようなタンパク質の場合、標的RNAまたは結合部位の同定は、その生物学的機能を定義する上で重要なステップである。結合部位が同定されると、標準的な分子および生化学的分析を用いてさらに特徴付けることができる。

ここで説明する方法には、2 つの利点があります。まず、目的のタンパク質に対して未知の結合部位を同定することができる。第二に、このアプローチの付加的な利点は、同時に飽和変異を可能にし、それ以外の場合は結合部位内の配列要件に関する同等の情報を得るために労働集約的であろうということです。従って、RNAのタンパク質結合部位を同定するためのより速く、より簡単で、より低コストのツールを提供する。本来、このアプローチ(EXponential enrichmentによるリガンドのSELEXまたは系統的進化)は、独自のmRNAにおけるリボソーム結合部位と重複するバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ(遺伝子43タンパク質)の結合部位を特徴付けるために使用された。バインディング部位には 8 ベースのループ シーケンスが含まれており、分析⁷の 65,536 個のランダム化バリアントを表します。第二に、このアプローチはまた、異なる染料に対する特定の結合部位またはアプタマーが約10¹³配列8のプールから選択できることを示すために独立して使用された。実際、このアプローチは、タンパク質、小分子、細胞などの多数のリガンドを結合するためのアプタマー(RNAまたはDNA配列)を同定し、^触媒9のために多くの異なる文脈で広く使用されてきました。一例として、アプタマーは、カフェ^イン10中の1つのメチル基の存在によって異なる2つのキサンチン誘導体、カフェインおよびテオフィリンを区別することができる。我々は、このアプローチ(SELEXまたは反復選択増幅)を広く使用して、RNA結合タンパク質がスプライシングまたはスプライシング^調節11でどのように機能するかを研究しました。

ランダムライブラリ:我々は31ヌクレオチドのランダムライブラリを使用しました。ランダムライブラリの長さの考慮は、一般的なスプライシング係数U2AF⁶⁵が分岐点配列と3'スプライス部位の間のシーケンスに結合するという考えに大まかに基づいていました。平均して、メタゾンにおけるこれらのスプライシング信号間の間隔は、20〜40ヌクレオチドの範囲にある。別のタンパク質セックス致死性は、その標的前mRNA、変圧器の3'スプライス部位付近の不十分な特徴付け調節配列に結合することが知られていた。したがって、我々は31ヌクレオチドのランダム領域を選択し、制限酵素部位を有するプライマー結合部位によって横たわって、インビトロ転写のためのT7 RNAポリメラーゼプロモーターのPCR増幅および付着を可能にした。理論的なライブラリのサイズまたは複雑さは 4³¹または約 10¹⁸.このライブラリのほんの一部を使用して、以下に説明する実験のためにランダムRNAプール(~10 12-10¹⁵⁾を準備しました。

プロトコル

注:図 1は、反復選択増幅 (SELEX) プロセスの主要な手順の概要を示しています。

1. ランダムライブラリテンプレートの生成

1. DNAシンセサイザー上の化学合成により、前方プライマー5'-GTAATCAGGTCAGATCTGATCCA-3'と逆プライマー5'-GCGACGGATCCAAGCTTCA-3'を合成します。
   注:プライマーとランダムライブラリは、商業的に合成することができます。
2. ランダムライブラリオリゴヌクレオチドテンプレート5'- GGTGATGGATTGGCCA(N1...N₃₁₎化学合成によるTGAAGCTTGGGCGC-3'Nとして上に示した31の無作為化位置の合成中に4つのリンの混合物を使用してください。
   注:ライブラリテンプレートの配列には、31個のランダムヌクレオチド(N1~N31)と、前方プライマーとリバースプライマーの結合のためのフランク配列が含まれています。前方プライマーは、インビトロ転写のためのT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列(下線付き)およびクローニングのための制限部位Bcl1(斜体化)を含む。リバースプライマーには、クローニングを容易にする制限酵素部位BamH1およびHindIII(斜体化)が含まれています。

2. DNAランダムライブラリープールの生成

1. 1 μM DNAランダムライブラリーテンプレート、各プライマーの1 μM、20 mMトリス(pH 8.0)、1.5mM MgCl 2、50 mM KCl、0.1g/μLアセチル化ウシ血清アルバム、2単位を含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、T7 RNAポリメラーゼプロモーターをライブラリーに取り付けます。 /c1>ポリメラーゼ、および200 μMのdNTP(デオキシグアノシン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、およびデオキシチミジントリリン酸)。
2. PCRの5サイクルの脱退、焼成、および延長ステップ(1分間94°C、1分間53°C、1分間72°C)を使用し、その後に延長の1サイクル(10分間72°C)を使用します。

3. プール0 RNAの合成

1. 100 μL 転写^反応12を設定する。混合T7転写バッファー、1 μMランダムライブラリープールDNA、5 mMジチオスレイトール(DTT)、2mMグアノシン三リン酸(GTP)、1mM各アデノシン三リン酸(ATP)、シチジン三リン酸シチジン(CTP)、およびウリジントリリン酸(UTP)、および2単位/μRna7。
   注:RNAは、T7またはSP6 RNAポリメラーゼのオプションで市販のキットを使用してインビトロで転写することができます。
2. 上記の反応混合物をマイクロ遠心管で37°Cで2時間インキュベートする。
3. ゲルは10%の脱電性ポリアクリルアミドゲルでRNAを精製します。
4. 転写反応に放射能の痕跡(0.5 μL以下のα-32 P UTP)を含むことで、メチレンブルーまたは自動無線撮影で染色してゲル上の転写物の位置を特定します。
   1. 遠心分離管にゲルスライスを入れ、ホモジナイザー先端など、より小さな部分に分割します。プロテパナーゼK(PK)バッファー(100 mMトリス、pH 7.5、150 mM NaCl、12.5 mM EDTA、1%ドデシル硫酸ナトリウム)をゲル片に浸します。チューブを2時間から室温で一晩にしたままにしておきます。
5. 高温マイクロ遠心分離機(14,000 rpmまたは16,873 x g)で5分間、室温でスピンしてゲルの破片を除去し、バッファー溶液を回収します。
6. 渦は、フェノールクロロホルムの等しい体積で2回、クロロホルムで1回ずつ試料を渦。
7. 上から水相をアセテートナトリウムの10分の1(3.0M、pH 5.2)、tRNAの10μgまたは20μgのグリコーゲン、エタノール(-2~3体、-20°Cで保存)と混合します。チューブは-80 °Cで1時間放置します。
8. マイクロ遠心分離機(14,000 rpmまたは16,873 x g)で4°Cで5〜10分間溶液を含むチューブを回転させます。上清は慎重に捨てます。70%のエタノールでRNAペレットをすすいで、2~5分間スピンします。空気はRNAペレットを乾燥させます。
9. ジエチルパイロカーボネート(DEPC)で処理した水の50μLでRNAペレットを可溶化します。保存のために-20 °Cでサンプルを残します。
   注:市販のスピンカラムを使用してRNAを浄化し、現在より一般的に非組み込みの放射能を除去し、RNA精製のための迅速かつ便利な代替手段として使用されています。
   注意:アクリルガラスシールド、手袋、その他の予防措置を使用して、放射能から保護してください。

4. 結合性反応と結合RNAの分離

1. これらの最終濃度に以下の成分を加えることによって10mMトリス-HCl、pH 7.5の体積でタンパク質とRNAの結合を行う:50 mM KCl、1 mM DTT、0.09 μg/μLウシ血清アルブミン、0.5単位/μL RNasin、0.15 μg/μg/rna、1 mM EDTA、および適切な組換えタンパク質(PTB)濃度の30 μL。適切なプールから RNA を追加します。
   注:スプライシング係数U2AF⁶⁵は、通常、約1〜10 nMの結合親和性(平衡解離定数またはKd)を有するモデルイントロンのポリピリミジン管/3'スプライス部位に結合する。したがって、結合の最初の2ラウンドは、U2AF⁶⁵のK _dの上に10倍のタンパク質濃度を使用した。SXLおよびPTBタンパク質の場合、この範囲の開始濃度は私たちの最良の推測に過ぎませんでした。これにより、より低い親和性配列も結合する可能性はあるが、結合し得る所望のRNA種が保証された。ラウンド3および4(転写、結合、増幅)では、タンパク質濃度が3倍に減少しました(ステップ4.1)。これは、低親和性RNA種を連続的に排除するために行われた。
2. 結合反応を含むチューブを温度ブロック(または氷上)に25°Cで約30分間置きます。
3. 次のステップを使用して、選択増幅の最初の4ラウンドについて、非結合RNAから結合したRNAを分画します。
   1. 真空マニホールドに取り付けられたニトロセルロースフィルターを通して、サンプル(100μL)を室温で濾過します。
      注: 非結合RNAではなく、RNAタンパク質複合体は、フィルタ上に残ります。
   2. 保存されたRNAでフィルターを無菌かみそり刃で断片に切り刻みます。遠心管に挿入します。プロテパナーゼK(PK)バッファーに浸漬されたフィルター片で、チューブを少なくとも3時間(または一晩)ゆっくりとタンブリングしてRNAを回収します。
   3. フェノールクロロホルム(1:1)とクロロホルムの等しい量の存在下でそれを渦下することによってRNAサンプルを脱タンパク化します。室温で5分間高速でサンプルを遠心分離することにより、毎回水相を回収します。
   4. 酢酸ナトリウム(0.1体3.0M、pH5.2)とエタノール(絶対エタノールの2~3体、200証拠)と混ぜます。チューブを-80°Cの冷凍庫に30分間放置し、10分間高速で遠心分離し、洗浄および乾燥工程(ステップ3.8)に従い、DEPCで処理した水中でRNAを可溶化します。これらの手順の概要は上記です (手順 3.6 ~ 3.9)。
4. タンパク質結合RNA分画を、最後の2ラウンド(ラウンド5および6;転写、結合、増幅)の非結合画分から分離します。結合反応におけるタンパク質濃度をさらに3倍に減らし、高親和性結合配列を濃縮し、低親和性配列を優先的に除去する追加の選択圧力を行う。
   1. 上記のRNA:タンパク質結合(ステップ4.1)反応を設定する前に、0.5x TBEバッファー(トリスボレート-EDTA)で天然ポリアクリルアミドゲル(5%、60:1アクリルアミド比:ビスアクリルアミド比)を事前キャストします。このゲルを冷たい部屋(4°C)で15分間250Vを塗布して電気フォラーゼする。
   2. 上記のRNA:タンパク質結合反応(ステップ4.1)をこのゲルの異なるウェルにピペットする。
      注:タンパク質は-80°Cで保存され、20 mM 4-(2-ヒドロキセチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)、pH 8.0、および使用前に希釈されます。 20% グリセロール, 0.2 mM エチレンディアミンテトラセチン酸 (EDTA), 0.05% NP-40, および 1 mM ジチオスレイトール (DTT).0.5〜1.0 mMプロテアーゼ阻害剤フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)の添加は任意である。結合反応では、このバッファーは約6%のグリセロールに寄与し、別のゲルローディングバッファーと混合することなく、サンプルをウェルに直接ロードすることができます。
   3. 1~2時間250Vのコールドルーム(4°C)でゲル電気泳動を用いて結合したRNAから結合したRNAを分画します。このプロセスは、ゲルモビリティシフトアッセイとしても知られています。
      注:電気泳動の持続時間は、結合に使用されるRNAおよびタンパク質の特徴によって異なる。
   4. ゲルをX線フィルムに露出させ、自動無線撮影を用いて結合したRNAの位置を特定する。結合したRNAでゲルスライスを切り取り、チューブに挿入します。
   5. 溶出に使用するPKバッファーで破砕されたゲルスライスを3時間または一晩インキュベートします。
   6. 上記の手順 3.5 から 3.9 を繰り返します。簡単に言えば、最初にフェノールクロロホルムで、次にクロロホルムで激しくEL化したRNAサンプルを渦。
   7. クロロホルム抽出後の水相と酢酸ナトリウムとエタノールを混合します。-80 °C冷凍庫でのインキュベーションに続いて、4°Cで5〜10分間回転させてRNAペレットを回収します。RNAペレットをエタノールで洗浄し、チューブの蓋を開けたままにして空気乾燥させます。DEPCで処理した水中でRNAを溶解する。
      注:分画のためのゲルモビリティシフトアッセイに切り替えることで、例えば、分画の最初のラウンドで使用されるニトロセルロースフィルター(または任意のマトリックス)への結合のために濃縮された可能性のある不要なRNA種の除去が可能になります。

5. 逆転写とPCR増幅

1. 20 μL反応(10x RTバッファーの2μL、AMV逆転写酵素の2μL、1μMリバースプライマー、1μLの逆プライマー、10μLのRNA、RNase阻害剤任意)を60分間42°Cでインキュベートすることにより、逆写酵素と逆プライマーを用いて溶解したRNAからcDNAを合成する。
2. ステップ 2.1 で説明するように、20 ~ 25 個の PCR サイクルを使用して cDNA を増幅します。

6. 転写とタンパク質結合

1. RNA合成のプロセスを繰り返し、タンパク質結合、タンパク質結合および非結合画分の分離を繰り返し、上記のセクション3-5に記載されている。

7. RNAタンパク質相互作用の解析

1. ゲルモビリティシフトアッセイ(ステップ4.4)またはフィルタ結合アッセイ(ステップ4.3)を使用して、各プール内の選択したプールまたは個々のシーケンスに対する結合親和性と特異性を決定します(ステップ8.3参照)。
2. 自動無線撮影または蛍光体イメージャーを使用して、バインドされた画分と非結合画分のバンドを検出して定量します。

8. クローン作成とシーケンス

1. 制限酵素Bcl1およびHindIIIを用いた最終PCRDNA産物を1~2時間消化し、制限部位を2時間から一晩に運ぶ適切に消化されたpGEM3または他のプラスミドでリゲートし、ライゲーション産物を有能な細菌細胞に変換する標準的な分子生物学手順を用いてヒートショックまたはエレクトロポレーション^{によって 13}.
2. ルリア・ベルタニ(LB)培地とアンピシリン(50μg/mL)を37°Cで寒天プレート上にめっきして一晩細菌を増殖させます。アンピシリンでLB液体培地を含む培養チューブを接種し、一晩振るインキュベーターで37°Cで成長するコロニーを選びます。標準プラスミド絶縁^{プロトコル13}を用いてDNAインサートを含むプラスミドDNAを精製する。
   注:市販のキットはプラスミド精製のために利用できる。
3. ジデオキシ鎖終端シーケンシングプロトコルを使用してDNAインサートを用いてプラスミドを配列し、シーケン^シング14の製造業者の指示に従う。
   注:シーケンシングは、社内で行うことができるか、商業的に行うことができます。

9. シーケンスの位置合わせ

1. 利用可能なオンラインアライメントツールを使用して、シーケンスを調整し、コンセンサスバインディングサイトを取得する
   (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)。

結果

以下の観察は、選択増幅(SELEX)の成功を示しています。まず、プール0と選択した配列を分析し、反復選択増幅アプローチに使用するタンパク質に結合する。図2は、哺乳動物ポリピリミジン管結合タンパク質(PTB)が、選択された配列プールに対してプール0配列に対してほとんど検出可能であるが、高い親和性を示すことを示す。選択したプールに?...

ディスカッション

核酸結合タンパク質は、動物および植物の発達の重要な調節剤である。SELEX手順の重要な要件は、タンパク質結合および非結合RNA画分分を分離するために使用できるアッセイの開発です。原理的には、このアッセイは、フィルタ結合アッセイ、ゲル移動シフトアッセイ、または組換えタンパク質、精製タンパク質、またはタンパク質複合体に対するマトリックス結合アッ^セイ19

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard